第二章發(fā)酵產(chǎn)酶

1、第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第二章第二章 酶的生產(chǎn)酶的生產(chǎn) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第二章酶的生產(chǎn)第二章酶的生產(chǎn) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第一節(jié) 微生物酶的開發(fā) 一、應(yīng)用微生物開發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)：一、應(yīng)用微生物開發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)： (1)微生物生長(zhǎng)快、周期短。生產(chǎn)能力微生物生長(zhǎng)快、周期短。生產(chǎn)能力 大，大， 能滿足市場(chǎng)需求。能滿足市場(chǎng)需求。 (2)微生物種類多，不同的環(huán)境下的微生物微生物種類多，不同的環(huán)境下的微生物 以特殊的代謝方式分解利用不同的底物。為以特殊的代謝方式分解利用不同的底物。為 酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 (3)通過基因工程使動(dòng)植物細(xì)胞中的酶都能用微通過基因工程使動(dòng)植物細(xì)胞中的酶都能用

2、微 生物細(xì)胞獲得。因此，有計(jì)劃地篩選菌種，生物細(xì)胞獲得。因此，有計(jì)劃地篩選菌種， 可以生產(chǎn)幾乎任何一種酶?？梢陨a(chǎn)幾乎任何一種酶。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 二、微生物酶開發(fā)的一般程序 (一一) 樣品的采集樣品的采集 采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù) 量。量。 (二二) 菌種的分離菌種的分離 培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。培養(yǎng)基的確定、培養(yǎng)條件的確定。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (三三) 菌種的初篩菌種的初篩 (1)用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩；用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩； (2) 最初分離階段給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條最初分離階段給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條 件，讓目的菌株大

3、量繁殖。件，讓目的菌株大量繁殖。 (四四) 菌種的復(fù)篩菌種的復(fù)篩 初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是篩初篩之后，還要進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩的目的是篩 選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。 酶活的測(cè)定方法的建立對(duì)其很重要。酶活的測(cè)定方法的建立對(duì)其很重要。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (五五) 對(duì)復(fù)篩獲得菌株的要求對(duì)復(fù)篩獲得菌株的要求 (1)不是致病菌；不是致病菌； (2)菌株不易變易和退化；菌株不易變易和退化； (3)不易感染噬菌體；不易感染噬菌體； (4)微生物產(chǎn)酶量高；微生物產(chǎn)酶量高； (5)酶的性質(zhì)符合應(yīng)用需要，最好是胞外酶；酶的性質(zhì)符合應(yīng)用需要，最好是胞外酶； (6

4、) 便于分離和提取，得率高；便于分離和提取，得率高； (7)微生物培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低。微生物培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求低。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (六六) 最佳產(chǎn)酶條件的初步確定最佳產(chǎn)酶條件的初步確定 (1)培養(yǎng)方式的確定；培養(yǎng)方式的確定； (2)最佳培養(yǎng)條件組合；最佳培養(yǎng)條件組合； (3) 產(chǎn)酶特性產(chǎn)酶特性(胞內(nèi)酶、胞外酶胞內(nèi)酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的時(shí)間順序；微生物酶收集的時(shí)間順序； 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (七七) 微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高 (1)獲得高產(chǎn)菌種的突變體；獲得高產(chǎn)菌種的突變體； (2)利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提高酶產(chǎn)量；利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提高酶產(chǎn)量； (

5、3)運(yùn)用基因工程技術(shù)將原有菌株中目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)用基因工程技術(shù)將原有菌株中目的基因轉(zhuǎn) 移到對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)的菌株內(nèi)，使其高效表移到對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更適應(yīng)的菌株內(nèi)，使其高效表 達(dá)；達(dá)； 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (八八) 微生物酶的提取方法微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提；酶的粗提； (2)酶的精制。酶的精制。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 (九九) 微生物產(chǎn)酶菌種的保藏微生物產(chǎn)酶菌種的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；沙土管； (3)冷凍。冷凍。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 代謝流分析與控制 代謝工程是當(dāng)今國(guó)際生化工程界的新興 交叉學(xué)科，它將計(jì)算機(jī)技術(shù)、自動(dòng)控制、基 因操作技術(shù)與發(fā)酵工程結(jié)合起來，研究生產(chǎn) 過程中細(xì)胞代謝流的分布，

