MicroRNA―146a調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制

1、MicroRNA 146a 調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制DOI： 10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.04.017基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) （81060152）;國(guó)家自然科學(xué)基 金青年基金（ 81101410）作者單位： 276003 山東省臨沂，臨沂市人民醫(yī)院重癥 醫(yī)學(xué)科（張建國(guó)、陳曉娟） ;南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué) 科（丁成志、邵強(qiáng)、曾振國(guó)、劉芬、錢克儉）通信作者：錢克儉， Email： qkj0607 microRNA 是一類大小約 22 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的內(nèi)源性非編 碼小分子RNA1,主要通過(guò)識(shí)別并結(jié)合靶基因mRNA的3端非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白的

2、翻譯或促進(jìn)靶基因的 降解2-3。有研究發(fā)現(xiàn)微小 RNA參與肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控4, miR-146a 是其中較有代表性的一個(gè)。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞，miR-146a的表達(dá)水平升高，并且升高程度與TNF-a mRNA呈負(fù)相關(guān)5;轉(zhuǎn)染miR-146a能下調(diào) LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞 TNF-a的表達(dá)6,表明miR-146a能抑 制LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討 miR-146a 調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制， 為體內(nèi)試驗(yàn)提 供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料大鼠肺泡巨噬細(xì)胞 NR8383 （上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；LPS（E.coli 0111

3、: B4） ;Pre-miR^TM miR-146a 前體、 CyTM3 標(biāo)記的Pre-miR^TM陰性對(duì)照（美國(guó) ABI 公司）； 大鼠TNF-a ELISA檢測(cè)試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公 司） ; PrimeScript^？ 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、 SYBR熒光染料試劑 H（SYBR^? PremixEx Taq^T M n） PCR 檢測(cè)試劑盒（大 連寶生物工程有限公司）

4、 ;抗 IRAK-1 抗體，抗 TRAF-6 抗體、 抗NF - k B p65抗體（美國(guó) abeam公司）。1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理將體外培養(yǎng)的 NR8383細(xì)胞按每孔1.5X10⁶個(gè)接種至 6 孔板，每孔 2 mL,每 組 2 個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染 50 nmol/L 的Pre-miR^TM miR-146a 前體，對(duì)照組轉(zhuǎn) 染 50 nmol/L 的 CyTM3 標(biāo)記的Pre-miR^TM 陰性對(duì)照，搖勻后繼續(xù)培 養(yǎng)24 h，隨后加入1卩g/mL終質(zhì)量濃度的

5、LPS處理細(xì)胞6 h,離心收集細(xì)胞和上清液，-80 C保存。1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法1.3.1 免疫熒光法觀察 NF-k B p65 核移位情況 將細(xì)胞 爬片放置于 24 孔板;甲醇丙酮固定細(xì)胞， 0.5%TritonX-100 PBS 透化細(xì)胞；再放入含10%驢血清的PBS中4 C封閉;孵育一 抗：用 0.5%TritonX-100 PBS稀釋兔抗 NF-k B p65 (1 : 50), 常溫下孵育 4 h 后漂洗 ;孵育二抗：用 10%驢血清的 PBS 稀 釋Alexa Flour 488驢抗兔綠色熒光標(biāo)記二抗(1 : 200),室 溫下孵育 20 min 后漂洗 ;用 Dapi 染核，滴

6、加防熒光粹滅劑、 固定封片，在 Olympus IS71 倒置熒光顯微鏡下拍照分析。132 ELISA檢測(cè)TNF-a蛋白含量 收集細(xì)胞上清液，按 照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書步驟操作檢測(cè)TNF-a蛋白含量。1.3.3 RT-qPCR 檢測(cè) IRAK-1、TRAF-6 及 TNF-a mRNA 表 達(dá)采用TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 完整性及 純度。按照 PrimeScript^？ 逆轉(zhuǎn)錄試 劑盒說(shuō)明書操作，所有操作均在冰上完成。10卩L的逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)體系：PrimeScrip

7、t緩沖液 2卩L, PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶 復(fù)合物10.5卩L,多聚胸腺嘧啶引物0.5卩L,隨機(jī)的6核苷酸引物 0.5卩L,總RNA 500 ng,加無(wú)核酶水至總體積10卩 L。反應(yīng)條件：37 C 15 min, 85 C 5 s。20 卩 L 的 PCR 反應(yīng)體系包括：cDNA 2卩L,上游引物0.8卩L,下游引物0.8 叢 L, SYBR^? Premix ExTaq^TMn 10L, ROX Reference Dye 0.4卩L,無(wú)核酶水 6卩L。反應(yīng)條件：95 C 30 min , 40

8、個(gè) 擴(kuò)增循環(huán)(95 C 5 s, 57 C 20 s, 72 C 27 s)。選取 B -actin 作為內(nèi)參，檢測(cè) IRAK-1 mRNATRAF-6 mRNA及 TNF-a mRNA 的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量采用 2^{- Ct}計(jì) 算。引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表 1 。1.3.4 IRAK-1、TRAF-6 NF-k B p65 蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞， 離心,棄上清,提取總蛋白或分別提取胞核蛋白、漿蛋白, 用BCA法測(cè)定蛋白濃度。完成聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔加 樣20卩L)、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗，兔抗IRAK-1(1 : 2000)、 兔抗 TRAF-6 (1 ：

