分子生物學(xué)實驗操作方法與技巧（1）

1、. 分子生物學(xué)與生物化學(xué)實驗分子生物學(xué)與生物化學(xué)實驗 操作、設(shè)計與技能操作、設(shè)計與技能 李剛 副教授 “成功的實驗都是一樣的，失敗的 實驗各有各的不幸?！?. 個人聯(lián)系方式 辦公室：生命科學(xué)院北院308室 郵箱： 電話研究方向：分子酶學(xué)與酶工程，目前主要致 力于可用于生物能源和污水處理的木質(zhì)素降 解酶系基因的克隆、分子改造和異源表達。 . 本課程的特色 1、本門課專注于分子生物學(xué)基本操作方法 的操作技巧研究，力求提供最簡單、最快 速、最可靠的分子生物學(xué)操作方法； 2、完全公開，沒有校內(nèi)校外、專業(yè)的限 制，自2005年開課以來，始終保持著很高的 報名人數(shù)； 3、根據(jù)個

2、人多年從事分子生物學(xué)實驗的經(jīng)驗, 講述很 多分子生物學(xué)常規(guī)實驗的具體操作要點,試劑和儀 器的品牌與選擇。實用性高，即學(xué)即用；注重細(xì) 節(jié)，避免不必要的花費、實驗彎路和失??；方法注 重簡單、快速，重復(fù)性高； . 研究生從事分子生物學(xué)研究工作的原則與方法；研究生從事分子生物學(xué)研究工作的原則與方法；1 質(zhì)粒的提取技術(shù)；質(zhì)粒的提取技術(shù)；3 DNADNA和和RNARNA提取方法；提取方法；4 酶切與連接；酶切與連接；5 新生在實驗室最容易犯的錯誤；新生在實驗室最容易犯的錯誤；2 . 電泳技術(shù)；電泳技術(shù)；6 PCRPCR技術(shù)；技術(shù)；8 SouthernSouthern、NorthernNorthern和和W

3、esternWesternblotblot雜交；雜交；9 酶聯(lián)免疫技術(shù)（酶聯(lián)免疫技術(shù)（ElisaElisa）；）；10 分子生物學(xué)常用轉(zhuǎn)化技術(shù)；分子生物學(xué)常用轉(zhuǎn)化技術(shù)；7 . 文庫的建立與篩選；文庫的建立與篩選；11 宏基因組技術(shù)；宏基因組技術(shù)；13 酶的定向進化技術(shù)；酶的定向進化技術(shù)；14 克隆基因的策略；克隆基因的策略；12 . 考試方式考試方式 學(xué)分為3分，總學(xué)時60。 開卷考試，在學(xué)期末將布置一次作業(yè)，根 據(jù)作業(yè)的成績（70%）和出席情況（30%） 決定總成績。 作業(yè)期限：本學(xué)期末或下學(xué)期開學(xué)后一個 星期內(nèi)交作業(yè)，過期無效。 . 幻燈片發(fā)送方式 選舉一個愿意為大家服務(wù)的同學(xué)任課程班長，

4、 每次上完課后，當(dāng)次課的幻燈片可以拷貝給 課程班長，然后由他（她）負(fù)責(zé)通過郵件發(fā) 送給其他同學(xué)。 . 研究生對科研的正確態(tài)度 態(tài)度決定一切！態(tài)度決定一切！ 我想，我試，我樂！我想，我試，我樂！ -北大生科院院長饒毅北大生科院院長饒毅 饒毅對神經(jīng)發(fā)育研究了二十多年，成就頗高。對于科研，饒毅樂在其中，果饒毅對神經(jīng)發(fā)育研究了二十多年，成就頗高。對于科研，饒毅樂在其中，果 蠅和小鼠是他的寶貝。蠅和小鼠是他的寶貝。最近幾年，他用果蠅和小鼠研究社會行為的分子生物最近幾年，他用果蠅和小鼠研究社會行為的分子生物 學(xué)基礎(chǔ)，比如研究果蠅的打架斗毆、求偶失戀。學(xué)基礎(chǔ)，比如研究果蠅的打架斗毆、求偶失戀。 . 研究生論

5、文設(shè)計的三要素 1 1、 實驗對象實驗對象。實驗所用的材料即為實驗對 象。如用小鼠做實驗，小鼠就是本次實驗 的實驗對象，或稱為受試對象。實驗對象實驗對象 選擇的合適與否直接關(guān)系到實驗實施的難選擇的合適與否直接關(guān)系到實驗實施的難 度，以及別人對實驗新穎性和創(chuàng)新性的評度，以及別人對實驗新穎性和創(chuàng)新性的評 價。價。一個完整的實驗設(shè)計中所需實驗材料 的總數(shù)稱為樣本含量。最好根據(jù)特定的設(shè) 計類型估計出較合適的樣本含量。樣本過 大或過小都有弊端。 . 研究生論文設(shè)計的三要素 2 2、 實驗因素。實驗因素。所有影響實驗結(jié)果的條件都稱為 影響因素，實驗研究的目的不同，對實驗的要求 也不同。影響因素有客觀與主觀

6、，主要與次要因 素之分。研究者希望通過研究設(shè)計進行有計劃的 安排，從而能夠科學(xué)地考察其作用大小的因素稱 為實驗因素（如藥物的種類、劑量、濃度、作用 時間等）；對評價實驗因素作用大小有一定干擾 性且研究者并不想考察的因素稱為區(qū)組因素或稱 重要的非實驗因素（如動物的窩別、體重等）； 其他未加控制的許多因素的綜合作用統(tǒng)稱為實驗 誤差。最好通過一些統(tǒng)計學(xué)方法和預(yù)實驗，初步最好通過一些統(tǒng)計學(xué)方法和預(yù)實驗，初步 篩選實驗因素并確定取哪些水平較合適，以免實篩選實驗因素并確定取哪些水平較合適，以免實 驗設(shè)計過于復(fù)雜，實驗難以完成。驗設(shè)計過于復(fù)雜，實驗難以完成。 . 研究生論文設(shè)計的三要素 3 3、 實驗效應(yīng)實

