生物技術(shù)大實驗部分操作程序易

1、生物技術(shù)大實驗操作指南注意事項1、 工作服穿戴，禁止吃東西和大聲喧嘩和串門聊天。2、 用電、氣安全注意事項。3、 節(jié)約用水，安全用水，有毒、害廢水的正確處理。4、 實驗室、臺衛(wèi)生，最后離開實驗室的同學(xué)檢查水電門窗。5、 實驗報告，正確記錄原始數(shù)據(jù)，分析結(jié)果得出合理的結(jié)論。實驗一 雞輸卵管總rna提取（溶菌酶基因的提?。┮?、 原理：組織細胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加trizol快速勻漿碾磨，加一定體積的氯仿振蕩，離心，取水相，加等體積的異戊醇（或無水乙醇）沉淀，75%乙醇洗滌，晾干，無rnase的ddh2o溶解。二、 試劑與設(shè)備： totalrnaextractor（trizol）或rnas

2、imple total rna kit，氯仿，異戊醇，無水乙醇，ddh2o free rnase。研缽，玻璃勻漿器，16000轉(zhuǎn)低溫冷凍離心機。三、 步驟：1、 新鮮雞輸卵管膨大部，50mg，預(yù)冷的研缽中剪碎，加1ml trizol冰浴中勻漿，rt 5-10 min。2、 加200ul 氯仿，振蕩15 sec，rt 3 min。3、 4 12000rpm，離心10min，吸取上層水相，轉(zhuǎn)入新的離心管。4、 加500ul 異戊醇柔和混勻，rt沉淀30min,離心同上，留取沉淀。5、 加1ml 75%乙醇洗滌沉淀 2次，勿劇烈振蕩，離心同上，收取沉淀，rt晾干3-5min。6、 50ul ddh2

3、o free rnase 溶解沉淀。7、 檢測rna純度與濃度。四、 結(jié)果五、討論實驗二 溶菌酶基因第一鏈cdna合成一、 原理： mrna經(jīng)m-mulv催化，以oligo dt為引物，將mrna反轉(zhuǎn)錄合成cdna，此cdna為單鏈。二、 試劑與設(shè)備：m-mulv第一鏈cdna合成試劑盒，恒溫水浴鍋，掌上離心機。三、 步驟：1在冰浴的試管中加入如下反應(yīng)混合物：總rna 或 poly(a)+ rna或特異性rna xgoligo dt (0.5g/l) (20 pmol) 1lrnase free ddh2o 定容至12l2. 輕輕混勻后離心35 s，反應(yīng)混合物在65溫浴5 min后，冰浴30

4、s，然后離心35 s。3將試管冰浴，再加入如下組分：5reaction buffer 4lrnase inhibitor ( 20 u/l) 1ldntp mix(10 mmol/l) 2lm-mulv rt（200 u/l） 1l注：若5reaction buffer出現(xiàn)白色結(jié)晶，需37溫浴數(shù)分鐘至白色結(jié)晶完全溶解，震蕩混勻。4輕輕混勻后離心35 s。5在 pcr 儀上按下列條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cdna 合成 42 30-60 min 6.終止反應(yīng) 95 5 min(酶失活)，處理后，置于冰上放置或-20保存。* m-mulv rt酶最后加。四、結(jié)果五、討論實驗三 雞溶菌酶基因的pcr擴增一、

5、 原理：利用耐熱t(yī)aq酶（一種dna聚合酶），以四種dntp為底物，在引物的誘導(dǎo)下，經(jīng)過變性、退火、延伸三步反應(yīng)，體外合成dna雙鏈分子。二、 試劑與設(shè)備：2x pcr plus mastermix，ddh2o，模板，上、下游引物，掌上離心機，pcr儀。三、 步驟：1、 反應(yīng)體系如下：模板dna （第一鏈cdna） x ul（1ug）引物1（10 um） 1 ul引物2（10 um） 1 ul2x pcr plus mastermix 12.5ulddh2o 10.5-x ul total 25 ul如果體系變化，可按此比例添減。2、 pcr反應(yīng)條件： 95 5 min 95 30sec 56

6、 30sec 30 cycles 72 30sec 72 10min3、 結(jié)果檢驗 取3-8ul，pcr產(chǎn)物，1%agarose 電泳。（切下目的條帶-20保存）四、 結(jié)果 五、討論實驗四 pcr產(chǎn)物的回收純化一、 原理：pcr產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳分離，切取含目的產(chǎn)物的膠條，用膠回收試劑盒回收。二、 試劑與設(shè)備：dna膠回收試劑盒，tbe電泳buffer，瓊脂糖，goldview染料，2000 dna ladder，無水乙醇，te或ddh2o，恒溫水浴鍋，水平電泳儀，高速冷凍離心機等。三、 步驟：1、 通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的dna片段與其它片段分開，用干凈的手術(shù)刀片將含目的dna片段的瓊