9、 1000)、兔抗 NF-k B p65 (1 : 500)和鼠 抗 B -actin (1 : 3000) /兔抗 Lamin B1 (1 : 1000), 4 C孵 育過(guò)夜, 漂洗 3 次;孵育二抗, 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗 兔IgG、山羊抗鼠IgG (1 : 4000), 37 C孵育1-2 h,漂洗 3 次，暗室內(nèi)曝光、 顯影并定影， 行 X 膠片掃描，通過(guò) Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)IRAK-1、TRAF-6及胞漿NF-k B p65 蛋白以 B -actin 作為內(nèi)參, 細(xì)胞核內(nèi) NF-k B p65 蛋 白以 Lamin B1 作為內(nèi)參。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

10、采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(x s)表示，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 過(guò)表達(dá) miR-146a 對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 NR8383 細(xì)胞NF-K B p65核移位的影響2.1.1免疫熒光法觀察細(xì)胞NF-k B p65核移位的變化倒置熒光顯微鏡下觀察到 NF-K B p65 呈綠色熒光， Dapi 染 核后呈藍(lán)色熒光。 與對(duì)照組比較， 觀察到轉(zhuǎn)染組 NF-K B p65 胞核中表達(dá)減少，胞漿中增多。見(jiàn)圖 1 。2.1.2 Western bloting 檢測(cè)細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi) NF-K B p65 蛋白的表達(dá)變化 與

11、各自對(duì)照組比較， 轉(zhuǎn)染組胞核中 NF- k B p65蛋白含量降低至 (0.56 0.12)倍，P<0.05;胞漿中 增加為( 1.74 0.11)倍， P<0.05 。見(jiàn)圖 2。2.2過(guò)表達(dá) miR-146a對(duì)LPS刺激的NR8383細(xì)胞 TNF-a表達(dá)的影響與對(duì)照組相比較， RT-qPCR檢測(cè)NR8383細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a 后 TNF-a mRNA 表達(dá)下調(diào)至(0.47土 0.06)倍 (P<0.05 ) ;ELISA 檢測(cè) TNF-a 蛋白表達(dá)也明顯下降 (211.5 30.39) pg/mL vs.(616.6 42.28) pg/mL， P <0.01

12、。見(jiàn) 圖3。2.3過(guò)表達(dá) miR-146a對(duì)LPS刺激的NR8383細(xì)胞IRAK-1和TRAF-6蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較， 過(guò)表達(dá) miR-146a 后，轉(zhuǎn)染組 IRAK-1 mRNA 增加為(1.16 0.1 )倍,TRAF-6 mRNA增加為(1.19 0.16) 倍，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05) ;轉(zhuǎn)染組 IRAK-1 蛋白 下降為(0.73 0.05)倍， TRAF-6 蛋白下降為 (0.64 0.09)倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05 )。見(jiàn)圖 4。3 討論miR-146a 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的微小RNA,當(dāng)機(jī)體存在有感染、腫瘤時(shí) miR-1

13、46a表達(dá)上調(diào)7-9, 上調(diào)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞( THP-1 細(xì)胞)的 miR-146a 后 將負(fù)性調(diào)控炎癥因子的釋放10。研究證實(shí)在 LPS誘導(dǎo)的肺 泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中 miR-146a 表達(dá)上調(diào) ;本研究發(fā)現(xiàn)過(guò) 表達(dá) miR-146a后，用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞，NF-k B核移位受到抑制，TNF-a mRNA表達(dá)下降，上清液中TNF-a蛋白含量也明顯下降， 提示 miR-146a 能夠抑制 LPS 誘導(dǎo)的 肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。筆者進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá) miR-146a 后， IRAK-1 mRNA 和 TRAF-6 mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯變化，而 IRAK-1 和 TRAF-6

14、蛋白表達(dá)下降。 Taganov 等11研究發(fā)現(xiàn) LPS 刺激 THP-1 細(xì)胞后， miR-146a 表達(dá)上調(diào)， 并通過(guò)突變?cè)囼?yàn)和熒光 素酶報(bào)道基因試驗(yàn)證實(shí)， miR-146a 的靶基因是 TLRs/NF-k B 通路中的兩個(gè)接頭蛋白編碼基因IRAK-1 和 TRAF-6。 TLRs/NF-k B 是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，當(dāng) LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞，可 與細(xì)胞膜表面 TLR4 結(jié)合，導(dǎo)致 IRAK-1 自身磷酸化，繼而 活化TRAF-6,使其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B活化激酶1 (TAK)及TAKI的結(jié)合蛋白(TAB形成復(fù)合物，導(dǎo)致Ik B磷酸化和降解，最終使 NF-k B 移位進(jìn)入核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)

15、錄翻譯生成TNF-a炎癥因子12-13。有研究表明過(guò)表達(dá)IRAK-1能夠使 HEK293細(xì)胞和 THP-1細(xì)胞中NF-k B呈劑量依賴 性增加，同時(shí) TNF-a也增加，而敲除IRAK-1基因能降低 LPS 誘導(dǎo)的 THP-1 細(xì)胞 14-15 炎癥反應(yīng) ;同樣過(guò)表達(dá)或者敲 除 TRAF-6 也產(chǎn)生相同的作用。參考文獻(xiàn)1 Carthew RW ， Sontheimer EJ. Origins and mechanismsof miRNAs and siRNAsJ. Cel，l 2009，136（4）：642-655.2 Lewis BP， Burge CB， Bartel DP. Conserv

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