7、驗效應(yīng)。實驗因素取不同水平時在實驗單位 上所產(chǎn)生的反應(yīng)稱為實驗效應(yīng)。實驗效應(yīng)是反映實 驗因素作用強弱的標(biāo)志，它必須通過具體的指標(biāo)來 體現(xiàn)。要結(jié)合專業(yè)知識，盡可能多地選用客觀性強 的指標(biāo)，在儀器和試劑允許的條件下，應(yīng)盡可能多應(yīng)盡可能多 選用特異性強、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的客觀指標(biāo)。選用特異性強、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的客觀指標(biāo)。 對一些半客觀（比如讀pH試紙上的數(shù)值）或主觀指 標(biāo)（對一些定性指標(biāo)的判斷上），一定要事先規(guī)定 讀取數(shù)值的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，只有這樣才能準(zhǔn)確地分析自 己的實驗結(jié)果，從而也大大提高了自己實驗結(jié)果的 可信度。另外，研究中盡量使用一些最成熟的技術(shù)，研究中盡量使用一些最成熟的技術(shù)， 而不要一味

8、追求高新技術(shù)而不要一味追求高新技術(shù)，也是增加實驗效應(yīng)（實 驗成功率），降低風(fēng)險的一個方法。 . 實驗設(shè)計的六原則 1、隨機原則隨機原則：即運用“隨機數(shù)字表”實現(xiàn)隨機化；運用 “隨機排列表”實現(xiàn)隨機化；運用計算機產(chǎn)生“偽隨機數(shù)” 實現(xiàn)隨機化。 盡量運用統(tǒng)計學(xué)知識來設(shè)計自己的實驗盡量運用統(tǒng)計學(xué)知識來設(shè)計自己的實驗 （如正交設(shè)計，均勻設(shè)計法等（如正交設(shè)計，均勻設(shè)計法等），減少外在因素和人為因 素的干擾。 2、對照原則對照原則：空白對照組的設(shè)立只有通過對照的設(shè)立只有通過對照的設(shè)立 我們才能清楚地看出實驗因素在當(dāng)中所起的作用我們才能清楚地看出實驗因素在當(dāng)中所起的作用。當(dāng)某些 處理本身夾雜著重要的非處理因

9、素時，還需設(shè)立僅含該非 處理因素的實驗組為實驗對照組；（對照就象電泳實驗的 分子量marker一樣重要?。?3、重復(fù)原則重復(fù)原則：所謂重復(fù)原則，就是在相同實驗條件下必須 做多次獨立重復(fù)實驗。一般認(rèn)為重復(fù)一般認(rèn)為重復(fù)5 5次以上的實驗才具次以上的實驗才具 有較高的可信度。有較高的可信度。 . 實驗設(shè)計的六原則 4、 平衡原則平衡原則：一個實驗設(shè)計方案的均衡性好壞，關(guān)系到實驗研 究的成敗。應(yīng)充分發(fā)揮具有各種知識結(jié)構(gòu)和背景的人的作應(yīng)充分發(fā)揮具有各種知識結(jié)構(gòu)和背景的人的作 用用， 群策群力，方可有效地提高實驗設(shè)計方案的均衡性。 在實驗設(shè)計的過程中要注意時間上的分配要注意時間上的分配，只有在時間上分 配

10、好了，才不會出現(xiàn)一段時間特別忙而一段時間特別閑的情 況。 5、彈性原則：彈性原則：所謂空格，指的是在時間分配圖上留有空缺時間分配圖上留有空缺。適 當(dāng)?shù)目杖笔欠浅１匾?，只有這樣才能富有彈性的實施實驗 計劃，并不斷地調(diào)整好自己的實驗進度調(diào)整好自己的實驗進度。 6、最經(jīng)濟原則最經(jīng)濟原則：不論什么實驗，都有它的最優(yōu)選擇方案最優(yōu)選擇方案，這包 括在資金的使用上，也包括人力時間的損耗上，必要時可以 預(yù)測一下自己實驗的產(chǎn)出和投入的比值，這個比值越大越好， 當(dāng)然是以你所擁有的實驗條件你所擁有的實驗條件作基礎(chǔ)的。 （量力而為，看米 下鍋?。?. 實驗計劃、實驗結(jié)果與小結(jié) -引自鄒承魯?shù)奈业目茖W(xué)之路 一計劃 二

11、實驗工作 三實驗記錄 四實驗結(jié)果 五實驗小結(jié) . 一計劃 在開始工作前，制定一個現(xiàn)實可行的研究計劃是必要的。 除課題計劃外，日常工作也要有計劃，日有日計劃日常工作也要有計劃，日有日計劃，周有周有 周計劃周計劃，并根據(jù)計劃準(zhǔn)備必要的實驗條件，安排進行工作。 一個值得推薦的做法是把日計劃和周計劃記載在實驗記錄一個值得推薦的做法是把日計劃和周計劃記載在實驗記錄 本上，每日最后檢查日計劃完成情況，制定次日計劃，每本上，每日最后檢查日計劃完成情況，制定次日計劃，每 周最后檢查周計劃完成情況周最后檢查周計劃完成情況，制定次周計劃，由于基礎(chǔ)研 究實驗結(jié)果有一定的不可預(yù)見性。因此，隨時根據(jù)實驗結(jié) 果修訂計劃也

12、是必要的。除自己的實驗結(jié)果有一定的不可 預(yù)見性之外，現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展很快，瞬息萬變，同樣有一 定程度上的不可預(yù)見性。必需隨時根據(jù)文獻上的最新動態(tài)，必需隨時根據(jù)文獻上的最新動態(tài)， 修改自己的課題計劃。修改自己的課題計劃。從小的方面來說，文獻上有更好的 實驗方法發(fā)表，可以代替原來采用的方法。從較大的方面 來說，有時本來準(zhǔn)備作的工作，文獻上已經(jīng)有人發(fā)表報道，文獻上已經(jīng)有人發(fā)表報道， 或者新的發(fā)展使得原來認(rèn)為重要的問題喪失了其重要性，或者新的發(fā)展使得原來認(rèn)為重要的問題喪失了其重要性， 不得不完全放棄原來計劃或從根本上予以修改。不得不完全放棄原來計劃或從根本上予以修改。 . 二實驗工作 實驗是一切實驗科學(xué)