7、脂糖凝膠塊切下，放入1.5 ml離心管中，稱重。 2、 根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每100 mg瓊脂糖（如膠塊不足100 mg則用水補充至100 mg）加300- 600 l的比例加入binding buffer ii。3、 將離心管置于55水浴5-10 min，間或混勻，直至膠塊完全溶化。4、 當(dāng)目的片段 500 bp時，加入所使用的binding buffer ii 1/3體積的異丙醇，混勻。當(dāng)目的片段 500 bp時，此步驟可以省略，直接進行步驟5。5、 將溶化好的溶液全部移入吸附柱，室溫放置2 min，8,000 rpm 離心1 min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。6

8、、 向吸附柱中加入500 l wash solution，10,000 rpm 離心1 min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。7、 重復(fù)步驟6一次。8、 將空吸附柱和收集管放入離心機，12,000 rpm 離心2 min9、 將吸附柱放入干凈的1.5 ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50 l elution buffer，室溫靜置1-2 min，12,000 rpm 離心1 min。將所得到的dna溶液置于-20保存或用于后續(xù)試驗。四、 結(jié)果五、討論實驗五 pcr產(chǎn)物-t載體連接與擴增一、 原理：t vector是一種高效克隆pcr產(chǎn)物（ta cloning）的專用載體，

9、該載體的3端具有突出的“t”末端；dna聚合酶在進行pcr擴增時會在pcr產(chǎn)物雙鏈dna每條鏈的3端加上一個突出的a，t載體的兩端就可以和pcr產(chǎn)物的兩端進行正確的at配對，在連接酶的催化下，就可以把pcr產(chǎn)物連接到t載體中，形成含有目的片斷的重組載體，該載體即可導(dǎo)入宿主菌擴增。二、 試劑與設(shè)備：t-載體，目的dna片段，掌上離心機，冰瓶(低溫恒溫儀)等。三、 步驟：1、 反應(yīng)體系 在0.2 ml pcr管中配制下列連接體系：反應(yīng)組分10 l 反應(yīng)體系插入的目的片段 x l（0.2 pmol）pucm-t vector 1 l（50 ng）10ligation buffer 1 l50% pe

10、g 4000 1 lt4 dna ligase 1 lsterilized ddh2o 補足至10 l（一般最后加入t4 dna ligase。）2、16連接1-12 h（建議連接過夜）。3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)，挑選/鑒定陽性克隆；或?qū)⑦B接產(chǎn)物-20保存。四、結(jié)果五、討論實驗六 感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化一、原理：受體細胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，cacl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源dna分子通過的感受態(tài)細胞；細菌處于0，cacl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的dna形成抗dnase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短

11、時間熱沖擊處理，促使細胞吸收dna復(fù)合物，進入細胞的dna分子通過復(fù)制、表達實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。二、試劑與設(shè)備：lb培養(yǎng)基，0.1m cacl，冰水，平皿，試管，恒溫水浴鍋，低溫冷凍離心機，無菌工作臺等。三、步驟：（一）感受態(tài)細胞的制備:1前一晚接種受體菌（dh5或其他），挑取單菌落于lb培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）。2取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml lb（1：100）培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm），直至od600為0.4-0.6。3將 0.1m cacl2 溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

12、。4吸取 1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘。54下3000g冷凍離心5分鐘。6棄去上清，加入 100l預(yù)冷0.1m cacl2 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘。74下3000g冷凍離心5分鐘。8棄去上清，加入 100l預(yù)冷0.1m cacl2 溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮。9細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑（ 15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫?0）。（二）細胞轉(zhuǎn)化：1、將100 l感受態(tài)細胞置于冰上解凍后，加入實驗五的連接液 10 l，輕輕混勻，冰上放置30 min。2、42c水浴熱激9

13、0 sec，再冰上放置5 min。3、加入800 l lb液體培養(yǎng)基，37c振蕩培養(yǎng)1 h。4、4000 rpm離心3 min，用槍頭吸掉750 l上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。5、將細菌懸液均勻涂布在含100ug/ml 氨芐青霉素抗性的lb平板上（也可再加含20 l 100 mm iptg 和100 l 20 mg/ml x-gal）。6、將平板于37c培養(yǎng)1 h，然后倒置培養(yǎng)過夜。8、 用接菌環(huán)或牙簽或小槍頭挑取白色菌落，用基因特異性引物進行pcr擴增，確認(rèn)載體中插入片段的長度大小。或?qū)咨涮糁梁逼S青霉素的液體培養(yǎng)基中37c培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后進行酶切鑒定。四、 結(jié)果五、討論試驗