6、利用代謝控制理 論和網(wǎng)絡(luò)剛性理論尋找限制代謝流率的代謝 瓶頸和代謝網(wǎng)絡(luò)中制約轉(zhuǎn)化率提高的酶反應(yīng)， 為定向菌種選育和發(fā)酵控制提供思路。 Glucose = G6P F6P GAP G3P PEP Pyr AcCoA DHAP Ribu5P Rib5PXyl5P 1,6FDP Sed7PE4P aKG Isocit SucCoASuc Mal Oaa Glu Gln NADPH CO2 CO2 NH4+ ATP CO2 CO2 Glu Gln = 細(xì)胞膜 CO2 PEPPyr 細(xì)胞膜 Val Lac Ala 谷氨酸與谷氨酰胺產(chǎn)生代謝網(wǎng)絡(luò)圖 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、

7、脯氨酸代代 謝網(wǎng)絡(luò)圖謝網(wǎng)絡(luò)圖 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第二節(jié) 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長(zhǎng)速度研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長(zhǎng)速度, ,產(chǎn)物生成速度及環(huán)境產(chǎn)物生成速度及環(huán)境 因素對(duì)這些速度的影響因素對(duì)這些速度的影響. . 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式 二、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)二、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) 本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容: : 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究意義酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究意義: : 了解酶生物合成模式了解酶生物合成模式, , 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制, , 提高酶產(chǎn)量提高酶產(chǎn)量. . 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 一、酶生物合成的模式 細(xì)

8、胞生長(zhǎng)一般經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)一般經(jīng)4 4個(gè)階段個(gè)階段, ,如圖如圖: : 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 附：背景知識(shí)微生物生長(zhǎng)的研究微生物生長(zhǎng)的研究 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 固體培養(yǎng)法 好氧培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng) 液體培養(yǎng)法 獲得單細(xì)胞 發(fā)酵罐 （純培養(yǎng)） 厭氧培養(yǎng)（厭氧罐技術(shù)、Hungate滾管 技術(shù)、厭氧手套箱技術(shù)） 一、微生物的培養(yǎng)方法 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 發(fā)酵罐發(fā)酵罐 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 亨蓋特滾管技術(shù)（亨蓋特滾管技術(shù)（hungate roll-tube hungate roll-tube techniquetechnique）：）： n 利用除氧銅柱在350下 與氧反應(yīng)來制備高純度氮， 再用此高純度氮去

9、驅(qū)除培 養(yǎng)基配制、分裝過程中各 種容器和小環(huán)境中的空氣， 使培養(yǎng)基的配制、分裝、 滅菌和貯存，以及接種、 稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、 移種和保藏等操作的全過 程始終處于高度無氧的環(huán) 境下，從而保證了嚴(yán)格厭 氧菌的存活。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 二、微生物的同步生長(zhǎng)及同步培養(yǎng)方法 n同步培養(yǎng)法：使培養(yǎng)基中所有微生物細(xì)胞同步培養(yǎng)法：使培養(yǎng)基中所有微生物細(xì)胞 處于相同的生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)方法。處于相同的生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)方法。 n同步生長(zhǎng)：培養(yǎng)物中所有的微生物細(xì)胞都同步生長(zhǎng)：培養(yǎng)物中所有的微生物細(xì)胞都 處于同一生長(zhǎng)階段，并能同時(shí)分裂的生長(zhǎng)處于同一生長(zhǎng)階段，并能同時(shí)分裂的生長(zhǎng) 方式。方式。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 三、微生物生

10、長(zhǎng)繁殖的測(cè)定方法 （一）測(cè)生長(zhǎng)量 測(cè)體積（離心） 1.直接法 離心法（單細(xì)胞微生物） 稱干重 過濾法（絲狀微生物） 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 比濁法（分光光度計(jì)） 2.間接法 含氮量 生理指標(biāo)法 含碳量 DNA含量測(cè)定 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （二）計(jì)繁殖數(shù) 血球計(jì)數(shù)法 直接計(jì)數(shù)法 涂片計(jì)數(shù)法 涂布平板法 間接計(jì)數(shù)法 倒平板法 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 四、微生物的群體生長(zhǎng) （一）無分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)（一）無分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng) G = t/n 1.特征：指數(shù)生長(zhǎng)。特征：指數(shù)生長(zhǎng)。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 2.無分支單細(xì)胞微生物的群體生長(zhǎng)曲線 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 1.1.遲緩期遲緩期 （