13、的根本，所有結(jié)論都必需建立在堅實的實驗結(jié)果之上， 因此取得可靠的實驗結(jié)果是怎樣強調(diào)也不會過分的。實驗結(jié)果最主要的實驗結(jié)果最主要的 是可重復(fù)性，不僅事后自己能夠重復(fù)，別人在同樣實驗條件下是可重復(fù)性，不僅事后自己能夠重復(fù)，別人在同樣實驗條件下 也能夠重復(fù)。也能夠重復(fù)。這樣不僅自己有把握，別人也會相信。實驗結(jié)果的可重復(fù)性 體現(xiàn)在每次都能得到同樣的結(jié)果，在一場足球比賽中3:2 就是決定性的勝利， 但在實驗結(jié)果上在實驗結(jié)果上3:23:2的結(jié)果只能認(rèn)為是失敗。比較滿意的勝利至的結(jié)果只能認(rèn)為是失敗。比較滿意的勝利至 少應(yīng)該是少應(yīng)該是3:03:0，在一定條件下2:0 是可以接受的，但1:0就不能認(rèn)為是可以 接

14、受的結(jié)果。實驗結(jié)果的可重復(fù)性首先建立在實驗材料，其次是實驗條件的 嚴(yán)格性和可重復(fù)性上。再者實驗環(huán)境的清潔，工作程序的嚴(yán)格有序也是實驗 結(jié)果可重復(fù)性的重要因素。在工作開始之前，對這些問題給以充分的注意， 花費一些時間，不僅是絕對必要的，總體來說，在時間上也是經(jīng)濟的，正確 的結(jié)論只能建立在可重復(fù)的實驗結(jié)果上，實驗結(jié)果出于意外并不可怕，實驗結(jié)果出于意外并不可怕， 從負(fù)面結(jié)果有時同樣可以得出有價值的結(jié)論。可怕的是實驗結(jié)從負(fù)面結(jié)果有時同樣可以得出有價值的結(jié)論?？膳碌氖菍嶒灲Y(jié) 果不能重復(fù)果不能重復(fù)，如果多次實驗，而每次都得到不同結(jié)果，每次都得到不同結(jié)果，只能表示整個 工作完全得不到有價值的結(jié)果，那才是最大

15、的時間浪費。 . 三實驗記錄 實驗記錄是研究工作的一項極其重要的內(nèi)容，實驗記錄是研究工作的一項極其重要的內(nèi)容， 是工作的基礎(chǔ)。是工作的基礎(chǔ)。而多數(shù)青年人對此常常不夠重視。 我曾經(jīng)有一個學(xué)生，有吸煙的習(xí)慣，一次在去儀 器室做實驗時，發(fā)現(xiàn)忘記帶記錄本，就把身上的 煙盒拆了，把實驗結(jié)果記錄記在煙合的背面，隨 后就把這張紙弄丟了，恰恰這一實驗用了一個寶 貴實驗材料，因此重復(fù)這一實驗十分費力。當(dāng)然， 現(xiàn)在的儀器都與計算機連接，結(jié)果都存儲在計算 機內(nèi)，但隨手抓一個紙片記錄實驗結(jié)果是絕對不隨手抓一個紙片記錄實驗結(jié)果是絕對不 能允許的壞習(xí)慣能允許的壞習(xí)慣。 . 四實驗結(jié)果 現(xiàn)代科學(xué)在很大程度上依賴儀器，特別是

16、現(xiàn)代儀器自動化程度很高，進樣之后，啟動程序自動取得 數(shù)據(jù)并自動存儲于計算機之中。但是千萬不能忘記，任何儀器都不是萬能的，所有儀器都有一定的條 件限制，必需充分認(rèn)識到，超出儀器所能允許的條件之外，儀器完全可能給出一個甚至一組完全不可 靠的數(shù)據(jù)。因此在使用儀器之前務(wù)須全面了解充分了解儀器的性能及適用范圍，才能得到可信的結(jié)果。 在我多年的經(jīng)驗中，有一項值得特別在此提出，就是使用儀器必需事先仔細(xì)閱讀儀器說使用儀器必需事先仔細(xì)閱讀儀器說 明書。進行實驗必需仔細(xì)閱讀原始文獻中的實驗方法，向做過類似實驗的師兄明書。進行實驗必需仔細(xì)閱讀原始文獻中的實驗方法，向做過類似實驗的師兄 姐們請教是必要的，但決不能代替

17、自己閱讀文獻或說明書。姐們請教是必要的，但決不能代替自己閱讀文獻或說明書。我們在幼兒園時代都玩過 傳話游戲。老師給第一個小朋友說一句話，第一個小朋友把話傳給第二個，第二個再傳給第三個。這 句話傳到最后，可以和老師最早給第一個小朋友說的話，完全不同。這就說明根據(jù)師兄姐們口頭傳授 的經(jīng)驗進行工作有多么危險。有時實驗方法的錯誤對一項工作可以是致命的錯誤，向你傳授經(jīng)驗的人 是不會代你負(fù)責(zé)的。與此有關(guān)的一條經(jīng)驗是，論文中的引用文獻必需自己核對與此有關(guān)的一條經(jīng)驗是，論文中的引用文獻必需自己核對 過，轉(zhuǎn)引自其他文獻同樣可能發(fā)生錯誤。過，轉(zhuǎn)引自其他文獻同樣可能發(fā)生錯誤。 和實驗結(jié)果的可重復(fù)性同樣重要而又密切相

