脆性X綜合征的基因診斷與產(chǎn)前診斷

1、遺 傳 her edi ta s ( beijing) 25 (2) :123128 ,2003研究報告脆性 x 綜合征的基因診斷與產(chǎn)前診斷鄔玲仟1 ,2 ,潘乾1 ,龍志高1 ,朱俊真3 ,戴和平1 ,鄭多1 ,夏昆1 ,黃幸青2 ,夏家輝1(1 . 中南大學醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室 ,長沙 410078 ;2 . 廣東省粵北人民醫(yī)院 ,韶關(guān) 512026 ;3 . 河北省人民醫(yī)院 ,石家莊 050051 )摘 要 :為了探討簡便 、快速 、準確 、價廉的脆性 x 綜合征的診斷方法 ,對 6 個智能低下家系進行了細胞遺傳學 檢查 ,以及 pcr 直接擴增 fm r1 5端 (cgg) n 重

2、復序列 、r t - pcr 擴增 fm r1 基因的 cdna 序列的分子遺傳 學檢查 。a 家系先證者脆性 x 染色體高表達 (35273) ,分子遺傳學檢查證實為脆性 x 綜合征全突變患者 ;b 家 系先證者及其母親無脆性 x 染色體表達 ,分子遺傳學檢查證實為非脆性 x 綜合征患者 ; c 家系的男性胎兒脆 性 x 染色體表達 (593) ,先證者及其母親未發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 ,分子遺傳學檢查證實男性胎兒為脆性 x 綜合 征全突變患者 ,其母親為前突變攜帶者 ,哥哥為嵌合體患者 ;d 家系先證者脆性 x 染色體高表達 17 % ,其姐姐 脆性 x 染色體 5 % ,分子遺傳學檢查證實

3、先證者為脆性 x 綜合征全突變患者 ,其姐姐為嵌合體患者 ; e 家系先 證者及其母親 , f 家系先證者發(fā)現(xiàn)可疑脆性 x 染色體 ,分子遺傳學檢查證實為非脆性 x 綜合征家系 。結(jié)論 : pcr 直接擴增 fm r 1 基因 ( cgg) n 重復序列聯(lián)合 rt - pcr 擴增 fm r1 基因 cdna 序列簡便 、快速 、價廉 。 可用于脆性 x 綜合征的篩查 、診斷及產(chǎn)前診斷 ,有推廣應(yīng)用價值 。關(guān)鍵詞 :脆性 x 綜合征 ; fm r1 基因 ; pcr ; rt - pcr ;基因診斷 ;產(chǎn)前診斷中圖分類號 : r394文獻標識碼 :a文章編號 :0253 - 9772 (200

4、3) 02 - 0123 - 06genetic diagnosis and prenatal genetic diagnosis of fragile x syndromewu ling2qian1 ,2 , pan qian1 ,lon g zhi2gao1 ,zhu j un2zhen3 ,dai he2ping1 ,zhen g duo1 ,xia kuen1 , huan g xing2qing2 ,xia jia2hui1(1 . national l aboratory of medical genetics , cent ralsouth u niversity , chang

5、sha 410078 , china ;2 . y ue bei peoples hospital , guangdong ,512026 , china ;3. peoples hospital , hebei 050051 , china)abstract : in order to obtain a simple ,fast ,accurate and low - cost diagnosis method of fragile x syndrome ,cytogenet2 ic tests and molecular genetic tests were carried out wit

6、h direct amplification of (cgg) n repeat sequence in 5termi2nal of fm r 1 gene by pcr and the cdna sequence of fm r 1 by rt - pcr from six mental retardation pedigrees. the proband of pedigree a with highexpression of fragile x chromosome(35273) was detected to be a full mutation patient of fragile

7、x syndrome by the molecular genetic test . there is no expression of fragile x chromosome in the proband and his mother of pedigree b ,which was futher confirmed as a non - fragile x pedigree by the molecular ge2 netic test . a male foetus of the pedigree c has fragile x chromosome(593) ,but the pro