14、七 質(zhì)粒的小量提?。▔A裂解法） 一、原理：堿裂解法是基于dna的變性與復(fù)性差異而達到分離目的的。堿使細胞破裂，質(zhì)粒dna變性，再將ph值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒dna，而蛋白質(zhì)和染色體dna不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。 二、試劑與設(shè)備：溶液i：50 mm葡萄糖 + 25 mm tris-cl + 10 mm edta，ph 8.0，滅菌，rt保存； 溶液ii（用10m naoh 臨用是配），0.2 n naoh + 1% sds； 溶液iii，3 m 醋酸鉀 + 2 m 醋酸，滅菌后rt保存；ste，10mmol/ltrishcl，1mmol/l edta，0.1m nacl

15、，ph8.0，滅菌后rt保存；te，100mmol/ltrishcl，10mmol/l edta，ph8.0，滅菌后rt保存（最好含 rna酶 20g/ml）；75%乙醇；hcl；碎冰塊；低溫冷凍高速離心機，恒溫空氣搖床，水循環(huán)真空泵。五、 步驟：1、 無菌操作臺上，取37過夜培養(yǎng)菌體od600=1.0， 1.5ml于離心管（eppendorf管）中，微量離心機上以10000rpm離心1min，或者以4000rpm離心510min，棄上清液，加400ul，ste洗滌2次，棄上清，離心管倒扣于干凈的吸水紙上吸干。 2、沉淀中加100l用冰預(yù)冷的溶液 i，劇烈振蕩，充分混合。冰浴5min。 3、加

16、入200l溶液 ii(新鮮配置)，加蓋后輕輕快速顛倒離心管數(shù)次混勻（千萬不要振蕩），冰浴5 min 。 4、加入150l預(yù)冷溶液 iii，輕輕顛倒數(shù)次混勻（10s），置于冰浴3-5 min 。 5、4，12000rpm 離心10min，上層水相于另一新eppendorf管中。 6、加入等體積酚/氯仿（1：1）或酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）振蕩混勻，以4，12000rpm，離心10min。7、吸上層水相至一新的離心管，加等體積的氯仿，振蕩混勻，離心同上。8、小心移出上清于一新eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，溫和混勻，rt 10-30 min，4離心12000rpm，10-1

17、5min，收集沉淀。 9、70-75%乙醇洗滌沉淀 1-2 次, 每次1.0ml，如上離心2min，離心管開蓋倒扣在吸水紙上，室溫下晾干（5-10min），最好用真空泵抽掉殘留酒精。 10、加入50l te緩沖液（ph 8.0 含20g/mlrnasea）溶解質(zhì)粒粗提物，在-20保存。五、結(jié)果六、討論實驗八 質(zhì)粒dna酶切鑒定與回收一、 原理：本實驗采用ecor和bamh雙酶切重組質(zhì)粒pmd18-chlyz或其它重組的克隆質(zhì)粒，酶切后產(chǎn)生大小不同的2個片段，大片段來自質(zhì)粒載體，小片段為目的基因。二、 試劑與設(shè)備：ecor，bamh，10k buffer，tbe或tae 電泳buffer，瓊脂糖

18、，恒溫水浴鍋，水平電泳儀等。三、 步驟：1、 酶切體系20ul ecor 0.2ulbamh 0.2ul重組質(zhì)粒 10ul10k buffer 2ulddh2o 7.6ultotal 20 ul加樣畢，混勻，低速離心 30 sec，37-，2-6hr。2、 檢測 1% 瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，稱重，放 eppendorf，-20 保存。四、 結(jié)果五、 討論實驗九 原核表達載體的構(gòu)建一、 原理：同時用酶ecor和bamh，分別消化處理目的chly-t載體和pet32質(zhì)粒載體，回收chly基因和pet32a大片段，產(chǎn)生的粘性末端，可以在t4 dna ligase 作用下，再次連接成完整的質(zhì)粒