18、關(guān)的，是實驗結(jié)果的精和實驗結(jié)果的可重復(fù)性同樣重要而又密切相關(guān)的，是實驗結(jié)果的精 確度。確度。對不同實驗結(jié)果的精確度有不同的要求，要求過高是一種浪費，給人以殺雞焉用牛刀之譏， 過低則不能滿足需要。給出數(shù)據(jù)，也有類似問題。每一項測定都有一定的精確度，如果一項測定的精 確度為三位有效數(shù)字，則給出三位以上數(shù)字不僅是完全沒有意義的，并且只能說明作者完全缺乏有效 數(shù)字的概念，這不僅適用于直接獲得的初始數(shù)據(jù)，對從初始數(shù)據(jù)得出的次級數(shù)據(jù)也同樣適用。例如， 對一組精確度為三位有效數(shù)字的測定結(jié)果予以平均，給出四位以上的平均數(shù)計算結(jié)果，也只能表明作 者的無知。 . 五實驗小結(jié) 不斷進行小結(jié)與不斷完善。不斷進行小結(jié)與

19、不斷完善。在實驗記錄本上記載每周計劃的目的之一就是在周末進行檢查 和小結(jié)，并根據(jù)結(jié)果制定下周計劃。我的導(dǎo)師教導(dǎo)我在工作順利時要注意隨時進行階段性在工作順利時要注意隨時進行階段性 小結(jié)，特別是在工作順利時，新的實驗數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，小結(jié)，特別是在工作順利時，新的實驗數(shù)據(jù)不斷涌現(xiàn)，常常會使人忙于收集大量 實驗數(shù)據(jù)，而忽略檢查實驗數(shù)據(jù)的可靠性以及對實驗數(shù)據(jù)所說明的問題深入思考，或者說是只見樹木，不 見森林。因而收集了大量無用的、錯誤的或意義不大的實驗數(shù)據(jù)，反而忽略了真正關(guān)鍵的數(shù)據(jù)，包括必不 可少的對照實驗。這些必不可少的對照實驗，當(dāng)時做是非常方便的，而事后補做往往費當(dāng)時做是非常方便的，而事后補做往往費

20、時費力。時費力。隨時進行階段性小結(jié)不僅可以隨時發(fā)現(xiàn)問題隨時予以解決，還可以隨時注意不僅要深入問題， 重視每一個細(xì)節(jié)，還要不斷總覽全局，才不致迷失方向，這就是我國古人說做學(xué)問不僅要入乎其中還要出 乎其外的意思。 隨時進行階段性小結(jié)的另一目的就是對所得的初步結(jié)論隨時予以檢查，隨時進行階段性小結(jié)的另一目的就是對所得的初步結(jié)論隨時予以檢查， 每一項實驗結(jié)果都可能有多種不同的解釋，特別是在實驗出現(xiàn)重要結(jié)果時，每一項實驗結(jié)果都可能有多種不同的解釋，特別是在實驗出現(xiàn)重要結(jié)果時， 最容易犯的錯誤就是輕率得出結(jié)論，要有自以為非的勇氣。最容易犯的錯誤就是輕率得出結(jié)論，要有自以為非的勇氣。我一生犯過多次這 樣的錯誤

21、。五十年代，王應(yīng)睞教授、汪靜英同志和我在國際上首先純化了琥珀酸脫氫酶，并發(fā)現(xiàn)它有一個 與蛋白部分共價連接含有核黃素的輔基。當(dāng)時已知的兩種核黃素輔基，核黃素單核苷酸和核黃素腺嘌呤二 核苷酸，都是與蛋白部分非共價結(jié)合，與蛋白部分共價連接含的核黃素輔基，文獻上尚未見有報道。因此 我想，我們很可能發(fā)現(xiàn)了一種新型的核黃素輔基，經(jīng)過把蛋白部分水解進行鑒定，我們觀察到這一輔基含 有兩種堿基，一種是核黃素，而另一種在雙向紙層析上的位置表明它不是腺嘌呤而是次黃嘌呤，紫外吸收 光譜也與次黃嘌呤相同。這導(dǎo)致我輕率得出結(jié)論認(rèn)為我們獲得了一種全新的，文獻中從未報道過的與蛋白 部分共價連接的輔基，核黃素次黃呤嘌呤二核苷酸

22、。但在結(jié)構(gòu)上次黃嘌呤僅比腺嘌呤少一個氨基，為此王 應(yīng)睞教授建議檢查在我們的酶制劑中是否會含有一種從腺嘌呤分子上水解除去氨基的酶，雖然我們的酶經(jīng) 過純化，含有雜酶的可能性不大，但我們?nèi)匀贿M行了檢查，結(jié)果酶制劑中果然含有腺嘌呤脫氨酶作為雜質(zhì)， 輔基雖然與蛋白部分共價連接，但仍然是核黃素腺嘌呤二核苷酸，次黃呤嘌是在酶純化過程中腺嘌呤的水 解產(chǎn)物。這就避免了在論文發(fā)表時出現(xiàn)重大錯誤。 . 五實驗小結(jié) 參加各種水平的學(xué)術(shù)會議也是不斷進行小結(jié)的一種方法。參加各種水平的學(xué)術(shù)會議也是不斷進行小結(jié)的一種方法。 工作報告目的在于交流和隨時聽取不同意見，自己容易忽 視的問題別人有時可以一眼發(fā)現(xiàn)。所謂當(dāng)局者迷，旁觀者

23、 清在科學(xué)上也是完全正確的。參加國際學(xué)術(shù)會議是考驗自 己工作的極好機會。特別是小型會議，在國外與自己工作 有關(guān)的實驗室作學(xué)術(shù)報告，由于熟悉自己工作領(lǐng)域的同行由于熟悉自己工作領(lǐng)域的同行 較多，討論比較充分，更容易發(fā)現(xiàn)自己工作中的問題。較多，討論比較充分，更容易發(fā)現(xiàn)自己工作中的問題。一 個系列性工作，在多次報告，經(jīng)過多次討論的考驗后，才 會逐漸趨向成熟，得出可靠的結(jié)論。最近國際生物化學(xué)與 分子生物學(xué)聯(lián)合會發(fā)表的分子水平生命科學(xué)博士標(biāo)準(zhǔn)一書 中強調(diào)參加學(xué)術(shù)活動和做學(xué)術(shù)報告是博士學(xué)位訓(xùn)練的一個 重要組成部分，我對此深有同感。 . 做分子生物學(xué)實驗失敗的最常見原因 (一)心理素質(zhì)問題； (二)操作問題；