8、band and his mother has nofragile x chromosome. by further detection using molecular genetic test ,the male foetus is a full mutation patient of fragile x syndrome ,his mother is a permutated carrier ,and his brother is a mosaic patient. the proband of pedigree d has high expression of fragile x chr

9、omosome(17 %) ,his sister also has expression of fragile x chromosome(5 %) . by further detection with molecular genetic test ,the proband is a full mutation patient of fragile x syndrome ,and his sis2ter is a mosaic patient. the probands of pedigrees e and f of the mother were found with suspicions

10、 fragile x chro2mosome , being confirmed as the non - fragile x pedigrees by the molecular genetic test . the conclusion is that收稿日期 :2002 - 05 - 27 ;修回日期 :2002 - 10 - 15基金項目 :973 項目基金( g1998051002) 、廣東省衛(wèi)生系統(tǒng)“五個一科教興醫(yī)工程”項目 ( t9604) 資助作者簡介 :鄔玲仟(1962 - ) ,女 ,碩士 ,副主任醫(yī)師 ,專業(yè)方向 :醫(yī)學遺傳學。tel :0731 - 4472093 ,

11、e2mail :wulinqian 163 . net124遺 傳 her edi ta s ( beijing) 200325 卷the analysis test with direct amplification of 52( cgg) n repeat sequence and cdna sequence in fm r1 gene is simple , fast ,low - cost and can be applied in screening ,diagnosis and prenatal diagnosis of fragile x syndrome.key words :

12、fragile x syndrome ; fm r 1 gene ; pcr ; rt - pcr ; genetic diagnosis ; prenatal diagnosis脆性 x 綜合征 (m im :309550) 是一種發(fā)病率僅 次于先天愚型的遺傳性智能低下綜合征 ,發(fā)病率占 全部兒童的 0. 05 % ,呈 x 連鎖遺傳 ,占 x 連鎖智能 低下的 40 % 1 。其外顯率因性別不同有差異 ,男性 80 % ,女性 30 %。95 %以上的脆性 x 綜合征患者發(fā) 病的分子遺傳學基礎(chǔ)是 fm r 1 基因 ( cgg) n 結(jié)構(gòu)擴 展的動態(tài)突變引起的 ,約 5 %以下則是由于 f

13、m r 1 基因的錯義突變和缺失型突變影響了 fmrp 的正 常結(jié)構(gòu)導致的 24 。fmr1 基因位于染色體 xq27. 3 ,在基因組序列約 38kb ,由 17 個外顯子和 16 個內(nèi)含子組成 ,編碼脆性 x 智能低下基因蛋白(fmrp) 5 ,6 。 fmr1 基因是一個高 度保守的基因 ,其 5端外顯子上的非翻譯區(qū)有一個 (cgg) n 三核苷酸串聯(lián)重復序列 ,(cgg) n 在重復片段長 度和 agg嵌入模式上都存在多態(tài)性 ,并且可以遺傳 , 在其上游大約 250bp 處有一個 cp g島。正常 fmr1 基 因(cgg) n 中 n 介于 760 之間。當 n 擴展到 60200

14、時 ,攜帶者雖表型正常 ,但在傳代過程中易發(fā)生進一步 擴展 ,稱 fmr1 基因的前突變。前突變 cp g島一般不甲基化 , fmr1 基因具有相對正常的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水 平 ,不表現(xiàn)出臨床癥狀。當 n 擴展達 200 以上時 ,男性 100 %表現(xiàn)為典型的脆性 x 綜合征 ,女性也有 30 %50 %表現(xiàn)輕重程度不等的智能低下。這種 fmr1 基因 的突變稱全突變 ,前突變至全突變的擴展是嚴格母系 的 ,全突變(cgg) n 重復序列大量擴展 ,引起 fmr1 5 (cgg) n 側(cè) cp g島異常甲基化 ,使 fmr1 基因失活 ,導 致 fmrp 的缺失引起智能低下7 。脆性 x 綜合征發(fā)

