PCR擴增的原理和操作步驟

1、PCR擴增反應(yīng)的操作第一節(jié) PCR擴增反應(yīng)的基本原理一、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）的基本構(gòu)成PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)的簡稱，指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴增DNA片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。PCR基本原理: 是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在模板3末端有引物存在的情況下，用酶進行互補鏈的延伸，多次反復(fù)的循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴增。在微量離心管中，加入與待擴增的DNA片段兩端已知序列分別互補的兩個引物、適量的緩沖液、微量的DNA膜板

2、、四種dNTP溶液、耐熱Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反應(yīng)時先將上述溶液加熱，使模板DNA在高溫下變性，雙鏈解開為單鏈狀態(tài)；然后降低溶液溫度，使合成引物在低溫下與其靶序列配對，形成部分雙鏈，稱為退火；再將溫度升至合適溫度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，該片段又可作為下一輪反應(yīng)的模板，如此重復(fù)改變溫度，由高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸組成一個周期，反復(fù)循環(huán)，使目的基因得以迅速擴增。因此PCR循環(huán)過程為三部分構(gòu)成：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當溫度下催化DNA鏈延伸合成（見圖）。1模板DNA的變性模板DNA加熱到9095時

3、，雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，稱為DNA的變性，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備。變性溫度與DNA中G-C含量有關(guān)，G-C間由三個氫鍵連接，而A-T間只有兩個氫鍵相連，所以G-C含量較高的模板，其解鏈溫度相對要高些。故PCR中DNA變性需要的溫度和時間與模板DNA的二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、G-C含量高低等均有關(guān)。對于高G-C含量的模板DNA在實驗中需添加一定量二甲基亞砜（DMSO），并且在PCR循環(huán)中起始階段熱變性溫度可以采用97，時間適當延長，即所謂的熱啟動。2模板DNA與引物的退火將反應(yīng)混合物溫度降低至3765時，寡核苷酸引物與單鏈模板雜交，形成DNA模板-引物復(fù)合物。退火所需要的

4、溫度和時間取決于引物與靶序列的同源性程度及寡核苷酸的堿基組成。一般要求引物的濃度大大高于模板DNA的濃度，并由于引物的長度顯著短于模板的長度，因此在退火時，引物與模板中的互補序列的配對速度比模板之間重新配對成雙鏈的速度要快得多，退火時間一般為12min。3引物的延伸DNA模板-引物復(fù)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。在72條件下，Taq DNA聚合酶催化的合

5、成速度大約為4060個堿基/秒。經(jīng)過一輪“變性-退火-延伸”循環(huán)，模板拷貝數(shù)增加了一倍。在以后的循環(huán)中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一輪循環(huán)以后，DNA拷貝數(shù)就增加一倍。每完成一個循環(huán)需24min，一次PCR經(jīng)過3040次循環(huán)，約23h。擴增初期，擴增的量呈直線上升，但是當引物、模板、聚合酶達到一定比值時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，便出現(xiàn)所謂的“平臺效應(yīng)”，即靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加。PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用Y（1X）n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平（Y）均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為1

6、00%，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5

7、端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈（即“長產(chǎn)物片段”）結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。變性延伸退火圖 PCR的反應(yīng)歷程二、PCR反應(yīng)的五個元素參與PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要為五種：引物、酶、dNTP、模板

8、和Mg2+。1引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯配）。引物的選擇將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴增區(qū)域的Tm值這個和擴增物產(chǎn)量有關(guān)的重要物理參數(shù)。好的引物設(shè)計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設(shè)計也極大的影響擴增

9、產(chǎn)量：若使用設(shè)計粗糙的引物，產(chǎn)物將很少甚至沒有；而使用正確設(shè)計的引物得到的產(chǎn)物量可接近于反應(yīng)指數(shù)期的產(chǎn)量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。（1）引物長度PCR特異性一般通過引物長度和退火溫度來控制。引物的長度一般為15-30bp，常用的是1827bp，但不應(yīng)大于38bp。引物過短時會造成Tm值過低，在酶反應(yīng)溫度時不能與模板很好的配對；引物過長時又會造成Tm值過高，超過酶反應(yīng)的最適溫度，還會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，

10、不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)，而且合成長引物還會大大增加合成費用。（2）引物堿基構(gòu)成引物的G+C含量以4060%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。（3）引物二級結(jié)構(gòu)引物二級結(jié)構(gòu)包括

11、引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對于引物的3末端形成的二聚體，應(yīng)控制其G大于-5.0 kcal/mol或少于三個連續(xù)的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性，引物中間或5端的要求可適當放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，也以3端或近3端對引物-模板結(jié)合影響更大；影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。（4）引物3端序列引物3末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的，而引物3末端最后5到6個核苷酸的錯配應(yīng)盡可能的少。如果3末端的錯

12、配過多，通過降低反應(yīng)的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應(yīng)幾乎注定要失敗。引物3末端的另一個問題是防止一對引物內(nèi)的同源性。應(yīng)特別注意引物不能互補，尤其是在3末端。引物間的互補將導(dǎo)致不想要的引物雙鏈體的出現(xiàn)，這樣獲得的PCR產(chǎn)物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產(chǎn)物和天然模板之間產(chǎn)生競爭PCR狀態(tài)，從而影響擴增成功。引物3末端的穩(wěn)定性由引物3末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的G。G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，此值的大小對擴增有較大的影響。應(yīng)當選用3端G值較低（絕對值不超過9），負值大，則3末端穩(wěn)定性高，擴增效率更高。引物的3端的