19、，該質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化導(dǎo)入細胞（宿主體內(nèi)），隨宿主體在內(nèi)擴增和表達。二、 試劑與設(shè)備：pet32質(zhì)粒，chlyz基因，t4 dna ligase，10 t4 dna ligase buffer，16 恒溫水浴鍋或冰瓶或pcr儀。三、 步驟：1、 質(zhì)粒和基因的酶切消化：操作參考實驗八，質(zhì)粒和基因分開酶切。2、 質(zhì)粒和基因的回收：參考實驗四，質(zhì)粒和基因分開回收。3、基因與載體的連接：酶切回收相關(guān)基因，用t4 ligase 16度連接過夜，次日轉(zhuǎn)化，37培養(yǎng)，挑陽性克隆，鑒定。 bamh/ecor 雙酶切 bamh/ecor 雙酶切 chly dna fragment 載體t4 dna ligase 連接

20、 4、鑒定方法：可提質(zhì)粒酶切或pcr鑒定。保存陽性克隆，以備后續(xù)表達實驗。四、 結(jié)果五、討論實驗十 雞溶菌酶的原核表達 概述隨著功能基因組研究的不斷深入，需要將大量已克隆的基因在模式細胞中獲得高效表達進而研究這些基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能。眾所周知，大腸桿菌是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最常用的材料之一，不但已經(jīng)掌握了它的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方面的大量資料，而且在基因表達方面也有深入的了解，因此很自然大腸桿菌便被選作表達外源基因的常用寄主細胞。早期的研究工作己表明，要使己克隆的外源基因能在細菌細胞中成功表達，就必須使基因置于寄主細胞的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯機制的控制之下。在大腸桿菌細胞中參與特定新陳代謝的基因，往往成

21、簇集結(jié)成一個轉(zhuǎn)錄單位即操縱子，其中主要的控制片段是位于其起始部位的操縱序列和啟動子。在基因表達過程中，操縱子先轉(zhuǎn)錄成多順反子mrna，然后轉(zhuǎn)譯出多肽分子。已克隆基因在大腸桿菌細胞中的表達，如同正常的基因表達程序一樣，也包括dna分子的有效轉(zhuǎn)錄和mrna分子的有效轉(zhuǎn)譯這兩個主要步驟，在某些情況下還涉及到表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)分子的轉(zhuǎn)譯后修飾問題。1974年，chang和cohen證實金黃色葡萄球菌的a mpr 基因能夠在沒有親緣關(guān)系的大腸桿菌中實現(xiàn)功能表達，因而人們期望從基因到表型的生化途徑也與遺傳密碼一樣是通用性的，并據(jù)此設(shè)想任何細菌的基因也都能夠在別種細菌中表達。隨后st ruhl 等人和 vapn

22、ek 等人(1977)又相繼發(fā)現(xiàn)，兩種比較低等的真核生物釀酒酵母和粗糙鏈抱菌的基因，也能夠在大腸桿菌中表達。這樣便進一步證實了人們的上述想法?；谶@樣的原因，研究工作者們紛紛推測，更高等的基因也應(yīng)該能夠在細菌中實現(xiàn)表達。但后來有越來越多的研究報告指出，不少己克隆基因事實上并不能夠在新的遺傳背景中實現(xiàn)表達。對此的一種解釋認(rèn)為，是由于從基因到表型的過程中有若千步驟發(fā)生障礙的緣故。一種功能蛋白的合成，不但取決于適當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)錄及隨后的mrna有效轉(zhuǎn)譯，而且在許多情況下，還同轉(zhuǎn)譯后的加工和新生多膚的裝配有關(guān)。在這過程中只要有一個步驟未能正確地進行，有關(guān)基因也就不能實現(xiàn)其功能表達?？寺⌒蛄械霓D(zhuǎn)錄必須有一個

23、能被寄主rna聚合酶識別的啟動子，而mrna的有效轉(zhuǎn)譯則必須有核糖體的結(jié)合位點。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯后修飾的一個共同特點是信號序列引導(dǎo)蛋白質(zhì)分子穿過細胞膜。另一可能與蛋白質(zhì)成功表達有關(guān)的現(xiàn)象是蛋白質(zhì)的降解作用。已經(jīng)知道在大腸桿菌中，凡是發(fā)生了無義突變的基因，它們所編碼的短膚鏈在合成后不久，就會被降解掉，與此相反野生型的蛋白質(zhì)則十分穩(wěn)定?？梢栽O(shè)想如果外源蛋白質(zhì)的分子構(gòu)型或其氨基酸序列，不能保護它們自己免受胞內(nèi)蛋白酶的作用，則新生蛋白很快就會被迅速地降解掉。研究克隆基因表達的成果，對于某些研究領(lǐng)域有著重要的用途。首先有可能為揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供新的研究手段。例如運用dna技術(shù)，能夠獲得可在大腸