15、病率高 ,臨床表現(xiàn)復雜 ,遺傳 規(guī)律獨特 ,目前無有效的治療方法 , 要降低其發(fā)病 率 ,關(guān)鍵是查出攜帶者及病人 ,然后通過遺傳咨詢 、 產(chǎn)前診斷 、阻止患兒出生 。本文采用 pcr 與 rt - pcr 相結(jié)合的方法 ,探討簡便 、快速 、準確 、價廉的 脆性 x 綜合征基因診斷與產(chǎn)前診斷方法 。1材 料 與 方 法1. 1材料6 個智能低下家系 17 個成員的外周血 (肝素抗 凝) 或淋巴細胞株 。家系見圖 1 。圖 1 6 個智能低下家系fig. 1 six mental retardation pedigrees2 期鄔玲仟等 :脆性 x 綜合征的基因診斷與產(chǎn)前診斷1251. 1. 2

16、生化試劑總 rna 提取 trizol 試劑盒購自 gibcobrl表 1 引物序列及產(chǎn)物長度table 1 primer sequence and length of amplicons公司 , reverse transiption system kit 購自 promega引物名稱引物序列產(chǎn)物長度( bp)公司 。1. 2實驗方法1. 2. 1細胞遺傳學分析 按文獻 12 的方法完成 。1. 2. 2胎兒性別鑒定及臍血排除母血污染的鑒定 以 cb0049 臍血 gdna 為模板 ,進行 s r y 基因pcr 擴增 ; 應(yīng)用 x 染色體 dmd 基因內(nèi)部 3ca 、 44ca 、45ca

17、 、49ca 、50ca 、5 對 ca 重復序列對 c 家 系進行連鎖分析 。1. 2. 3pcr 擴增 fm r 1 基因 (cgg) n 重復序列 酚氯仿法提取 gdna 。根據(jù) fu 等在 fmr1 的(cgg) n 兩側(cè)設(shè)計 1 對引物 ( fmr 1 - 1fmr 1 - 2) ,進行 pcr 擴增 ,擴增片段長度 308bp (29cgg) 79 。pcr 反應(yīng)總體積為 20l ,包括 gdna 2l ( 100ng p ri mer p ri mer sequence amplico n ( bp ) fnet15 cttgcctcgagatttcatgaacag3206fne

18、t25 tcagcaaattcgagaaagcttc3fnet35 gatgggtctagctattgg3137fnet45 cttttttcactgcatcctg3fcon15 agggtgtttattcctcatgg3445fcon25 caaatccaacaaagtctggc3fcon35 aattatggacaggactgaacgtc3387 fco n4 5 cgt ggggtcct t t tcaccagcaag 3 用 reverse transcription system ( promega cat# a 3500) 將 rna 轉(zhuǎn)錄成 cdna 。巢式 pcr 第一 輪使用

19、引物 fnet1 、f net2 、fcon1 和 fcon2 。第二輪使 用引物 fent3 、f net4 、fcon3 和 fcon4 。pcr 反應(yīng)總體 積為 20l ,包括 cdna 1l (100ngl ) ,f net 引物各 0. 6l (100ngl ) ,fcon 引物各 0. 4l ( 100ngl ) ,2 +l) ,引物 fmr 1 - 1 、fmr 1 - 2 各 0. 6l (100ng10 pcr 緩沖液 mgfree 2l (100mmoll tris -2 +l) ,10 pcr 緩沖液 2l ( 100mmoll tris - hclhcl p h8. 3

