Roche-LightCycler-480-中文操作說(shuō)明

1、Roche-LightCycler-480- 中 文 操作說(shuō)明LightCycler? 480 中文操作說(shuō)明羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司 / 應(yīng)用科學(xué)部門(mén)February 2008LightCycler 480中文操作說(shuō)明目錄一 . 啟動(dòng)機(jī)器與軟件3二 . 軟件設(shè)定 - 開(kāi)啟新實(shí)驗(yàn)5三 . 樣品編輯9四 . 結(jié)果分析12五 . 報(bào)告18六 . 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī) （數(shù)據(jù)輸出與輸入 ） 19七 . 使用者管理19LightCycler 480中文操作說(shuō)明啟動(dòng)機(jī)器與軟件啟動(dòng)機(jī)器1. 機(jī)器主開(kāi)關(guān)位于機(jī)器右后方。2. 機(jī)器正面兩個(gè)警示燈代表機(jī)器狀態(tài)。 待警示燈 （右） 由閃爍橘色燈轉(zhuǎn) 變成穩(wěn)定橘色燈，警示燈 （

2、左） 由橘色轉(zhuǎn)變成綠色 （約三分半鐘 ）， 表示機(jī)器已經(jīng)啟動(dòng)完成。左警示燈右警示燈機(jī)器狀態(tài)橘 * 閃爍 *橘 * 閃爍 *正在初始化綠橘機(jī)器啟動(dòng)完成96/384孔盤(pán)還未放入綠橘 * 閃爍 *96/384 孔盤(pán)正在放入中綠綠機(jī)器啟動(dòng)完成96/384 孔盤(pán)已經(jīng)放入綠 *閃爍 *綠 * 閃爍 *實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中3LightCycler 480中文操作說(shuō)明3. 按壓機(jī)器正面上唯一的按鈕，放入已經(jīng)封膜完成之96或384孔盤(pán)。放置完成后，左右兩警示燈都呈現(xiàn)綠色。啟動(dòng)軟件1.開(kāi)啟計(jì)算機(jī)，并以正確的使用者名稱與密碼登入WindowsoUser name: OPERATOR Password: LC4802.開(kāi)啟Li

3、ghtCycler 480軟件，并輸入正確的使用者與密碼。LoginQPUons | ILightCycler 480中文操作說(shuō)明二軟件設(shè)定一開(kāi)啟新實(shí)驗(yàn)設(shè)定新實(shí)驗(yàn)1.軟件開(kāi)啟后，會(huì)進(jìn)入主畫(huà)面。點(diǎn)選“New Experiment”。7 Lthttyderbottwarerelease 1 .V.U6Z52. 出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)定窗口。任何時(shí)候需要回主畫(huà)面的話，點(diǎn)選畫(huà)面右邊的 按鈕。產(chǎn);打;I 0MC*0 Fmat I. ：L SXMfi X3) I 釈 wock typoRon Moteplus ID IPiOQfjm Mem4- - -ra*in*-.-* .-3-ao&emxtxeg ourv*TS

4、*1Melti&g Curv；AbmCycle*AaMh LINhlTkCQAcquit MonHold pit criiBttl Rafvp RateAcuhitl(m |pe *Q Sec fQ Stop Sue fQ Step OUy (eyelet) WCgtt :0a/ 一設(shè)定實(shí)驗(yàn)若要套用設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)步驟 (Template)，請(qǐng)?zhí)?6.。1. 在實(shí)驗(yàn)設(shè)定畫(huà)面上方，先選擇適當(dāng)?shù)?Detection Format。選項(xiàng)包含 :另外可再點(diǎn)選“Customize”勾 選所需的濾片組合。2. 輸入反應(yīng)體積 : 96 well plate 范圍為 10-100 ul，而 384 well p

5、late 范 圍為 5-20 ul。LightCycler 480中文操作說(shuō)明3. 設(shè)定實(shí)驗(yàn)步驟 (Program)設(shè)定 program，包含有 Pre-incubation, Amplification (PCR), Melting curve (optional) 與 Cooling。利用 +與 增加 或刪除步驟。設(shè)定循環(huán)數(shù)目 (Cycle) 與分析模式。通常 Amplification (PCR) program 設(shè)定成 Quantification，而 Melting Curve program 設(shè)定成 Melting Curve 。4. 設(shè)定詳細(xì)溫度變化 (依照不同實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)而有

