制備液相色譜技術(shù)(LC-MS)[理論實(shí)操]

1、高效制備液相色譜技術(shù)高效制備液相色譜技術(shù) 1行業(yè)進(jìn)步 高效制備液相色譜的原理：高效制備液相色譜的原理： 色譜分離原理無論是分析型色譜還是制備型色譜都是相同的，色譜分離原理無論是分析型色譜還是制備型色譜都是相同的， 那就是那就是。 但是在理論的遵循上，制備型有時(shí)需打折扣。但是在理論的遵循上，制備型有時(shí)需打折扣。 這是由于兩種類型的色譜最終的目的是不同的。這是由于兩種類型的色譜最終的目的是不同的。 分析型色譜：分離度高，靈敏度高，以含量測(cè)定為目的。分析型色譜：分離度高，靈敏度高，以含量測(cè)定為目的。 制備型色譜：要求純度、產(chǎn)量和收益。制備型色譜：要求純度、產(chǎn)量和收益。 2行業(yè)進(jìn)步 經(jīng)典的制備色譜方法

2、與高效制備液相色譜的異同經(jīng)典的制備色譜方法與高效制備液相色譜的異同 及優(yōu)缺點(diǎn)：及優(yōu)缺點(diǎn)： 相同：目的相同；某些方法原理也相同。相同：目的相同；某些方法原理也相同。 不同：自動(dòng)化程度不同，效率不同，分離復(fù)雜化不同：自動(dòng)化程度不同，效率不同，分離復(fù)雜化 合物的能力不同。合物的能力不同。 經(jīng)典制備色譜方法：柱色譜、薄層色經(jīng)典制備色譜方法：柱色譜、薄層色 譜譜 3行業(yè)進(jìn)步 4行業(yè)進(jìn)步 5行業(yè)進(jìn)步 6行業(yè)進(jìn)步 高效制備液相色譜高效制備液相色譜 優(yōu)點(diǎn)：效率高，收率相對(duì)較高，特別適合復(fù)雜樣品、優(yōu)點(diǎn)：效率高，收率相對(duì)較高，特別適合復(fù)雜樣品、 性質(zhì)接近化合物的純化。純化效果理想。性質(zhì)接近化合物的純化。純化效果理

3、想。 缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜昂貴，投資大，運(yùn)行費(fèi)用較高。缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜昂貴，投資大，運(yùn)行費(fèi)用較高。 經(jīng)典制備色譜方法經(jīng)典制備色譜方法 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 設(shè)備簡(jiǎn)單，投資小，見效快。能滿足一般樣設(shè)備簡(jiǎn)單，投資小，見效快。能滿足一般樣 品的品的 純化要求。純化要求。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 效率低下，收率低，對(duì)于過于復(fù)雜的化合物，效率低下，收率低，對(duì)于過于復(fù)雜的化合物， 純化效果不理想。純化效果不理想。 7行業(yè)進(jìn)步 制備液相色譜又稱純化系統(tǒng)，是目前高效制備液相色譜又稱純化系統(tǒng)，是目前高效 率制備純化合物最有力的方法，廣泛應(yīng)用于：率制備純化合物最有力的方法，廣泛應(yīng)用于： 1.天然產(chǎn)物的分離與純化天然產(chǎn)物的分離與純化 2.合

4、成藥物的純化合成藥物的純化 3.合成反應(yīng)中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物的制備合成反應(yīng)中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物的制備 4.手性藥物的分離與純化手性藥物的分離與純化 5.藥物雜質(zhì)的分離制備藥物雜質(zhì)的分離制備 . . . . . . 8行業(yè)進(jìn)步 9行業(yè)進(jìn)步 重復(fù)性重復(fù)性 10行業(yè)進(jìn)步 選擇性要求選擇性要求 11行業(yè)進(jìn)步 色譜柱吸附等溫線色譜柱吸附等溫線 正常載荷正常載荷(loading)： 12行業(yè)進(jìn)步 色譜柱吸附等溫線色譜柱吸附等溫線 超載超載(overloading)： 13行業(yè)進(jìn)步 純度（純度（purity)、產(chǎn)量（、產(chǎn)量（throughput） 和收益（和收益（yield）（）（PTY）三者的關(guān)系）三者的關(guān)系 1