20、 ,500mmoll kcl) ,mg1. 2l (25mmolp h813 , 500nmoll kcl , 15mmoll mgcl2 ) , dn tp 016l ( 每種 10mmoll ) 和 dmso 2l 。前突變和 全突變的擴增 d gtp 改用 d gtp : 7 - deaza - d gtp= 13 。反應(yīng)條件 : 擴增正常的等位基因 98 變 性 10min 后加 taq 酶 0. 2l ( 5ul ) , 然后 ( 97 30s ;65 30s ;68 30s) 擴增 30 個循環(huán) ,最后在 72 延伸 10min。 擴增前突變和全突變等位基因 98 變性 10min

21、 后加 taq 酶 0. 2l (5ul ) ,然后 (97 30s ; 65 45s ; 68 4min) 擴增 10 個循環(huán) , 接下來 (97 30s ; 65 45s ; 68 4min20s) 擴增 20 個循環(huán) , 最后在 72 延伸 10min。pcr 擴增所用 taq 酶購 自 takara 公司 。反應(yīng)是在 perkin elmer 9600 pcr 儀 。pcr 產(chǎn)物用 6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳 ,銀染檢 測 。如有非特異性條帶則用 8 %變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳 ,以消除構(gòu)象帶 。1. 2. 4 rt - pcr 擴增 fm r 1 基因 cdna 序列用 trizol

22、提取血細胞總 rna 。根據(jù) verkerk 等報道的 fm r 1 基因 cdna 序列 13 ,并參照 pai 的 報道 10 , 設(shè)計合成了 2 對引物 fnet1 、f net2 、f net3 、 fnet4 。序列見表 2 。根據(jù) gibbs 等的報道合成了 2 對引物作為內(nèi)對照 11 ,用來檢測位于 x 染色體上的 hpr t 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 ,命名為 fcon1 、fcon2 、fcon3 、 fcon4 。其序列見表 1 。l) , dn tp 0. 6l (每種 10mmoll ) , taq 酶 0. 2l(5ul ) 。反應(yīng)條件 : 94 變性 10min , 然后 (

23、 94 30s ;58 20s ;72 30s) 擴增 20 個循環(huán) ,最后在 72 延伸 10min。pcr 擴增在 pe 9600 型 pcr 儀上 ,二 輪 pcr 條件一樣 。pcr 產(chǎn)物用 6 %聚丙烯酰胺凝 膠電泳 ,銀染檢測 。2 結(jié) 果2. 1 細胞遺傳學結(jié)果2. 1. 1 a 家系先證者 (b2260) ,脆性 x 染色體檢出率 35273 ,診斷為脆性 x 綜合征患者 。2. 1. 2 b 家系先證者 (b7042) 及其母親 (b7043) 均未發(fā)現(xiàn)脆 性 x 染色體 ,診斷為非脆性 x 綜合征患者 。2. 1. 3 c 家系胎兒臍血擴增出 s r y 基因 ; 連鎖分析

24、胎兒臍 血無母血污染 ; 先證者 ( m3045) 及其母親 ( m3016) 未發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 ,男性胎兒 (cb0049) 脆性 x 染 色體檢出率 593 ,可疑為脆性 x 綜合征家系 。2. 1. 4 d 家系先證者 (b7054) 脆性 x 染色體檢出率 17 % ;其 姐姐 (b7055) 脆性 x 染色體檢出率 5 % ,診斷為脆性126遺 傳 her edi ta s ( beijing) 200325 卷x 綜合征家系 。2. 1. 5e 家系先證者 ( m2999) 發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 2 % ,母親 (m2998) 發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 4 % ,診斷為脆性 x

25、綜 合征家系 。2. 1. 6f 家系先證者 ( m3003) 發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 3 % ,母親 未發(fā)現(xiàn)脆性 x 染色體 ,父親 ( m3001) 發(fā)現(xiàn)脆性 x 染 色體 1 % ,可疑為脆性 x 綜合征家系 。2. 2分子遺傳學檢測及診斷結(jié)果pcr 直接擴增 fm r 1 基因 ( cgg) n 重復序列 與 rt - pcr 擴增 fm r 1 基因 cdna 序列聯(lián)應(yīng)用 , 對 6 個智能低下家系進行分析 , b 、c 家系 pcr 擴 增 fm r 1 基因的結(jié)果見圖 2 ; a 、c 、d 家系 rt - pcr 擴增 fm r 1 基因 cdna 的結(jié)果見圖 3 ;分子遺 傳學