24、桿菌細胞中進行有效表達的雜種干擾素。這樣便可以將這種蛋白質(zhì)分子純化出來，在體外進行生物學(xué)方面的研究。運用dna技術(shù)還可以用來檢測體外突變所產(chǎn)生的變異氨基酸在蛋白質(zhì)多膚鏈中的位置，并測定出因這種改變對于酶催化功能的效應(yīng)。在實際應(yīng)用方面，基因克隆和表達技術(shù)也有著不可忽視的重要性。應(yīng)用重組dna技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)等方面的實用價值及其前景也是十分誘人的。在今天幾乎所有生物科學(xué)領(lǐng)域都受到此項技術(shù)的影響。體外表達目基因，純化出重組蛋白是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、蛋白蛋白、蛋白核酸 間的相互作用，制備抗體及突變研究等的基本技術(shù)，也是基因克隆的目的所在。目前蛋白質(zhì)表達的方法大多是將編碼所需產(chǎn)物

25、的基因插入表達型質(zhì)?；蚱渌d體，然后將該載體導(dǎo)入細胞。典型的表達載體除具有一般克隆載體的特征外還包含指導(dǎo)相應(yīng)mrna大量合成的啟動子、允許其在宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列和能增強mrna翻譯效率的序列。一、目的：1.學(xué)習(xí)原核細胞中目的基因表達所需的條件2.認(rèn)識常用的表達載體。二、原理提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。e.coli 的乳糖操縱子（元）含z, y及a三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、乳糖通透酶和乙酞基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列o、一個啟動序列p及一個調(diào)節(jié)基因?；蚓幋a一種阻遏蛋白，后者與o

26、序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動序列p上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白(cap)結(jié)合位點。由p序列、o序列和cap結(jié)合位點共同構(gòu)成lac的操縱子的調(diào)節(jié)去。三個酶的編碼基因由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達。該操縱子有正負(fù)兩種調(diào)節(jié)機制，lac編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，和camp-cap的正調(diào)節(jié)。cap必須和camp形成復(fù)合物才能結(jié)合于dna。在環(huán)境中有葡萄糖的情況下，細菌不會利用象乳糖這樣的碳源，細胞的camp水平下降，不利于形成camp-cap。阻遏蛋白有2個結(jié)合位點，一是操縱基因結(jié)合位點，二是誘導(dǎo)物結(jié)合位點。如果沒有誘導(dǎo)物，阻遏蛋白就以活性狀態(tài)結(jié)合于操縱基因，抑

27、制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。其誘導(dǎo)物就是-半乳糖苷，結(jié)合于阻遏蛋白后，使其失活，從操縱基因脫落，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因得以正常表達。如果環(huán)境中僅有-半乳糖苷該種碳源，laczya就被激活。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時，i序列在pi啟動序列操縱下表達的lac阻遏蛋白與o序列結(jié)合，阻礙rna聚合酶與p序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動。當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)，這個操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經(jīng)-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與o序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。iptg是乳糖的結(jié)構(gòu)類似物，可以與乳糖操縱

28、子的阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的空間構(gòu)像變化，四聚體解聚成單體，失去與操縱子特異性緊密結(jié)合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用，保證基因轉(zhuǎn)錄的進行。與乳糖不同的是iptg不會被半乳糖苷酶水解，不受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)的抑制，使轉(zhuǎn)錄持續(xù)進行下去。三、實驗設(shè)備： 1恒溫?fù)u床；2.高速冷凍離心機；3恒溫水浴鍋；4.牛皮紙和棉紙；5.接種環(huán)和涂菌棒。四、實驗試劑：1，含重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌（pet系列，購自invitrogen）；2，lb培養(yǎng)基；3，10mmol/l iptg；4. 1樣品緩沖液；5100 mmol/l dtt；62%sds；7. 0.1%溴酚蘭；8. 10%甘油；9.限制性內(nèi)切ecori 和ba

29、mhi；10.目的基因lysozyme chlyz11. 10mg/ml 氨芐青霉素和卡那霉素。五、操作1.用限制性內(nèi)切酶ecor i 和bamh i 分別對載體pet28a和目的基因chlyz（雞溶菌酶）分別進行雙酶切，膠回收試劑盒回收純化載體大片段和目的基因；后連接入表達載體pet28a并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主菌中，篩選出含有重組子的轉(zhuǎn)化菌株，提取質(zhì)粒dna進行酶切分析或dna序列測定，以確定是否為重組子。2.真核基因的誘導(dǎo)表達和檢測（1）挑取含重組子的陽性單菌落，接種于3ml lb培養(yǎng)基中，37搖培過夜。（2) 取5ul 培養(yǎng)物于2m1含適當(dāng)氨芐青霉素或卡那霉素（根據(jù)載體選擇合適抗生素）的lb液