24、 (三)試劑問題 ； (四)背景知識問題； (五)安全問題 。 . (一)心理素質(zhì)問題 做實驗實際上也是一種人的活動，所以個 人的心理素質(zhì)對實驗是有影響的，一 般來講，平常心態(tài)穩(wěn)定、習(xí)慣良好的人，平常心態(tài)穩(wěn)定、習(xí)慣良好的人， 實驗的成功率要高實驗的成功率要高，反之則低些。下 面例舉的是實驗中遇到的實驗人員心理問 題。 . 1、不能正確對待實驗 分子生物學(xué)分子生物學(xué)是一門年輕的學(xué)科，從開始創(chuàng)立到如今，才短短的從開始創(chuàng)立到如今，才短短的4040余年。余年。 由于它的應(yīng)用十分廣泛，所以發(fā)展特別快，已開始形成了一套完整而成熟的基 礎(chǔ)理論和實驗體系。分子生物學(xué)涉及的知識領(lǐng)域廣泛，許多學(xué)科的新進展都很 快

25、與它聯(lián)系起來，故它具有一定的神秘性具有一定的神秘性，所以還沒有進分子生物學(xué)這個門 的人，都有一些畏懼心理。有一些畏懼心理。實際上分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論本身還是比較簡明 具體，同時它的實驗操作也都有專門的書籍詳細(xì)介紹 (如分子克隆)，讀 上幾本基礎(chǔ)書，再到有經(jīng)驗的實驗室去實踐，在較短的時間內(nèi)是可以入門的。 另一方面，有些己具有部分分子生物學(xué)知識的人，從各個公司的產(chǎn)品介紹書、 專業(yè)文獻中看到，很多實驗的實驗步驟經(jīng)過前人的不斷改迸進，變得十分的簡 便，有些大的實驗在幾天內(nèi)即可完成，便認(rèn)為實驗簡單，產(chǎn)生輕視心理，認(rèn)為實驗簡單，產(chǎn)生輕視心理， 這種心理同樣也是有害的。這種心理同樣也是有害的。因為實驗的操作

26、是精細(xì)而微量的，本身中實驗的操作是精細(xì)而微量的，本身中 間步驟多且用直觀方法難以檢測，實驗中的每一種試劑，每一個步驟間步驟多且用直觀方法難以檢測，實驗中的每一種試劑，每一個步驟 出錯都可能是致命的，可能導(dǎo)致實驗完全失敗出錯都可能是致命的，可能導(dǎo)致實驗完全失敗，所以分子生物學(xué)實驗是不 能完全按實驗流程來計算時間的。例如在本實驗室做基因拼接，按標(biāo)準(zhǔn)實驗程 序，合成完寡聚核苷酸片段后只需10天即可完成拼接、克隆及測序鑒定，但在 實際中，還沒有人能在10天內(nèi)做完。由于各種各樣的原因(包括試劑、操作及 個人心理素質(zhì)等)，平均要2個月左右才能完成這樣一個工作。所以，輕視心理 也是必須糾正的?？傊瑢Υ肿?/p>

27、生物學(xué)實驗對待分子生物學(xué)實驗，引用偉人毛澤東的一句話 在戰(zhàn)略上藐視它，在戰(zhàn)術(shù)上重視它在戰(zhàn)略上藐視它，在戰(zhàn)術(shù)上重視它才是正確的態(tài)度。 分子生物學(xué)實驗面前人人平等，沒有一本、二本和三本的區(qū)別！分子生物學(xué)實驗面前人人平等，沒有一本、二本和三本的區(qū)別！ . 2、使用試劑時缺乏微量概念 在分子生物學(xué)實驗中，試劑的用量往往很少在分子生物學(xué)實驗中，試劑的用量往往很少，液體常?？?用到1微升，而普通的一滴水就有20-100微升;固體物質(zhì)可 用到微克甚至納克級，這是平常肉眼看不見的，所以剛剛剛剛 接觸分子生物學(xué)實驗的人，總是擔(dān)心要取的東西能否取到，接觸分子生物學(xué)實驗的人，總是擔(dān)心要取的東西能否取到， 準(zhǔn)不準(zhǔn)確，

28、操作的樣品是不是會丟失?？偸羌哟笥昧繙?zhǔn)不準(zhǔn)確，操作的樣品是不是會丟失?？偸羌哟笥昧?，認(rèn) 為多總比少好，實際上這些顧慮是多余的。在分子生物學(xué) 實驗中，一般都有專門的儀器設(shè)備檢測和觀察樣品，有一 整套方法保證取樣的正確。許多樣品的量很少，肉眼看不 見，而肉眼看不見通常意味著樣品純度好，不帶雜質(zhì)，超 量使用酶等試劑反而會干擾正確的結(jié)果。所以實驗人員必實驗人員必 須在心理上逐漸適應(yīng)用這些微量概念。須在心理上逐漸適應(yīng)用這些微量概念。 . 3、粗心大意 在基因工程實驗中，由于粗心大意造成的錯誤可說是千 奇萬怪，在每一個實驗中幾乎都可以舉出實例。在一個 課題的研究中，可能要用到一系列的實驗，每一個實驗中 又

29、包含幾個小實驗，小實驗中又有許多具體的步驟，每一 個步驟中又用到許多試劑，在這些過程中因為粗心大意都 有出錯的可能，產(chǎn)生的后果小則重做某一步驟，大則整個 課題必須重新開頭。主要表現(xiàn)為試劑配制錯誤主要表現(xiàn)為試劑配制錯誤; ;樣品取錯樣品取錯; ; 實驗順序顛倒實驗順序顛倒; ;樣品混淆，樣品意外丟失樣品混淆，樣品意外丟失; ;加錯試劑加錯試劑; ;看錯看錯 實驗條件等等不一而足。實驗條件等等不一而足。例如某人大量制備DNA，所有的 細(xì)菌培養(yǎng)、擴增及堿法抽提、分步純化、乙醇沉淀DNA都 己做完，最后離心收集DNA時，不小心將離心管碰翻到地 上，樣品全部丟失，一周成果全部損失。我們建議實驗人 員要克