26、檢測及診斷結(jié)果見表 2 。圖 3 a、c、d 家系 rt- pcr擴增 fmr1 基因 cdna的結(jié)果1. cb0049 (c 家系胎兒) ;2. m3045 (c 家系先證者) ;3. 空白對照 ;4 . m3016 ( c 家系母親) ;5 . m3017 ( c 家系父親) ;6 . b7054 (d 家系先證者) ;7 . b7055 (d 家系先證者的姐姐) ;8 . b2260 (a 家系先證者) ;9 . 正常男性 ;10 . marker 。fig. 3 rt- pcranalysis of fmr1 cdna in a、c、d pedigrees1. cb0049 (foet

27、us of pedigree c) ;2. m3045 (proband of pedigree c) ; 3 . blank ;4 . m3016 ( mother of proband ,pedigree c) ;5 . m3017 (father of proband ,pedigree c) ; 6 . b7054 (proband of pedigree d) ;7 . b7055 ( sister of proband ,pedigree d) ; 8 . b2260 (proband of pedigree a) ;9 . normal men ;10 .x174( digest

28、ed by hac ii) marker.表 2 6 個智能低下家系的分子 遺傳學檢測及診斷結(jié)果table 2 molecular genetics tests and diagnosis from six mental retardation pedigrees圖 2 b、c 家系 pcr擴增 fm r1 基因的結(jié)果1 . marker ;2 . b7042 (b 家系先證者) ;3 . b7043 (b 家系母親) ;4 . 空白 ;5 . m3016 ( c 家系母親) ;6 . m3017 ( c 家系父親) ;7 . m3045 ( c 家系先證者) ;8 . cb0049 ( c

29、家系胎兒) 。 fig. 2 pcr amplification of fmr1 gene in b、c pedigrees 1 .x174( digested by hac iii) marker ;2 . b7042 (proband ofpedigree b) ;3 . b7043 ( mother of proband ,pedigree b) ; 4 . blank ;5 . m3016 ( mother of proband ,pedigree c) ;6 . m3017 (father of proband ,pedigree c) ; 7 . m3045 (proband of

30、 pedigree c) ;8 . cb0049 (foetus of pedigree c) .3討論細胞遺傳學的脆性部位 fraxa ( xq27. 3 ) 是fm r 1 基因突變的一個直接的細胞學標記 , 是與家系 編號 性別 gdna 產(chǎn)物 cdna 產(chǎn)物 分子遺傳學診斷 a b2260 男 無無 男性全突變患者 b b7042 男 有 1 條正常帶(308bp) 有 非脆性 x 綜合征 b7043 女 有 1 條正常帶 ( 308bp ) 有 家系 c m3017 男 有 1 條正常帶(302bp)有 正常男性m3016 女 有 1 條正常帶(302bp) ,有 女性前突變攜帶者

31、一條前突變帶(500 + bp)m3045 男 無有 男性嵌合體患者 cb0049 男胎 無無 男性全突變患者 d b7055 女 無有 女性嵌合體患者 b7054 男 無無 男性全突變患者 e m2997 男 有 1 條正常帶(308bp)有 非脆性 x 綜合征m2998 女 有 1 條正常帶(308bp)有 家系m2999 男 有 1 條正常帶(308bp)有 m3000 男 有 1 條正常帶 ( 299bp )有 f m3001 男 有 1 條正常帶(299bp)有 非脆性 x 綜合征m3002 女 有 1 條正常帶(308bp)有 家系m3003 女 有 2 條正常帶有(308bp29