5、4行業(yè)進(jìn)步 濃度過載和體積過載濃度過載和體積過載 濃度過載濃度過載體積過載體積過載 決定于流動(dòng)相中的溶解度；決定于流動(dòng)相中的溶解度； 位于吸附等溫線的位于吸附等溫線的“制備制備”區(qū)區(qū) 域；域； 產(chǎn)量由選擇性決定；產(chǎn)量由選擇性決定； 固定相顆粒大小影響較低。固定相顆粒大小影響較低。 決定于進(jìn)樣體積；決定于進(jìn)樣體積； 位于吸附等溫線的位于吸附等溫線的“分析分析”區(qū)區(qū) 域；域； 產(chǎn)量由柱子的直徑?jīng)Q定；產(chǎn)量由柱子的直徑?jīng)Q定； 固定相顆粒需要小一些。固定相顆粒需要小一些。 通常濃度過載和體積過載結(jié)合著使用。而由于通常濃度過載和體積過載結(jié)合著使用。而由于 產(chǎn)量較高的緣故，因而更喜歡使用濃度過載。產(chǎn)量較高的

6、緣故，因而更喜歡使用濃度過載。 15行業(yè)進(jìn)步 濃度過載和體積過載色譜示意圖濃度過載和體積過載色譜示意圖 16行業(yè)進(jìn)步 什么時(shí)候使用濃度過載什么時(shí)候使用濃度過載? 什么時(shí)候使用體積過載什么時(shí)候使用體積過載? 一 般 情 況 下 ， 由 于 需 要 有 較 大 的一 般 情 況 下 ， 由 于 需 要 有 較 大 的 throughput，所以濃度過載使用較多，但當(dāng)，所以濃度過載使用較多，但當(dāng) 樣品濃度過稀，又沒有合適的方法濃縮時(shí)或樣品濃度過稀，又沒有合適的方法濃縮時(shí)或 流動(dòng)相溶解樣品的能力較弱時(shí)，這時(shí)就應(yīng)當(dāng)流動(dòng)相溶解樣品的能力較弱時(shí)，這時(shí)就應(yīng)當(dāng) 使用體積過載。使用體積過載。 17行業(yè)進(jìn)步 由分析

7、型色譜如何擴(kuò)展到制備型色譜？由分析型色譜如何擴(kuò)展到制備型色譜？ 擴(kuò)展計(jì)擴(kuò)展計(jì) 算算 18行業(yè)進(jìn)步 擴(kuò)展計(jì)算擴(kuò)展計(jì)算 19行業(yè)進(jìn)步 擴(kuò)展計(jì)算舉例擴(kuò)展計(jì)算舉例 r1=1.5mm, r2=10.6mm, V1=0.6mL/min V2=? 計(jì)算結(jié)果：計(jì)算結(jié)果：30mL/min 20行業(yè)進(jìn)步 =30ml/min 擴(kuò)展計(jì)算舉例擴(kuò)展計(jì)算舉例 ? 計(jì)算結(jié)果計(jì)算結(jié)果25mg 21行業(yè)進(jìn)步 0.35mL/min流速下的色譜圖流速下的色譜圖 （分析型）（分析型） 22行業(yè)進(jìn)步 經(jīng)擴(kuò)展計(jì)算，采用不同的柱徑、進(jìn)樣量和流速樣品的色譜圖經(jīng)擴(kuò)展計(jì)算，采用不同的柱徑、進(jìn)樣量和流速樣品的色譜圖 23行業(yè)進(jìn)步 上述五種色譜狀態(tài)的

8、參數(shù)：上述五種色譜狀態(tài)的參數(shù)： 24行業(yè)進(jìn)步 在分析型色譜柱上，不同進(jìn)樣量的色譜圖在分析型色譜柱上，不同進(jìn)樣量的色譜圖 25行業(yè)進(jìn)步 在制備型色譜柱上的色譜圖在制備型色譜柱上的色譜圖 26行業(yè)進(jìn)步 制備液相餾分收集的三種方式制備液相餾分收集的三種方式 1. 基于時(shí)間（基于時(shí)間（Time-based） 2. 基于峰（基于峰（peak-based） 3. 基于質(zhì)量（基于質(zhì)量（Mass-based） 27行業(yè)進(jìn)步 基于時(shí)間（基于時(shí)間（Time-based） 根據(jù)餾分的保留時(shí)間及其色譜峰寬，根據(jù)餾分的保留時(shí)間及其色譜峰寬， 以時(shí)間作為餾分收集器動(dòng)作的指令參數(shù)。以時(shí)間作為餾分收集器動(dòng)作的指令參數(shù)。 特點(diǎn)

9、：特點(diǎn)： 參數(shù)設(shè)置方便，樣品收益高、損失少。參數(shù)設(shè)置方便，樣品收益高、損失少。 色譜保留時(shí)間的不穩(wěn)定會(huì)影響到餾分色譜保留時(shí)間的不穩(wěn)定會(huì)影響到餾分 的純度和收益。的純度和收益。 28行業(yè)進(jìn)步 Time-based 用峰的時(shí)間分割，按峰收集餾分用峰的時(shí)間分割，按峰收集餾分 色譜峰重疊嚴(yán)重，重疊面積很大，收集到的色譜峰重疊嚴(yán)重，重疊面積很大，收集到的 兩個(gè)餾分將明顯不純。這時(shí)應(yīng)考慮使用兩個(gè)餾分將明顯不純。這時(shí)應(yīng)考慮使用 Time-based。 29行業(yè)進(jìn)步 Time-based 30行業(yè)進(jìn)步 基于峰（基于峰（Peak-based） 根據(jù)色譜峰的正負(fù)斜率，觸發(fā)餾分收集器，根據(jù)色譜峰的正負(fù)斜率，觸發(fā)餾分