30、服粗心大意的不良習(xí)慣，嚴(yán)格細(xì)心地做每一步操作， 以保證整體實驗的順利進行。 . 4、缺乏整體實驗的概念 許多實驗人員在剛開始一項新的實驗時，對整個實驗過程許多實驗人員在剛開始一項新的實驗時，對整個實驗過程 缺少全面的了解，缺少全面的了解，對實驗需要多少時間?要用何種試劑?用 量多少?要用到何種實驗材料?何種實驗設(shè)備等都沒有概念， 往往實驗做到中途，再急匆匆來尋找缺少的東西實驗做到中途，再急匆匆來尋找缺少的東西。分子生 物學(xué)實驗中，所用到的試劑、藥品通常都價錢昂貴，一般 實驗室不可能儲備得種類齊全而又充足，另外許多試劑還 依賴進口，購買周期長，這就會迫使實驗中途停止，致使 實驗效率嚴(yán)重降低，有的

31、實驗不能中途停頓，就可能使整 個實驗全部失敗。我們建議實驗人員在做分子生物學(xué)實驗建議實驗人員在做分子生物學(xué)實驗 之前，應(yīng)在基礎(chǔ)知識、實驗方法、實驗材料及實驗試劑上之前，應(yīng)在基礎(chǔ)知識、實驗方法、實驗材料及實驗試劑上 有充分的準(zhǔn)備，在實驗時間上做好充分的安排，以保證實有充分的準(zhǔn)備，在實驗時間上做好充分的安排，以保證實 驗的順利開展。驗的順利開展。 . 5、僥幸心理 僥幸心理是分子生物學(xué)實驗中致使實驗人員犯錯誤最多的原因，想省時僥幸心理是分子生物學(xué)實驗中致使實驗人員犯錯誤最多的原因，想省時 間、省步驟及因?qū)η耙徊綄嶒灻つ孔孕攀钱a(chǎn)生這種心理的主要原因。間、省步驟及因?qū)η耙徊綄嶒灻つ孔孕攀钱a(chǎn)生這種心理的

32、主要原因。因 為分子生物學(xué)實驗方法是在依據(jù)分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的基礎(chǔ)上，輔以前人大量 的實驗經(jīng)驗而建立的，實驗條件的細(xì)小改變，不一定會使實驗失敗，但幾個步 驟的細(xì)小改變，累積起來必出大錯，做分子生物學(xué)實驗每個步驟的結(jié)果，做分子生物學(xué)實驗每個步驟的結(jié)果， 在能夠檢測的情況下都應(yīng)檢測，否則不應(yīng)進入下一步實驗。在能夠檢測的情況下都應(yīng)檢測，否則不應(yīng)進入下一步實驗。由于各種原 因，實驗人員經(jīng)常省略檢測這一步，從表面上看省了事、實際上使后面的實驗 失去了保證，最后實驗失敗而且連原因都找不出，對重做實驗也無補益。結(jié)果 是花費更多的時間。還浪費了寶貴的樣品和試劑。例如某人從克隆載體上分離 基因，限制性內(nèi)切酶酶切

33、后沒有檢測是否切動、是否完全，即進入電泳分離基 因，電泳完在紫外光下收割基因片段時，才看到載體DNA根本沒有切斷，只好重 做。還有的人在前面的情況下，抱一種僥幸心理，認(rèn)為可能會有少量基因切下， 在基因DNA電泳應(yīng)出現(xiàn)的位置割膠分離，將假想分離到的基因直接進行克隆;， 當(dāng)然這些人的僥幸心理是有基礎(chǔ)的，因為基因DNA分子太少，在EB染色中是看不 到的，但這樣做實驗成功的機會甚微，從我們實驗室統(tǒng)計的情況看，花的時間 成倍地多?？傊瑑e幸心理是導(dǎo)致實驗失敗最大的原因，是實驗人員最忌諱的 事，所有的人都應(yīng)加以杜絕。我們建議實驗人員充分安排好實驗，嚴(yán)格按照每 一實驗步驟的要求操作。當(dāng)實驗中出現(xiàn)沒有把握的情

34、況時，應(yīng)停止實驗，尋找 原因加以克服，或找有經(jīng)驗的同行解決問題，直到有把握再進入下一步實驗。 我們之所以在這里一再強調(diào)這一點，是因為這方面犯錯誤的人太多太多，有經(jīng) 驗的和沒經(jīng)驗的人都不例外。 . （二)操作問題 在分子生物學(xué)實驗中，經(jīng)常要進行微生物學(xué)方面、生物化 學(xué)方面及儀器方面等等的操作儀器方面等等的操作，不了解這些操作的要求， 也會影響實驗人員的實驗工作，甚至可能使實驗室造成重 大損失，所以每個實驗人員進入實驗室時，必須參閱有關(guān)每個實驗人員進入實驗室時，必須參閱有關(guān) 的書籍，或請有經(jīng)驗的人員演示說明，方可開展實驗。另的書籍，或請有經(jīng)驗的人員演示說明，方可開展實驗。另 外要著重說明的一點是做

35、標(biāo)簽外要著重說明的一點是做標(biāo)簽，由于實驗室做實驗的人員 通常都很多，每人自己的樣品較易與他人的樣品混淆，自 己的樣品之間太多時也易混淆;許多樣品需要保存的時間 較長，到時可能找不到，所以手頭的樣品、試劑應(yīng)隨手標(biāo) 好。標(biāo)簽應(yīng)寫明樣品名稱、日期和配制人姓名，應(yīng)牢靠、標(biāo)簽應(yīng)寫明樣品名稱、日期和配制人姓名，應(yīng)牢靠、 不能模糊。不能模糊。 . （三)試劑問題 在分子生物學(xué)實驗中，要用到多種試劑，并且對試劑的要求十分嚴(yán)格， 主要表現(xiàn)為: 1 試劑等級不夠，如應(yīng)該用分析純分析純的誤用了化學(xué)純; 2 試劑配制不當(dāng)，如有的化學(xué)試劑化學(xué)試劑結(jié)晶體，含有水分子含有水分子， 在稱量時沒有扣除它的份額，配制的試劑濃度過