30、體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)2hr，至菌液 a600=0.6-0.8。（3) 加iptg至終濃度為0.5-lmmol/l，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 hr。（4) 取上述培養(yǎng)液1.5m1，12000rpm離心l min。(5) 沉淀加入100 ul 1樣品緩沖液振蕩懸浮。（6）100加熱5min, 12000 rpm，40離心l 0min。（7）取上清進行sds-page。鑒定目的基因是否表達。六、注憊事項1，本實驗可能涉及兩種與目的dna連接的載體，弄清它們在性質(zhì)和功能上的區(qū)別。2，雙酶切過程與前面的步驟相同，進行實驗時還須借鑒之前的經(jīng)驗。七、思考題1真核基因在原核細胞中表達需要哪些條件？2如何防止外源表達蛋白不

31、被宿主細胞降解？實驗十一 表達產(chǎn)物鑒定sds-pag（凝膠電泳法鑒定目的蛋白質(zhì)）一、目的、1.掌握sds-page電泳分離鑒定蛋白質(zhì)的原理。2.學(xué)會sds-page電泳分離鑒定蛋白質(zhì)技術(shù)。二、原理 sds-page為十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。是以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)，對蛋白質(zhì)進行分離與鑒定。電泳是指帶電的膠體顆粒在電場中移動。膠體分子具有一定大小的分子半徑，不同的膠體可以吸附大量的電荷，從而帶上正電或負(fù)電，在電場力的作用下向與其電性相反的方向移動。蛋白質(zhì)常以顆粒狀態(tài)分散在溶液中。在電場中，根據(jù)它們所帶凈電荷向陰極或陽極遷移，遷移的方向取決于它們帶電荷的極性。蛋白質(zhì)一般是由不同數(shù)量和比例

32、的20余種氨基酸組成的兩性電解質(zhì)分子。所帶電荷的性質(zhì)和多少隨所處環(huán)境ph的變化而變化。從電泳的觀點來看，蛋白質(zhì)分子最主要的特征就是它的帶電行為。每一種蛋白質(zhì)分子都處于一定的ph環(huán)境中，它的氨基酸側(cè)鏈基團或解離質(zhì)子，從而帶正電或帶負(fù)電。在某一特定ph環(huán)境中，不同蛋白質(zhì)分子的帶電情況不同，所受電場力有差別，因而在電泳行為上也就會出現(xiàn)差異。再加上各種蛋白質(zhì)在分子量、三維結(jié)構(gòu)上的不同，3個因素共同影響了蛋白質(zhì)電泳的涌動速率。 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酞胺（acr）和交聯(lián)劑n, n一甲叉雙丙烯酰胺（bis）在引發(fā)劑過硫酸銨（ap）和加速劑四甲基乙二胺（temed）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的。凝膠

33、濃度過高時，凝膠硬而脆，容易破碎。反之凝膠稀軟，不易操作。交聯(lián)度過高，凝膠不透明缺乏彈性，反之凝膠成糊狀。凝膠濃度的正確選擇尤為重要，如果凝膠濃度太大，孔徑太小，電泳時樣品分子不能進入凝膠；如果凝膠濃度太低，孔徑太大，則樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨著緩沖液遷移而不能分開，因此不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。 sds-page采用由濃縮膠與分離膠組成的不連續(xù)的凝膠系統(tǒng)。濃縮膠的膠濃度低，孔徑大，而分離膠濃度則較高，孔徑小。首先，在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中涌動時受到的阻力小，移動速度快。當(dāng)進入小孔膠時，蛋白質(zhì)顆粒受到的阻力大，移動速度減慢，因而在兩層凝膠的交界處，就會由于凝膠孔徑

34、的不連續(xù)性，使樣品遷移突然受阻而被壓縮成很窄的區(qū)帶。即在蛋白樣品進入分離膠后，以各自遷移速率的不同而彼此分離。如果樣品和聚丙烯酞胺凝膠中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(sds )和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于蛋白亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。sds作為變性劑和助溶性試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。強還原劑如-疏基乙醇和二硫蘇糖醇（dtt）則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在蛋白質(zhì)樣品和凝膠中加入sds和還原劑后，蛋白質(zhì)分子解聚成亞基，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與sds充分結(jié)合，形成帶負(fù)電的蛋白質(zhì)亞基-sds復(fù)合物。sds蛋白