32、9bp)ncgg重復相一致的 13 ,這是因為 ( cgg)大量擴展 m3004 男 有 1 條正常帶 ( 308bp ) 有 和甲基化干預了 dna 的復制和染色質(zhì)縮合 ,但是 脆性 x 染色體并不是在所有的中期細胞中都能檢 測到 ,其表達范圍低的不到 1 % ,高的可達 80 % 14 。 且 fraxa 附 近 存 在 多 個 脆 性 位 點 fraxe( xq28) 、fraxf ( xq末端) 、fraxd ( xq27 . 2) 、還有 xq26 ,以上這些脆性位點對于細胞遺傳學工作 者 ,尤其是經(jīng)驗不足者 ,有時是很難區(qū)分的 。本研究 結(jié)果表明 ,細胞遺傳學檢查只能對有明顯脆性

33、x 綜 合征臨床表現(xiàn) ,又有脆性 x 染色體高表達的病人做2 期鄔玲仟等 :脆性 x 綜合征的基因診斷與產(chǎn)前診斷127出診斷 。對脆性 x 染色體低表達的病人及攜帶者 (如 c 、e 、f 家系) 的診斷有明顯的假陽性和假陰性 , 單獨用于脆性 x 綜合征的診斷易造成誤診和漏 診 。還比較了擴增正常等位基因時 ,應(yīng)用與不應(yīng)用 7 - deaza - d gtp pcr 效率無區(qū)別 ,應(yīng)用與不應(yīng)用遞降 pcr ,擴增效率也無區(qū)別 ,關(guān)鍵是要有一個高的變性 溫度和熱啟動 pcr。擴增效率與引物有關(guān) , 遠離1991 年 verkerk 等 15 在 xq27. 3 附近發(fā)現(xiàn)了脆(cgg) n重復部

34、位的長引物擴增效率高 。但是擴增性 x 智能低下基因 ( fm r 1) ,使脆性 x 綜合征的診 斷可 以 通 過 dna 進 行 分 析 。分 子 診 斷 一 直 以 sout hern 印跡雜交為主 , 目前認為用較遠側(cè)探針 ( stb12. 3) 對雙酶解 (如 ecor ieag i) dna 樣本進 行雜交 ,可檢出全部前突變和全突變等位基因 ,同時 可了解 cp g 島甲基化狀態(tài) ,是最可靠的診斷方法 。 然而這個技術(shù)是很繁瑣 、費時 、昂貴 ,需要大量 gd2 na ,對于前突變的檢測不準確 ,檢測甲基化時 ,要求 等位基因被甲基化比例高于一定值才能被靈敏檢 測 ,而且要求甲基

35、化 cp g 島包含在限制性內(nèi)切酶的 識別序列之內(nèi) 。操作時必須注意酶解完全 ,酶解不 完全時 ,產(chǎn)生的雜交帶可導致錯誤的診斷 。該方法 有大約 5 %的誤診率 ,既有假陽性 ,更常見有假陰性 結(jié)果 16 。近年來 ,發(fā)展了 pcr 序列特異性寡核苷酸探針 雜交 ( sequence specific oligonucleotide probe hybrid2 ization ,ssoph) 技術(shù) ,即用 pcr 直接擴增 ( cgg) 重 復系列 ,凝膠分離后轉(zhuǎn)移至膜上 ,用放射性或非放射 性標記的 (cgg) 5 寡核苷酸探針雜交放射自顯影或 化學螢光顯影暴光 x 光片 。但此技術(shù)操作繁瑣

36、 ,費 用大 ,擴增 (cgg) 高拷貝的前突變及全突變存在擴 增抵抗 17 。應(yīng)用 pcr 擴增 ( cgg) n 重復序列 ,根據(jù)擴增片 段的長度直接檢測 cgg 的拷貝數(shù) ,進行基因診斷 。 但擴增的部分 cg 含量極高 ,在前突變和全突變 cg 含量更高 ,且患者 (cgg) n 重復序列過長 ,易形成穩(wěn) 定的二級結(jié)構(gòu) , pcr 擴增時變性不完全 ,擴增效率 低 ,cg 重 復 次 數(shù) 較 多 的 片 段 一 般 pcr 很 難 擴 出 18 。我們使用高變性溫度 (98 10min) 使模板充 分解鏈 ,接下來通過熱啟動程序 ,提高 taq 酶的活 性 ,用遞降 pcr (touc