36、低; 3 除菌條件不對，某些試劑應(yīng)過濾除菌過濾除菌，另一些試劑應(yīng)高溫高壓滅菌高溫高壓滅菌; 4 試劑污染試劑污染，如稱量稱量時，取用試劑時，別人污染時都可能造成污染; 5 試劑儲存時間過長試劑儲存時間過長，如測序用的丙烯酰胺膠母液，在4條件下只 能存放一個月; 6 試劑保存不當(dāng)試劑保存不當(dāng)，如有的試劑應(yīng)保存在-20下，另一些試劑則只能 在室溫下保存。所以實驗人員在配制試劑時，要嚴(yán)格按各個特定試 劑的配制要求來操作。 . (四)背景知識問題 第一是對研究課題的背景知識了解不夠。第一是對研究課題的背景知識了解不夠。實驗人 員不知道實驗要解決何種問題，怎樣解決問題， 不知道采用何種技術(shù)路線最有效地解

37、決問題，這 一現(xiàn)象是很嚴(yán)重的;第二是對具體的實驗原理不懂，第二是對具體的實驗原理不懂， 以至不能正確地分析實驗現(xiàn)象，不能以至不能正確地分析實驗現(xiàn)象，不能 靈活地解決實驗中遇到的問題。靈活地解決實驗中遇到的問題。我們建議實驗人 員盡可能多地占有有關(guān)課題的背景資料，詳細(xì)地 閱讀和理解有關(guān)的實驗資料。 . (五)安全問題 在分子生物學(xué)實驗中，實驗人員經(jīng)常要接觸到一些對人體在分子生物學(xué)實驗中，實驗人員經(jīng)常要接觸到一些對人體 有害的實驗試劑，有害的實驗試劑，如溴化乙錠、丙烯酰胺、放射性同位素溴化乙錠、丙烯酰胺、放射性同位素 等，它們或者可能誘發(fā)癌癥，或者對人神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生累積 毒害。因此，為了實驗人員的人

38、身安全，每一個人都應(yīng)嚴(yán) 格按照實驗安全操作的有關(guān)要求進行操作。另一個問題是，另一個問題是， 實驗室經(jīng)常要使用實驗室經(jīng)常要使用煤氣、水及電器水及電器，煤氣泄漏導(dǎo)致爆炸或 人員中毒死亡，實驗室水龍頭未關(guān)，下水道堵塞造成實驗 室水災(zāi)，實驗室人員觸電等時有發(fā)生，所以每一個實驗人 員在離開實驗室時都應(yīng)注意檢查水、電、煤氣，有關(guān)用電 設(shè)備都應(yīng)按操作說明使用，以防止不必要的人身意外傷亡。 . 分子生物學(xué)實驗成功的關(guān)鍵 穩(wěn)定的心理素質(zhì)、正確而精 準(zhǔn)的實驗技術(shù)、良好的實驗 習(xí)慣，是實驗獲得成功的關(guān) 鍵。！ . 實驗室基本注意事項 一、新生進入實驗室后必須做好的幾件事情: 1 1、實驗記錄本、實驗記錄本，上面寫清

39、楚日期每天的實驗內(nèi)容，操作步驟、結(jié)果.如 果結(jié)果不好，應(yīng)試著分析并寫出原因以便以后參考。需要拍照的照 片，必須當(dāng)時拍完，并編好文件日期妥善保存（格式一般是 *.tif）。如果犯了很不應(yīng)該的錯誤,必須在實驗記錄本上注明,下次 不要再犯同樣的錯誤. 2 2、有自己專用的實驗樣品盒、有自己專用的實驗樣品盒，盒子放在冰箱的固定位置并且在盒子上面 用標(biāo)簽紙或記號筆標(biāo)記上自己的名字以查找方便。盒子中的所有樣品 必須都用記號筆標(biāo)記好，最好在管子頂部和側(cè)壁各寫一個標(biāo)記，以防 記號模糊。 3 3、實驗儀器使用前必須仔細(xì)看懂操作方法、實驗儀器使用前必須仔細(xì)看懂操作方法，切忌不懂裝懂。儀器用完應(yīng) 登記登記。 4 4

40、、看分子克隆等經(jīng)典實驗操作手冊中實驗的原理和關(guān)鍵步驟、看分子克隆等經(jīng)典實驗操作手冊中實驗的原理和關(guān)鍵步驟，提高自己 的理論水平。 5、跟師兄師姐做實驗的時侯，應(yīng)保持謙虛謹(jǐn)慎，不懂的地方及時請教。 6、認(rèn)真學(xué)習(xí)防盜、防水、放電、防爆、防輻射、防污染的安全常識安全常識。 7、接觸濃鹽酸、濃硫酸、苯酚、EB實驗時，必須小心謹(jǐn)慎，防止受傷防止受傷。 . 新生做實驗時最容易犯的錯誤 1、離心機使用常見錯誤： （1）離心機使用不規(guī)范。 正確操作應(yīng)該是：首先應(yīng)該根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的離心根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的離心 機和轉(zhuǎn)子以及離心管機和轉(zhuǎn)子以及離心管，使用離心機時的工作轉(zhuǎn)速不應(yīng)該超過離心機、 轉(zhuǎn)

41、子以及離心管的最大允許轉(zhuǎn)速。離心前注意嚴(yán)格平衡樣品離心前注意嚴(yán)格平衡樣品。安裝轉(zhuǎn) 子和轉(zhuǎn)子蓋要規(guī)范、準(zhǔn)確。離心時要留人看守，發(fā)現(xiàn)離心機異常應(yīng)立離心時要留人看守，發(fā)現(xiàn)離心機異常應(yīng)立 即關(guān)閉離心機。即關(guān)閉離心機。離心結(jié)束后要安放好轉(zhuǎn)子，一般要倒扣轉(zhuǎn)子一般要倒扣轉(zhuǎn)子（？）。 （2）3個樣品、5個樣品等的平衡問題。 （3）使用常溫離心機時，必須蓋上轉(zhuǎn)頭的頂蓋必須蓋上轉(zhuǎn)頭的頂蓋。 （4）使用低溫離心機時，用后應(yīng)將轉(zhuǎn)頭拿下來，倒置放好倒置放好。同時將 離心機中的冷凝水擦干冷凝水擦干，將離心機的頂蓋打開離心機的頂蓋打開。 （5）使用低溫離心機時，應(yīng)提前預(yù)冷。預(yù)冷時應(yīng)低速空轉(zhuǎn)使用低溫離心機時，應(yīng)提前預(yù)冷。預(yù)冷