11、1 1）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所 需的酶類、需的酶類、ATPATP等；體積增大；分裂遲緩。等；體積增大；分裂遲緩。 （2 2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底 物的酶。物的酶。 （3 3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、 采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡 量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 n2.對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期 n（1）特點(diǎn)：分裂速度最快、

12、代時(shí)最短、代謝）特點(diǎn)：分裂速度最快、代時(shí)最短、代謝 活動(dòng)旺盛、對(duì)環(huán)境變化敏感?；顒?dòng)旺盛、對(duì)環(huán)境變化敏感。 n（2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料）作用：作為代謝、生理等研究的好材料 和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 3.3.穩(wěn)定期穩(wěn)定期 （1 1）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、 總菌數(shù)達(dá)到最大值、代謝活力鈍化?？偩鷶?shù)達(dá)到最大值、代謝活力鈍化。 （2 2）原因：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的）原因：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的 積累抑制了生長(zhǎng)。積累抑制了生長(zhǎng)。 （3 3）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)

13、物（抗生素、生物堿、）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿、 色素等）、芽孢；對(duì)穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培色素等）、芽孢；對(duì)穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培 養(yǎng)技術(shù)。養(yǎng)技術(shù)。 4.4.死亡期死亡期 特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對(duì)數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對(duì)數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞 裂解或自溶裂解或自溶。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 微生物群體生長(zhǎng)的規(guī)律 生長(zhǎng)曲線代表在新的適應(yīng)環(huán)境中生長(zhǎng)、分裂直至生長(zhǎng)曲線代表在新的適應(yīng)環(huán)境中生長(zhǎng)、分裂直至 衰老、死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。分為遲緩期、衰老、死亡全過程的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。分為遲緩期、 對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期四個(gè)主要的時(shí)期。對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期四個(gè)主要的時(shí)期。 生長(zhǎng)曲線

14、的不同時(shí)期反映的是群體而不是單個(gè)細(xì)生長(zhǎng)曲線的不同時(shí)期反映的是群體而不是單個(gè)細(xì) 胞的生長(zhǎng)規(guī)律。胞的生長(zhǎng)規(guī)律。 認(rèn)識(shí)和掌握微生物的生長(zhǎng)曲線有重要的實(shí)踐意義。認(rèn)識(shí)和掌握微生物的生長(zhǎng)曲線有重要的實(shí)踐意義。 如設(shè)法縮短遲緩期、延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期以及在穩(wěn)定期收如設(shè)法縮短遲緩期、延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期以及在穩(wěn)定期收 集菌體。集菌體。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 調(diào)調(diào) 整整 期期 對(duì)對(duì) 數(shù)數(shù) 期期 穩(wěn)穩(wěn) 定定 期期 衰衰 亡亡 期期 時(shí)間時(shí)間 細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù) 某種細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線 微生物群體生長(zhǎng)的規(guī)律 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 酶生物合成的四種類型酶生物合成的四種類型 比較酶產(chǎn)生與細(xì)胞比較酶產(chǎn)生與細(xì)胞 生長(zhǎng)的關(guān)系生長(zhǎng)的關(guān)系, ,可把可把

15、酶生物合成模式分酶生物合成模式分 成成4 4種類型種類型: : 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 酶生物合成的四種類型 （1 1）同步合成型：）同步合成型： 酶的合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)同步進(jìn)行。（酶的合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)同步進(jìn)行。（FigFig） （2 2）延續(xù)合成型：）延續(xù)合成型： 酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始，生長(zhǎng)進(jìn)入平酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始，生長(zhǎng)進(jìn)入平 衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間。衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間。（FigFig） （3 3）中期合成型）中期合成型 酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，進(jìn)入平酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，進(jìn)入平 衡期后，酶的合成隨之停止。衡期后，酶的合成隨之停止。 （F