35、質(zhì)復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過了大蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同種類蛋白亞基間原有的電荷差異，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，電泳遷移率僅僅取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。 sds-page凝膠電泳所需儀器設(shè)備較簡單，操作方便，重復(fù)性好，且不需非常純的樣品，因而被廣泛用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定及蛋白質(zhì)純度鑒定。三、實驗器材1.微型凝膠電泳裝置2.三恒穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀3. ph計4.高速冷凍離心機5水平搖床6微量取液器（吸頭）7.微量注射器8.10ml注射器9.1.5m1離心管10.50m1離心管四、實驗試劑1.含重組子的大腸桿菌2.蛋白提取液：25mmol/l tris-hc1 (p

36、h7.5 )、10mmol/l kci, 20 mmo1/l mgcl2, l mmol/l dtt, 1 mmol/l pmsf（現(xiàn)用現(xiàn)加）3.蛋白溶解液：0.0625mmol/l tris-hcl (ph7.5 )、2%sds, 10%甘油、5% -疏基 乙醇、0.001% 溴酚蘭。4.電泳儲存液52mo1/i tris-hcl（ph8.8），100m16lmol/1 tris-hcl（ph6.8），100m17. 10%sds，100m18.50%甘油：量取50m1 100%的甘油，加入50ml ddh20。高壓滅菌，備用。9. 1溴酚蘭：稱取100mg溴酚蘭，加ddh20至loml，攪

37、拌直到完全溶解，過濾去除聚合的染料。10.考馬斯亮藍染液：稱取考馬斯亮藍g250 1g，加450ml 乙醇，100ml 冰乙酸、450ml ddh20。11.脫色液：乙醇 250ml , dd h20 675 ml，冰乙酸 75ml。五、操作1.去1.5ml 表達菌液，10000rpm 4 離心10min，加1上樣buffer重懸，100煮沸10min，10000rpm 4 離心10min，取上清電泳。如果是提取的純化蛋白則按下述制樣（提取的蛋白質(zhì)樣品最終溶解在1樣品緩沖液中，故應(yīng)事先計算好緩沖液的用量及稀釋倍數(shù)。關(guān)于蛋白質(zhì)樣品的終濃度，由于電泳儀器與凝膠厚度對樣品承載量有不同的限定范圍。一般

38、而言，可以將蛋白質(zhì)烘干，稱量出100-1000mg，溶解于50-100 u1的l樣品緩沖液中）。2.電泳操作灌制分離膠：裝配好灌膠用的模具。將分離膠裝配在一個小燒杯中，操作時必須戴手套。加入ap和temed后，輕輕混勻不要產(chǎn)生氣泡，否則會干擾聚合。小心將凝膠緩慢加入模具中，注意在凝膠中不能產(chǎn)生氣泡。凝膠液加至距前玻璃版（較短的玻璃板）頂端約1.5cm處，輕輕在膠面上鋪蓋一層5mm的水。當(dāng)凝膠聚合后，在分離膠和水層之間會出現(xiàn)一個清晰的界面，將水層吸凈。灌制濃縮膠：將凝縮膠配制在小燒杯中，用移液槍將濃縮膠加至分離膠的上面，直至前玻璃板的頂端，并插入梳子，確保梳子齒的末端沒有氣泡。凝膠聚合后，將凝膠

39、板裝入電泳槽內(nèi)。加入電泳緩沖液，拔去梳子。蛋白樣品的處理： a蛋白樣品的變性：100 5min o b10000 rpm 4 離心5min。 c用微量注射器將樣品加入樣品孔中。電泳：電泳儀與電源相接，電流應(yīng)流向陽極。可采取穩(wěn)壓或穩(wěn)流。當(dāng)溴酚蘭的前沿遷移至凝膠的底部時，關(guān)閉電源。然后將膠剝離在培養(yǎng)皿中（預(yù)先加上固定液），測量溴酚蘭的遷移距離。3.染色：立即將電泳后的凝膠放入考馬斯亮藍溶液中染色20-30 min。然后換用脫色液脫去底色，直到蛋白質(zhì)清晰為止。六、注意事項1固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。2凝膠配制過程要迅速，催化劑temed要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。3凝

40、膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。4樣梳需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。5. 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出，否則會影響加樣效果。6. 注射器不可過低，以防刺破膠體，也不可過高，在樣下沉?xí)r會發(fā)生擴散。7為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔加樣。8剝膠時要小心，保持膠完好無損，染色要充分。9水封的目的是為了使分離膠上沿平直，并排除氣泡。七、思考題1請思考page凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度關(guān)系？2依據(jù)sds的作用原理，請思考計算所分離出的蛋白代的分子量是天然蛋白質(zhì)的分子量嗎？3在sds-page測定蛋白質(zhì)分子量時，必須加入過量的sds和疏基試劑，為什么？實驗十二 重組蛋白的分