42、時應(yīng)低速空轉(zhuǎn)，以免損 傷電機。離心機不用的時侯，必須及時關(guān)閉。制冷時切忌長時間打開制冷時切忌長時間打開 頂蓋，以保護電機。頂蓋，以保護電機。 . 2、使用移液器有哪些注意事項？ 垂直吸液、慢吸慢放垂直吸液、慢吸慢放；選擇合適的量程范圍，不 能超過量程使用；選擇與移液器匹配的槍頭，安 裝槍頭時不要用力太猛；移液器每日用完后，應(yīng)移液器每日用完后，應(yīng) 旋到最大刻度。旋到最大刻度。 移液器是精密儀器，調(diào)刻度時要慢慢調(diào)調(diào)刻度時要慢慢調(diào)。 玻璃移液管的吸取要用吸耳球，而不能用口吸。 吸200微升液體，用100200微升移液器還是200 1000微升移液器？吸250微升液體，如果要求體 積精確度很高，用哪個

43、移液器？ . 3、滅菌鍋使用注意事項 （1）定期清洗，一般一般1 12 2個月必須清洗一次。個月必須清洗一次。 否則滅菌鍋底部排水處容易染菌。 （2）根據(jù)不同的滅菌條件選擇不同的程序。如 固體、液體滅菌程序，并根據(jù)自己的特殊根據(jù)自己的特殊 要求設(shè)定合適的程序。如要求設(shè)定合適的程序。如116116度滅菌。度滅菌。 （3）必須等滅菌鍋內(nèi)溫度降到必須等滅菌鍋內(nèi)溫度降到9090度以下才可以打開度以下才可以打開 滅菌鍋。滅菌鍋。 （4）滅菌鍋內(nèi)滅菌物品不能塞得太滿滅菌鍋內(nèi)滅菌物品不能塞得太滿，以免影響蒸 汽流通，影響滅菌效果。 . 4、電泳實驗容易犯的錯誤 （1）電泳結(jié)束后膠拿走，不關(guān)電泳儀。電泳結(jié)束后

44、膠拿走，不關(guān)電泳儀。 （2）配膠時侯用水配配膠時侯用水配，而沒有用電泳緩沖液（TAE、TBE等）配。 （3）膠板、梳子到處放膠板、梳子到處放。膠板梳子上有EB等有毒物質(zhì)，必須放在固定 地方。 （4）跑完電泳，膠長期留在膠板上，不聞不問；另外每次電泳過后， 不要的膠必須立刻丟棄不要的膠必須立刻丟棄，防止膠干在上面；膠板用過后需要清膠板用過后需要清 洗，以防止污染。洗，以防止污染。 （5）EBEB的污染的污染。很多新生為了保護自己，電泳的時侯戴著手套，然后 開抽屜、開門或透射儀時，仍戴著手套。導(dǎo)致EB污染到很多地方。 （6）膠拍照的時侯必須在照像儀上貼一張保鮮膜，防止污染和弄花儀器面板。 同時不能

45、戴著手套操作儀器和電腦鍵盤不能戴著手套操作儀器和電腦鍵盤。 （7）剛學(xué)倒膠的時侯，很容易發(fā)生膠的泄漏，造成生膠的泄漏，造成EBEB的污染的污染。為了防止這種情 況，可用雙層透明膠帶封嚴(yán)膠板可用雙層透明膠帶封嚴(yán)膠板。 （8）每次熔化膠后再加EB，不要預(yù)先把EB加到膠中。當(dāng)然也可以電泳完后在用 EB液浸泡，但EBEB染色液一定要放好染色液一定要放好。 . 5 5、廢棄溴化乙錠、廢棄溴化乙錠EBEB凈化和處理方法凈化和處理方法 （1） 嚴(yán)禁隨便丟棄。嚴(yán)禁隨便丟棄。因為EB是強致癌性，而且易揮發(fā)，揮發(fā)至空氣 中，危害很大。 （2） 廢廢EBEB溶液的處理方法溶液的處理方法： 對于EB含量大于0.5mg

46、/ml的溶液，可如下處理： a. 將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4 ，混勻，再加入等量的 2.5mol/L HCl，混勻，置室溫數(shù)小時； c. 加入一倍體積的2.5mol/L NaOH，混勻并廢棄。 EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時； b. 用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。 (3) 廢廢EBEB接觸物接觸物，如抹布，槍頭。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期進行焚燒處理。定期進行焚燒處理。 . 6、使用恒溫水浴槽容易犯的錯誤 （1）水浴槽高溫過夜高溫

47、過夜，比如65度。 （2）沒有樣品時儀器長期不關(guān)閉沒有樣品時儀器長期不關(guān)閉。 （3）水浴槽里面添加自來水水浴槽里面添加自來水（產(chǎn)生水垢、 腐蝕）。應(yīng)該加蒸餾水。 （4）使用低溫循環(huán)水浴（16度連接實驗）時 樣品管一定要在浮板上固定好樣品管一定要在浮板上固定好，以免水 流循環(huán)時把樣品沖走。 . 7、使用超低溫冰箱時容易犯的錯誤 （1）一般情況下，酶不要放在超低溫冰箱中酶不要放在超低溫冰箱中，會影 響活性，放在-20C冰箱即可。 （2）超低溫冰箱主要用來保存菌種保存菌種和某些容易降解某些容易降解 或變質(zhì)的樣品或變質(zhì)的樣品。 （3）不帶加厚手套找樣品時很容易凍傷不帶加厚手套找樣品時很容易凍傷。 （4）樣品盒上沒有名字樣品盒上沒有名字（要用中文），很難查 找；