16、igFig） (4) (4) 滯后合成型滯后合成型 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，才開始并大量積累酶當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，才開始并大量積累酶 （FigFig） go 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （1 1）酶的生物合成可以誘）酶的生物合成可以誘 導(dǎo)，不受分解代謝物導(dǎo)，不受分解代謝物 阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏；阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏； （2 2）當(dāng)除去誘導(dǎo)物或細(xì)胞）當(dāng)除去誘導(dǎo)物或細(xì)胞 進(jìn)入平衡期后，酶的合成立進(jìn)入平衡期后，酶的合成立 即停止；即停止； （3 3）酶所對(duì)應(yīng)的）酶所對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA很不很不 穩(wěn)定。穩(wěn)定。 Back 同步合成型的特點(diǎn)同步合成型的特點(diǎn) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （1 1）酶的合成可以誘導(dǎo)，不受分解代謝物或產(chǎn)物的

17、阻遏；）酶的合成可以誘導(dǎo)，不受分解代謝物或產(chǎn)物的阻遏； （2 2）酶所對(duì)應(yīng)的）酶所對(duì)應(yīng)的mRNAmRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在生長(zhǎng)平衡期后仍可繼續(xù)較長(zhǎng)相當(dāng)穩(wěn)定，在生長(zhǎng)平衡期后仍可繼續(xù)較長(zhǎng) 時(shí)間用于酶的合成。時(shí)間用于酶的合成。 延續(xù)合成型的特點(diǎn)延續(xù)合成型的特點(diǎn) Back 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 中期合成的特點(diǎn)中期合成的特點(diǎn) （1 1）酶的合成）酶的合成 受到反饋?zhàn)瓒?；受到反饋?zhàn)瓒簦?（2 2）所對(duì)應(yīng)的）所對(duì)應(yīng)的 mRNAmRNA不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。 Back 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （1 1）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期不合成酶（可能期不合成酶（可能 是受到分解代謝物是受到分解代謝物 阻遏的影響）；阻遏的影響）； （2 2）所

18、對(duì)應(yīng)的）所對(duì)應(yīng)的 mRNAmRNA穩(wěn)定性高。穩(wěn)定性高。 滯后期合成型的特點(diǎn)滯后期合成型的特點(diǎn) Back 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （1 1）mRNAmRNA的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性； （2 2）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否。）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否。 影響酶生物合成的模式的主要因素是：影響酶生物合成的模式的主要因素是： （1 1）mRNAmRNA穩(wěn)定性高，細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶；穩(wěn)定性高，細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶； （2 2）mRNAmRNA穩(wěn)定性差，酶的合成隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止；穩(wěn)定性差，酶的合成隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止； （3 3）受某些物質(zhì)阻遏，細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或在平衡期后（解）受某些物

19、質(zhì)阻遏，細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或在平衡期后（解 除阻遏），開始合成酶。除阻遏），開始合成酶。 （4 4）不受某些物質(zhì)阻遏，酶的合成隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而同步增長(zhǎng)。）不受某些物質(zhì)阻遏，酶的合成隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而同步增長(zhǎng)。 規(guī)律：規(guī)律： 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （1 1）選擇最理想的酶合成模式）選擇最理想的酶合成模式延續(xù)合成型；延續(xù)合成型； （2 2）改造非理想模式）改造非理想模式 A A、同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提同步合成型：適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，盡量提 高相應(yīng)的高相應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性； B B、滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝 物阻遏，使酶合成提早開始；

20、物阻遏，使酶合成提早開始； C C、中期合成型：努力提高中期合成型：努力提高mRNAmRNA穩(wěn)定性，解穩(wěn)定性，解 除代謝物阻遏物。除代謝物阻遏物。 選擇與改造選擇與改造 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 二、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 主要研究細(xì)胞生長(zhǎng)速度及其受外界環(huán)境影響的規(guī)律。主要研究細(xì)胞生長(zhǎng)速度及其受外界環(huán)境影響的規(guī)律。 19501950年年, ,法國(guó)的法國(guó)的MonodMonod首先提出表述微生物生長(zhǎng)的動(dòng)力首先提出表述微生物生長(zhǎng)的動(dòng)力 學(xué)方程學(xué)方程, ,細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比. . Rx =dX/dt= X u: 比生長(zhǎng)速率比生長(zhǎng)速率 只存在一種限制性基質(zhì)時(shí)只存在一種限制性基質(zhì)時(shí):

