DNA提取及PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精品文檔PCR擴(kuò)增及 DNA瓊脂糖凝膠電泳劉琳 1131428環(huán)境科學(xué)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握PCR擴(kuò)增的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2對擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并分析相應(yīng)結(jié)果。二、實(shí)驗(yàn)原理1. PCR 擴(kuò)增多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板DNA、四種脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱Taq 聚合酶及兩個合成DNA的引物，而后加熱使模板DNA在高溫下（ 94）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。降低溶液溫度， 使合成引物在低溫（55 ）與模板 DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。溶液反應(yīng)溫度升至中溫（72 ），在 T

2、ap 酶作用下，用四種dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板 DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫退火和DNA合成這一循環(huán)， 使產(chǎn)物 DNA重復(fù)合成， 并在重復(fù)過程中， 前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA而參與 DNA的合成， 使產(chǎn)物DNA的量按指數(shù)方式擴(kuò)增。經(jīng)過30 40 個循環(huán)， DNA擴(kuò)增即可完成。2. DNA 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。 在一定的電場強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速

3、度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。該電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。三、實(shí)驗(yàn)材料儀器： PCR擴(kuò)增儀、 0.2ul 薄壁管、 1.5ml 離心管、移液槍、槍頭、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、制膠版、紫外透射儀。試劑： TapDNA聚合酶、 dNTP、buffer、兩種引物、 16S 全長 DNA樣本、無菌ddH2O、模板 DNA 、 TBE、瓊脂糖、 EB、顯色劑。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1. PCR 擴(kuò)增本次試驗(yàn)選擇細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。1.1根據(jù)計(jì)算，首先取1.5ml 離心管按照2.5u

4、l 10 Buffer、 1 uldNTP、0.5 ul 341GC、0.5 ul 534、 0.125 ul Taq、19.375u ddH 2O的比例配置足量的PCR反應(yīng)體系。1.2分別向 9 個薄壁管中分別加入24 ul 的反應(yīng)體系，并分別添加8 種不同的模版，并于第9 個薄壁管中加入無菌ddH2O作為陰性對照。1.3將薄壁管放入PCR擴(kuò)增儀中，按照預(yù)定程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中循環(huán)過程需要達(dá)到3040次。程序如下：預(yù)變性：94 3min循環(huán)：94變性 30s55 退火 30s72 延伸 30s末次延伸： 72 5min1.4 PCR 擴(kuò)增完成后，將樣品取出并保存于15環(huán)境中。1 歡迎下載

5、精品文檔2. DNA 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)2.1稱取 0.2g 瓊脂糖粉末，放到一錐形瓶中，加入適量的0.5 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。搖勻，待冷卻至60 左右，在膠液內(nèi)加入適量的EB。2.2取有機(jī)玻璃制膠板槽，在一端插好梳子，在槽內(nèi)緩慢倒入已冷至60左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。2.3待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。2.4在槽內(nèi)加入 0.5 TBE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。取1l緩沖液和 5l待測 DNA樣品混合后，用移液槍滴加至凝膠的加樣孔中。2.5接通電泳儀和電泳槽，并接通電源， 調(diào)節(jié)穩(wěn)壓輸出， 電壓最高不超過5V/cm，

6、開始電泳。點(diǎn)樣端放陰極端。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)電壓使分帶清晰。2.6觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動。當(dāng)其移動至距膠板前沿約1cm處，可停止電泳。2.7在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈，通過觀察孔進(jìn)行觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論如圖所示：從左至右，分別是模版1-8 號，第 9 列為陰性對照。前 8 列均有明顯的條帶出現(xiàn)，而陰性對照無顯示，說明擴(kuò)增整體效果很好。圖中有上下兩條線，上面一條線所覆蓋的條帶基本可以代表擴(kuò)增的產(chǎn)生的片段位置，參照圖可以看出擴(kuò)增片段在 200bp 左右。在第9 個陰性對照的第二條線處可以看到較為模糊的條帶，并非是出現(xiàn)假

7、陰性，而是由于二聚物而產(chǎn)生的條帶。通過該條帶與最右側(cè)的marker 對比可知該片段出現(xiàn)在100bp 左右，并非由于實(shí)驗(yàn)操作等問題而產(chǎn)生的污染。實(shí)驗(yàn)的照片顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果有拖尾現(xiàn)象，但是并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中由于有些試劑加到了管壁上面，并沒有完全加入，可能會出現(xiàn)一些誤差。另外在第1 列條帶中出現(xiàn)了其他的亮帶，可能是由于在前期的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中滴加試劑時由于量過少而進(jìn)行的搖勻和融合等操作產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增，也有可能是因?yàn)槟z板制作過程中梳子的位置不合適或者膠板制作時邊緣處不夠均勻?qū)е庐a(chǎn)生污染。但總體而言， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意。六、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 由于 PCR技術(shù)非常敏感， 可使一個 DNA分子得以擴(kuò)增

8、， 裝有 PCR試劑的離心管打開之前，應(yīng)先在微量離心機(jī)上作瞬間離心使液體沉積于管底。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件，要控制好溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。2. 最好在加完所有其它反應(yīng)成分后才加模板DNA。3. 配瓊脂糖時應(yīng)使其完全溶化后方可制膠。4.EB 具有致癌作用，配制及使用時應(yīng)帶一次性手套。并在專門的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。七、實(shí)驗(yàn)收獲。2 歡迎下載精品文檔1.通過本次實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握了PCR反應(yīng)的基本原理、實(shí)驗(yàn)過程及技術(shù)。2.通過本次實(shí)驗(yàn)掌握了電泳實(shí)驗(yàn)分離DNA的原理和方法。八、思考題1、如果你的研究中要擴(kuò)增大腸桿菌某個酶的基因，你如何進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)？通過 PCR擴(kuò)增出想要的片段，然后通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回收，并與合

9、適的載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切或PCR驗(yàn)證，測序最終驗(yàn)證，保存菌種2. 一對引物序列為5-GACTCCAGTCGAATCTACCA和-35-AACCGTGGCGACACCGCTAA請計(jì)算它們的Tm值及選擇合適的退火溫度，如果按你算的退火溫度做PCR時沒有得到相應(yīng)的產(chǎn)物，你怎么解決？5-GACTCCAGTCGAATCTACCA-3Tm值 =4（ G+C）+2(A+T)-(5 10 )=4（ 3+7） +2（ 6+4） -(5 10 )=60 -(5 10 )=50555-AACCGTGGCGACACCGCTAATm值 =4（ G+C）+2(A+T) -(5 10 )=4(5+7)+2(6+2) -(5 10 )=64 -(5 10 )=5459 因此退火溫度可以選擇在55可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5 ，以2 為增量， 逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5 ，就會令引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低 5 或者