6、所不同 )點(diǎn)選各個(gè) program 即可設(shè)定詳細(xì)溫度變化步驟，請(qǐng)根據(jù)產(chǎn)品說(shuō) 明書(shū)來(lái)設(shè)定，利用 +與 增加或刪除步驟。需要設(shè)定 的參數(shù)包含 Target ( ) 目標(biāo)溫度， Acquisition Mode (熒光偵測(cè) 模式)，Hold (hh:mm:ss) 停留時(shí)間。 Ramp Rate (/s) 為升降溫 速度，范圍如下：Ramp Rate ( /s)Heating up Cooling downLightCycler 480中文操作說(shuō)明96-well Block1.0 4.4 /s1.0 2.2 /s384-well Block1.0 4.8 /s1.0 2.5 /s若設(shè)定溫度低于 50，

7、請(qǐng)把 Ramp Rate 調(diào)整成 1.5/s (96 well) 或 2.0/s (384 well)。5. 將實(shí)驗(yàn)步驟儲(chǔ)存成 Template以便下次進(jìn)行套用。點(diǎn)選左下角“Save As Template” 即可把此步驟儲(chǔ)存起來(lái)。6. 若要進(jìn)行套用時(shí)，請(qǐng)直接點(diǎn)選窗口左下角 “Apply Template” ，選擇欲套用之實(shí)驗(yàn)步驟 即可。7. 設(shè)定完成后點(diǎn)選 “Start Run” 開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)8. 跳出檔案儲(chǔ)存窗口，請(qǐng)輸入欲儲(chǔ)存之文件名稱。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中會(huì)進(jìn)入另一個(gè) Data 窗口，窗口下方按鍵功能如下：End Program : 結(jié)束此 Program, 進(jìn)入下一個(gè) Program。+ 10

8、Cycles : 實(shí)時(shí)增加循環(huán)數(shù)目。Abort Run: 馬上結(jié)束此實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)注意，若按此鍵，則此次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將不 儲(chǔ)存。LightCycler 480中文操作說(shuō)明LightCycler 480中文操作說(shuō)明三樣品編輯將樣品分群1. 點(diǎn)選窗口左邊的 “Subset Editor”。2. 點(diǎn)選“New” 新增新的群組，并將其命名。3. 利用鼠標(biāo)選取此群組之樣品位置， 點(diǎn)選窗口右下角 “Apply”，此時(shí) 被選取的樣品位置會(huì)呈現(xiàn)實(shí)心的藍(lán)色，如下圖。4. 以此方式依序?qū)⑺袠悠啡航M編輯完畢。樣品必須分群才能夠獨(dú)立分析，但是樣品是否分群并不影響樣品 的 Cp 值。LightCycler 480中文操作說(shuō)明

9、編輯樣品名稱1. 點(diǎn)選窗口左邊的 “Sample Editor”。2. 輸入每個(gè)位置之樣品名稱 (Name)與重復(fù) (Repl. Of) 。3. 若要更快速輸入，可直接在左邊的圖上點(diǎn)選欲編輯之樣品：若 A1, A2 與 A3 為三重復(fù)，在 A2 與 A3 Repl. Of 字段上都填上 A1 即為三重復(fù)。在編輯過(guò)程中，可利用 Ctrl+C復(fù)制文字， Ctrl +V 貼上文字。LightCycler 480中文操作說(shuō)明4. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析模式，編輯 Abs Quant (絕對(duì)定量 )，Rel Quant (相對(duì) 定量)，或 Genotyping 分頁(yè)，設(shè)定 Sample Type。絕對(duì)定量 (Ab

10、s Quant)：相對(duì)定量 (Rel Quant)：Target: 目標(biāo)基因Reference: 參考基因Unknown:未知濃度樣品Standard: 已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品Calibrator : Control 樣品 Standard : 已知濃度的樣品 Unknown:未知濃度樣品其它分析模式之分頁(yè)在此不贅述，請(qǐng)自行參考 LightCycler 480 Instrument Operator s Mal 。nua5. 若設(shè)定成Standard之樣品請(qǐng)輸入濃度。6. 若想要將此樣品編輯儲(chǔ)存成 Template，可點(diǎn)選窗口左下角 “Save As Template” 即可，下次實(shí)驗(yàn)時(shí)可點(diǎn)選 “Ap

11、ply Template”進(jìn)行套 用。LightCycler 480中文操作說(shuō)明LightCycler 480中文操作說(shuō)明四結(jié)果分析點(diǎn)選左邊的 “Analysis”，選取分析模式，并選擇所需分析之 群組，如下圖：3.3.2.分析模式 說(shuō)明Abs Quant / 2nd Derivative Max Abs Quant / Fit Points Color CompensationGene ScanningGenotypingRelative QuantificationTm Calling絕對(duì)定量 （自動(dòng)法 ）絕對(duì)定量 （手動(dòng)法 ）色差校正 （多色實(shí)驗(yàn)校正用 ） 基因掃描 （適用于 High