10、收集器， 以色譜峰正負(fù)斜率作為餾分收集器動(dòng)作的指令以色譜峰正負(fù)斜率作為餾分收集器動(dòng)作的指令 參數(shù)。參數(shù)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 餾分純度高。餾分純度高。 餾分保留時(shí)間的不穩(wěn)定不會(huì)影響到餾分的餾分保留時(shí)間的不穩(wěn)定不會(huì)影響到餾分的 純度。純度。 參數(shù)設(shè)置不方便（斜率參數(shù)需計(jì)算）；受參數(shù)設(shè)置不方便（斜率參數(shù)需計(jì)算）；受 色譜峰峰形改變的影響較大。色譜峰峰形改變的影響較大。 樣品收益低。樣品收益低。 31行業(yè)進(jìn)步 利用正、負(fù)斜率按峰進(jìn)行餾分收集。利用正、負(fù)斜率按峰進(jìn)行餾分收集。 Peak-based 設(shè)置閾值的目的是為了消除噪聲的影響。設(shè)置閾值的目的是為了消除噪聲的影響。 32行業(yè)進(jìn)步 33行業(yè)進(jìn)步 Peak

11、-basedPeak-based實(shí)例實(shí)例（只收集后面這一組分）（只收集后面這一組分） 34行業(yè)進(jìn)步 基于質(zhì)量（基于質(zhì)量（Mass-based） 根據(jù)餾分的質(zhì)量作為指令參數(shù)，觸發(fā)餾根據(jù)餾分的質(zhì)量作為指令參數(shù)，觸發(fā)餾 分收集器。分收集器。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 餾分純度高、且收益高；餾分純度高、且收益高； 餾分保留時(shí)間以及色譜峰峰形改變都不會(huì)餾分保留時(shí)間以及色譜峰峰形改變都不會(huì) 影響到餾分的純度；影響到餾分的純度； 參數(shù)設(shè)置方便；參數(shù)設(shè)置方便； 需配備需配備MS檢測(cè)器，設(shè)備費(fèi)用投入較大。檢測(cè)器，設(shè)備費(fèi)用投入較大。 35行業(yè)進(jìn)步 Mass-based 當(dāng)使用按質(zhì)量進(jìn)行餾分收集時(shí)，只有當(dāng)當(dāng)使用按質(zhì)量進(jìn)行餾分收

12、集時(shí)，只有當(dāng) MSD檢測(cè)到色譜峰含有目標(biāo)質(zhì)量數(shù)，且該目檢測(cè)到色譜峰含有目標(biāo)質(zhì)量數(shù)，且該目 標(biāo)質(zhì)量數(shù)的強(qiáng)度超出特定的閾值時(shí)，餾分收標(biāo)質(zhì)量數(shù)的強(qiáng)度超出特定的閾值時(shí)，餾分收 集才被觸發(fā)。這就確保了在每次進(jìn)樣中只收集才被觸發(fā)。這就確保了在每次進(jìn)樣中只收 集含目標(biāo)化合物的餾分。大部分情況下只有集含目標(biāo)化合物的餾分。大部分情況下只有 一個(gè)餾分。一個(gè)餾分。 不足之處是注入的其他樣品組分不能回不足之處是注入的其他樣品組分不能回 收。收。 36行業(yè)進(jìn)步 按質(zhì)量數(shù)進(jìn)行餾分收集的結(jié)果按質(zhì)量數(shù)進(jìn)行餾分收集的結(jié)果 37行業(yè)進(jìn)步 三種餾分收集方式的比較三種餾分收集方式的比較 X-Based餾分純度餾分純度餾分收益餾分收益