13、G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。需要注意的是，如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。另外末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3端使用堿基A。（5）引物的5端引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。對于引入一至兩個酶切位點，應(yīng)在后續(xù)方案設(shè)計完畢后確定，便于后期的克隆實驗，特別是在

14、用于表達研究的目的基因的克隆工作中。（6）引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源，特別是與待擴增的模板DNA之間要沒有明顯的相似序列。2酶及其濃度Taq DNA多聚酶是耐熱DNA聚合酶，是從水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中分離的。Taq DNA聚合酶是一個單亞基，分子量為94 000 Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，無3-5的外切核酸酶活力，會在3末端不依賴模板加入1個脫氧核苷酸（通常為A，故PCR產(chǎn)物克隆中有與之匹配的T載體），在體外實驗中，Taq DNA聚合酶的出錯率為10-410-5。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的

15、被應(yīng)用。此酶具有以下特點：（1）耐高溫，在70下反應(yīng)2小時后其殘留活性在90%以上，在93下反應(yīng)2小時后其殘留活性是仍能保持60%，而在95下反應(yīng)2小時后為原來的40%。（2）在熱變性時不會被鈍化，故不必在擴增反應(yīng)的每輪循環(huán)完成后再加新酶。（3）一般擴增的PCR產(chǎn)物長度可達2.0 kb，且特異性也較高。PCR的廣泛應(yīng)用得益于此酶，目前各試劑公司中開發(fā)了多種類型的Taq酶，有用于長片段擴增的酶，擴增長度極端可達40kb；有在常溫條件下即可應(yīng)用的常溫PCR聚合酶；還有針對不同實驗對象的酶等。一典型的PCR反應(yīng)約需的酶量為2.5u（總反應(yīng)體積為50ml時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成

16、產(chǎn)物量減少。3dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200mmol/l，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。4模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，

17、是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑（酚與氯仿抽）抽提除去蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸，該核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。模板DNA投入量對于細菌基因組DNA一般在110ng/ml，實驗中模板濃度常常需要優(yōu)化，一般可選

18、擇幾個濃度梯度（濃度差以10倍為一個梯度）。在PCR反應(yīng)中，過高的模板投入量往往會導(dǎo)致PCR實驗的失敗。5Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200mmol/l時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/l為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。一般廠商提供的Taq DNA聚合酶均有相應(yīng)的緩沖液，而Mg2+也已添加，如果特殊實驗應(yīng)采用無Mg2+的緩沖液，在PCR反應(yīng)體系中添加一定量的Mg2+。三、PCR反應(yīng)特點PCR反應(yīng)具有以下特點：1強特異性PCR反應(yīng)的特異性

19、決定因素為：（1）引物與模板DNA特異性的結(jié)合；（2）堿基配對原則；（3）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；（4）靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵，引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2高靈敏度PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克（pg=10-12g）量級的起始待測模板擴增到微克（mg = 10-6g）水平。能從1

20、00萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU（空斑形成單位）；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。3快速簡便PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在PCR儀上進行變性退火延伸反應(yīng)，反應(yīng)一般在24小時完成。擴增產(chǎn)物常用電泳分析，操作簡單易推廣，如采用特殊PCR儀（熒光時時定量PCR儀）則可全程監(jiān)測PCR反應(yīng)的結(jié)果，故耗時將更短。4低純度模板不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及總RNA等均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。第二節(jié) PCR擴增反應(yīng)的實施一、PCR反應(yīng)的條件

21、PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。1溫度與時間的設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。（1）變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394 lmin足以使模板DNA變性，若

22、低于93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。（2）退火（復(fù)性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=

23、Tm值-(510)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。（3）延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080，150核苷酸/S/酶分子；70，60核苷酸/S/酶分子；55，24核苷酸/S/酶分子；高于90時，DNA合成幾乎不能進行。（4）PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。34kb的靶序列需34mi

24、n；擴增10kb需延伸至15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。2循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度，一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。二、PCR擴增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。1凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對引

25、物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。（1）瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用12%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳：610%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。2酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。3分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。4Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可

26、以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。5斑點雜交：將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。6核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。三、PCR結(jié)果異常分析PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有： 模板核酸的制備； 引物的質(zhì)量與特異性； 酶的質(zhì)量及活性； PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。（1）模板： 模板中含有雜蛋白質(zhì)； 模板中含有Taq酶抑制

27、劑； 模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白； 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚； 模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。（2）酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。（3）引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為： 選定

28、一個好的引物合成單位。 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。（4）Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。（5）反應(yīng)體積的改變：通常

29、進行PCR擴增采用的體積為20ml、30ml、50ml或100ml,用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ml后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。（6）物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。（7）靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去

30、互補序列，其PCR擴增是不會成功的。2假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高?？赡艿脑蚴牵海?）引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。（2）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決： 操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。 必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。3出現(xiàn)