12、Resolution Melting Curve, HRM 分析）基因分型 （適用于 HybProbe 之 基因分型實(shí)驗(yàn) ）相對(duì)定量Tm 分析LightCycler 480中文操作說(shuō)明絕對(duì)定量 (Absolute Quantification)1. 點(diǎn)選下方的“Calculate” 即可得到樣品之 Cp 與標(biāo)準(zhǔn)曲線各個(gè)樣品之 Cp 值與濃度重複樣品平均後之 Cp值與濃度 , 並自動(dòng)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差2. 數(shù)值之?dāng)?shù)據(jù)輸出 : 在數(shù)值分析表上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選 “Export”即 可輸出成 .txt 檔案格式?？芍苯右?Microsoft Excel 軟件開(kāi)啟。3. 圖形輸出 : 在圖形上按鼠標(biāo)右鍵，點(diǎn)選

13、“Export” 即可輸出成各種 圖形檔案格式。10LightCycler 480中文操作說(shuō)明相對(duì)定量 (Relative Quantification)1. 在選擇相對(duì)定量分析后，出現(xiàn)下面窗口：Reference Sample Location: 若 Reference (Housekeeping gene) 之樣品在同一盤(pán)上請(qǐng)選擇 “In-Run ”，否則請(qǐng)選擇 “External” 可輸 入另一次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)一起分析。建議將 Auto Pair 打勾讓計(jì)算機(jī)自動(dòng)將樣品配對(duì)。2. 進(jìn)入Target與Reference分頁(yè)，右下角顯示 “Eff = 2 表” 示將目標(biāo)基因與參考基因的 PCR

14、效率以 2.0 來(lái)計(jì)算。3. 若需要校正目標(biāo)基因與參考基因之 PCR 效率，則需要輸入標(biāo)準(zhǔn)曲 線。在Target與Reference分頁(yè)之右下角，輸入 (import) 標(biāo) 準(zhǔn)曲線。11LightCycler 480中文操作說(shuō)明Use in run：輸入 (import) 同一盤(pán)上之標(biāo)準(zhǔn)曲線。Use externa：l 輸入 (import) 之前已儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫(kù)中之標(biāo)準(zhǔn)曲線4. 點(diǎn)選Pairing分頁(yè)，檢查計(jì)算機(jī)自動(dòng)配對(duì)結(jié)果是否正確。其中， 紅色表示 Unknown樣品，綠色表示 Calibrator 樣品。若欲外加配 對(duì)，則可直接以鼠標(biāo)點(diǎn)選樣品后按 “Add” 即可增加配對(duì)。5. 點(diǎn)選Res

15、ults分頁(yè)，點(diǎn)選“Calculate” 即可得到計(jì)算結(jié)果6. 數(shù)值和圖形輸出與絕對(duì)定量相同。 (請(qǐng)參考絕對(duì)定量 )12LightCycler 480中文操作說(shuō)明基因分型 (Genotyping)1. 進(jìn)入基因分型的窗口中2. 窗口右下角可設(shè)定分類方式3. 點(diǎn)選Auto Group：自動(dòng)分組In-run ：標(biāo)準(zhǔn)品包含在本次實(shí)驗(yàn)中External：標(biāo)準(zhǔn)品在之前已儲(chǔ)存之實(shí)驗(yàn)中Calculate” 即可得到分型結(jié)果13LightCycler 480中文操作說(shuō)明Tm 分析 (Tm Calling)1. 進(jìn)入 Tm 分析窗口2. 確認(rèn)波峰數(shù)目3. 選擇檢測(cè)模式4. 點(diǎn)選 “Calculate即可得到每個(gè)樣品之 Tm 值14LightCycler 480中文操作說(shuō)明五報(bào)告 (Report)1. 將分析后結(jié)果儲(chǔ)存后即可點(diǎn)選報(bào)告鍵報(bào)告2. 勾選想要呈現(xiàn)的報(bào)告內(nèi)容。3. 點(diǎn)選“Generate” 即可產(chǎn)生報(bào)告。4. 點(diǎn)選“PDF” 即可將此報(bào)告儲(chǔ)存成 .pdf 檔案格式15LightCycler 480中文操作說(shuō)明六數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至其它計(jì)算機(jī)(數(shù)據(jù)輸出與輸入 )數(shù)據(jù)輸出1. 點(diǎn)選 (naviga