13、 Time不高不高高高 Peak高高不高不高 Mass高高高高 38行業(yè)進(jìn)步 它們與純度、產(chǎn)量和收益（它們與純度、產(chǎn)量和收益（PTY）的關(guān)）的關(guān) 系怎樣？系怎樣？ 結(jié)合實(shí)際需求合理選擇結(jié)合實(shí)際需求合理選擇。 三種餾分收集方式如何選擇？三種餾分收集方式如何選擇？ 39行業(yè)進(jìn)步 40行業(yè)進(jìn)步 41行業(yè)進(jìn)步 42行業(yè)進(jìn)步 43行業(yè)進(jìn)步 44行業(yè)進(jìn)步 高效制備液相色譜流路示意圖高效制備液相色譜流路示意圖 45行業(yè)進(jìn)步 1、延遲體積校正、延遲體積校正 2、擴(kuò)散影響、擴(kuò)散影響 兩個(gè)問題：兩個(gè)問題： 46行業(yè)進(jìn)步 什么是延遲體積？什么是延遲體積？ 理想情況下，當(dāng)檢測(cè)器檢測(cè)到組分信號(hào)理想情況下，當(dāng)檢測(cè)器檢測(cè)到

14、組分信號(hào) 時(shí)，同一時(shí)刻，組分也被餾分收集器收集到。時(shí)，同一時(shí)刻，組分也被餾分收集器收集到。 實(shí)際情況下，這是做不到的，因?yàn)榇嬖趯?shí)際情況下，這是做不到的，因?yàn)榇嬖?一個(gè)延遲體積。一個(gè)延遲體積。 延遲體積：檢測(cè)池到餾分收集器之間管延遲體積：檢測(cè)池到餾分收集器之間管 路的體積。路的體積。 47行業(yè)進(jìn)步 高效制備液相色譜流路示意圖高效制備液相色譜流路示意圖 48行業(yè)進(jìn)步 延遲體積校正延遲體積校正 后運(yùn)行時(shí)間：是指分析物組分從檢測(cè)池到后運(yùn)行時(shí)間：是指分析物組分從檢測(cè)池到 餾分收集器所用的時(shí)間。餾分收集器所用的時(shí)間。 為了準(zhǔn)確地觸發(fā)餾分收集器的啟動(dòng)和停止，為了準(zhǔn)確地觸發(fā)餾分收集器的啟動(dòng)和停止， 必須測(cè)定后

15、運(yùn)行時(shí)間。后運(yùn)行時(shí)間可以轉(zhuǎn)換成必須測(cè)定后運(yùn)行時(shí)間。后運(yùn)行時(shí)間可以轉(zhuǎn)換成 與流速無關(guān)的延遲體積。與流速無關(guān)的延遲體積。 后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之一：后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之一： 通過在流路內(nèi)注射一種染料，當(dāng)餾分收集通過在流路內(nèi)注射一種染料，當(dāng)餾分收集 器針尖出現(xiàn)該染料時(shí)記錄時(shí)間。器針尖出現(xiàn)該染料時(shí)記錄時(shí)間。 后運(yùn)行時(shí)間后運(yùn)行時(shí)間t餾分收集器 餾分收集器- t檢測(cè)器檢測(cè)器49行業(yè)進(jìn)步 后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之二：后運(yùn)行時(shí)間測(cè)定方法之二： 在餾分收集器內(nèi)裝入一個(gè)檢測(cè)器，該檢在餾分收集器內(nèi)裝入一個(gè)檢測(cè)器，該檢 測(cè)器稱為延遲傳感器。將延遲校正物注入流測(cè)器稱為延遲傳感器。將延遲校正物注入流 路，兩個(gè)檢測(cè)器都記錄信號(hào)。

16、兩個(gè)檢測(cè)器之路，兩個(gè)檢測(cè)器都記錄信號(hào)。兩個(gè)檢測(cè)器之 間的時(shí)間差就是后運(yùn)行時(shí)間。間的時(shí)間差就是后運(yùn)行時(shí)間。 根據(jù)校正時(shí)所用的流速，系統(tǒng)將自動(dòng)計(jì)根據(jù)校正時(shí)所用的流速，系統(tǒng)將自動(dòng)計(jì) 算出準(zhǔn)確的延遲體積，并保存，同時(shí)也能計(jì)算出準(zhǔn)確的延遲體積，并保存，同時(shí)也能計(jì) 算出每個(gè)流速下的后運(yùn)行時(shí)間，當(dāng)流速改變算出每個(gè)流速下的后運(yùn)行時(shí)間，當(dāng)流速改變 時(shí)，不需要再校正后運(yùn)行時(shí)間。時(shí)，不需要再校正后運(yùn)行時(shí)間。 50行業(yè)進(jìn)步 擴(kuò)散擴(kuò)散 擴(kuò)散使峰（譜帶）變寬擴(kuò)散使峰（譜帶）變寬 ，嚴(yán)重削弱了，嚴(yán)重削弱了 色譜的分辨（分離）能力。色譜的分辨（分離）能力。 譜帶變寬與流速成反比，與管線長(zhǎng)度譜帶變寬與流速成反比，與管線長(zhǎng)度 和管線內(nèi)徑成正比。和管線內(nèi)徑成正比。 51行業(yè)進(jìn)步 三種不同管徑的擴(kuò)散影響三種不同