41、離純化 近年來隨著生物技術(shù)的進步，特別是基因工程的迅猛發(fā)展，表達蛋白己經(jīng)變得很容易，相對而言，純化卻是一個非常繁雜的工作，所以越來越多的研究者把需要表達的目標(biāo)蛋白和親和純化用的標(biāo)簽融合表達，這樣純化相對容易，即使如此，由于蛋白的多樣性，純化依然是比較復(fù)雜而專業(yè)的工作，尤其對于不熟悉純化的研究者而言，它成為一個項目的瓶頸。重組蛋白可在e.coli、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等體系中得到高效表達，其表達形式一般可分為：（1)細胞外的分泌表達；(2)細胞內(nèi)可溶性表達；(3) 細胞內(nèi)不溶性表達，即產(chǎn)物以包涵體的形式存在。因此，對于重組蛋白的純化要依據(jù)其表達形式的不同，采取不同的純化工藝。例如，當(dāng)重組蛋白

42、以包涵體形式存在時，就需要對包涵體進行變-復(fù)性處理。然而不論以那種表達形式產(chǎn)生的重組蛋白，其純化的方法都與傳統(tǒng)的生物大分子分離方式相似。重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點、親疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠層析和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在，因此到目前為止還沒有一個單獨或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來，而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序，以獲得較高純度的制品。 今后重組蛋白的分離純化的技術(shù)發(fā)展，將朝著快速，高

43、分辨率，高上樣量，易于操作，低成本和自動化等技術(shù)方向發(fā)展。一、目的 1掌握色譜純化-復(fù)性蛋白質(zhì)的原理。 2熟悉蛋白質(zhì)色譜純化-復(fù)性的操作過程。二、原理將目的基因連接在表達載體后，通過iptg誘導(dǎo)目的基因表達。表達載體除具有蛋白表達所需要的啟動子外，在終止子前有6個his編碼序列，便于蛋白的親和層析純化。親和層析以蛋白質(zhì)或生物大分子和結(jié)合在介質(zhì)上的配基間的特異親和力為基礎(chǔ)。本實驗采用結(jié)合了ni2+的介質(zhì)在變性條件下對融合蛋白進行分離純化，只需通過“結(jié)合-清洗-洗脫”三個簡單的操作步驟就可完成。 也可以采用凝膠層析法(gel filtration)就是利用層析凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方

44、法，又稱為分子篩層析法或排阻層析法（層析原理見生物化學(xué)有關(guān)內(nèi)容)。三、溶液配制：gunta-0 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl。gunta-20 buffer：20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，20 mm imidazole。gunta-40 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，40 m

45、m imidazole。gunta-60futer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，60 mm imidazole。gunta-100buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，100 mm imidazole。gunta-500 buffer: 20 mm tris-hcl ph 7.9, 0.5 m nacl, 10glycerol，6m guanidium hcl ，500 mm imidaz

46、ole。5m1注射器若干；層析管；高速離心機；層析架、收集器；sephadex g-75葡聚糖凝膠；二硫蘇糖醇（dtt），磷酸na；透析袋。四、操作步驟1.重組蛋白表達，見實驗10。2.收集細菌（每組50-100m1,分兩次收集），5000 rpm 4 離心3min。0.01m ph 7.2 pbs緩沖液清洗2，同樣條件離心后再次收集菌體。3破細胞每10 ml 菌液的菌體加入1-2 ml 結(jié)合液懸浮。加入溶菌酶4 u1 (100mg/l），使得終濃度為1mg/ml，放置冰浴中30-60min充分酶解，超聲破碎。5000 rpm 4離心 5min，收集上清液4貯存，接下一步層析純化。4. 如果是

47、包涵體表達，則步驟3 離心后，去上清，留沉淀，洗滌（洗滌液1： 60 mm edta，4% triton x-100，1.5 m nacl，ph7.0；洗滌液2：0.1 m tris-cl，20 mm edta, 2m urea, ph7.0 各洗2次），最后用包涵體溶解液溶解（0.1 m tris-cl, 8 m urea，5 mm dtt, ph 8.0），rt 4-5h，或冰箱中過夜。（一）、ni 柱法5.將4 的液體12000 rpm 4 離心 20 min。棄細胞碎片與沉淀，取上清用于過柱。6.過ni 柱1）將nta 樹脂裝入合適的層析柱，層析柱用10倍nta 體積的gunta-0 buffer洗。2) 將樣品（見步驟2 或5）加到nta 層析柱中，流速控制在15 ml/小時 左右，收集流出液，用于sds-page 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。3) 層析