37、h down pcr) 來提高 pcr 擴 增的特異性 , pcr 反應(yīng)體系中加入 10 %dmso 有利 于模 板 的 解 鏈 。以 7 - deaza - d gtp 代 替 部 分 d gtp(前者與后者比為 31) ,使 cg 之間形成兩個 氫鍵 ,以降低 tm 值 。通過以上的方法 ,擴增正常等 位基因能達到高 pcr 產(chǎn)量 ,且重復性好 。同時也擴 增出了一個 cgg 重復拷貝 90 左右的前突變 ,我們(cgg) 高拷貝的前突變及全突變?nèi)源嬖跀U增抵抗 。rt - pcr ,從 rna 角度檢測脆性 x 綜合征患 者 。piaretti 等 19 報道絕大多數(shù)脆性 x 綜合征男性

38、患者無 fm r 1 基因表達 , 而女性患者的 fm r 1 基 因是雜合的 , fm r 1 基因表達有某些程度的降低 , 但總能檢測到 fm r 1 基因的表達 ,所以 rt - pcr 在男性患者及因非動態(tài)突變?nèi)笔腿狈?fmrp 的 個體是檢測不到 cdna 產(chǎn)物的 ,女性患者可檢測到 產(chǎn)物 。那些少數(shù)由非甲基化傳遞的前突變與甲基化 全突變細胞構(gòu)成的嵌合體患者及極少數(shù)由于點突變 造成的患者也能檢測到 fm r 1 基因的表達 。我們 采用套式 pcr 提高檢出敏感性 ,同時還對每次 pcr 做一空白對照 ,并引入內(nèi)對照引物 ,確保了結(jié)果的可 靠性 。本研究將 pcr 直接擴增 fm

39、r 1 基因 ( cgg) n 重復序列與 rt - pcr 擴增 fm r 1 基因 cdna 序 列聯(lián)合應(yīng)用 ,對 6 個智能低下家系進行了基因診斷 , 整個實驗在采集樣本后 24h 內(nèi)完成 ,對于實驗來說 , 納克 (10 - 9 克) 數(shù)量級的 dnarna 是非常充足的 , 產(chǎn)前樣本也可直接進行研究 ,兩種方法相互印證 ,互 相補充 ,克服了單獨應(yīng)用 pcr 或 rt - pcr 的局限 性 ,較經(jīng)典的 sout hern 印跡雜交精確 ,價廉 ,快速 , 實驗簡便 ,可用于 : 育齡婦女 (準備懷孕或已妊娠 的婦女) 脆性 x 攜帶者的檢測 ,可縮小進一步檢測 的范圍 ; 新生兒篩

40、查 ,有助于脆性 x 綜合征家系 的發(fā)現(xiàn) ,預防家系中其他患者的出生 。 所有尚未 確診病因的發(fā)育殘疾兒可通過上述方法篩查 ,如發(fā) 現(xiàn)陽性 ,通過遺傳咨詢 ,使他們的親屬得到幫助 。 可作為脆性 x 綜合征的常規(guī)診斷 。對于有一條正 常等位基因表型正常的女性 ,可能是正常純合子 ,也 可能 是 前 突 變 或 全 突 變 攜 帶 者 , 應(yīng) 該 進 一 步 做 sout hern 印跡雜交分析 。對于有一條正常等位基因 的女性患者 ,也應(yīng)該進一步做 sout hern 印跡雜交分 析 。參 考 文 獻 ( references) : 1 warren s t ,askley c t j r.

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