21、: MonodMonod方程是基本的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程方程是基本的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程; ; 從不同情況出發(fā)對(duì)其進(jìn)行修飾從不同情況出發(fā)對(duì)其進(jìn)行修飾. . 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 dx/dt=(-D)X D：稀釋率稀釋率 連續(xù)全混流反應(yīng)器發(fā)酵過程中連續(xù)全混流反應(yīng)器發(fā)酵過程中, ,穩(wěn)態(tài)時(shí)游離細(xì)胞連穩(wěn)態(tài)時(shí)游離細(xì)胞連 續(xù)發(fā)酵的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程續(xù)發(fā)酵的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程: : D=0,分批發(fā)酵分批發(fā)酵; Du細(xì)胞濃度下降細(xì)胞濃度下降,S升高升高,u回升回升; Dum X趨于零趨于零; 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 MonodMonod方程與米氏方程相似方程與米氏方程相似, ,參數(shù)參數(shù)u um m與與KsKs也可也可 由雙倒數(shù)作圖法求

22、出由雙倒數(shù)作圖法求出. . 雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) 宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）: : 從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼, ,研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率 ； 微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）: : 從細(xì)胞內(nèi)部著眼從細(xì)胞內(nèi)部著眼, ,研究細(xì)胞中酶合成速率。研究細(xì)胞中酶合成速率。 1、分類、分類 研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率及各因素對(duì)其的影響研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率及各因素對(duì)其的影響. . 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 X細(xì)胞濃度；細(xì)胞濃度； u細(xì)胞比生長(zhǎng)速率；細(xì)胞比生長(zhǎng)速率； 生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)；生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)

23、； 非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率。非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率。 2、宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程通式、宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程通式 dE/dt=(+)x （1 1）同步合成型：生長(zhǎng)偶聯(lián)型）同步合成型：生長(zhǎng)偶聯(lián)型 =0=0，dE/dt=dE/dt=X X （2 2）中期合成型：特殊生長(zhǎng)偶聯(lián)型）中期合成型：特殊生長(zhǎng)偶聯(lián)型 =0=0，dE/dt=dE/dt= X X 有阻遏存在時(shí)，有阻遏存在時(shí)， =0 =0，無酶產(chǎn)生，無酶產(chǎn)生 dE/dt=dE/dt= 0 0 阻遏解除后才開始合成酶阻遏解除后才開始合成酶. . 細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)關(guān)系也不同。細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)關(guān)系也不同。 討論

24、討論: : 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 （3 3）滯后合成型：非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，）滯后合成型：非生長(zhǎng)偶聯(lián)型， =0 , =0 , dE/dt=XdE/dt=X （4 4）延續(xù)合成型：部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，）延續(xù)合成型：部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型， 00， 00 dE/dt=dE/dt= X+XX+X 有關(guān)模型參數(shù)一般通過線性化處理及嘗試有關(guān)模型參數(shù)一般通過線性化處理及嘗試 誤差法求出誤差法求出. . dE/dt=(+)x 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 RA、Ri：有、無活性的阻遏蛋白；有、無活性的阻遏蛋白；Si、Sr：誘導(dǎo)物和阻遏物；誘導(dǎo)物和阻遏物； cc：環(huán)腺苷酸接受蛋白環(huán)腺苷酸接受蛋白CRP與環(huán)腺苷酸與環(huán)腺苷酸CAMP的復(fù)合物；的復(fù)合物

25、； RSi：RA與與Si的結(jié)合物，不與操縱基因結(jié)合；的結(jié)合物，不與操縱基因結(jié)合； RSr：Ri與與Sr的結(jié)合物，可與操縱基因結(jié)合，而使的結(jié)合物，可與操縱基因結(jié)合，而使 mRNA無法合成無法合成 。 N：RNA的分解產(chǎn)物。的分解產(chǎn)物。 附附:3、微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)、微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) （1）細(xì)胞內(nèi)酶生物合成的一般模型）細(xì)胞內(nèi)酶生物合成的一般模型 （cf.P54) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 M：細(xì)胞中細(xì)胞中mRNA濃度（濃度（mol/L） E：細(xì)胞中酶濃度（細(xì)胞中酶濃度（U/L） ：細(xì)胞比生長(zhǎng)速率（細(xì)胞比生長(zhǎng)速率（h-1） 對(duì)非生長(zhǎng)偶聯(lián)型對(duì)非生長(zhǎng)偶聯(lián)型,u=0 （2）酶的生物合成速率）酶的生物合成速率 dE/dt=

26、K10M E 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 假設(shè)細(xì)胞中假設(shè)細(xì)胞中K1和和DNA濃度為常數(shù)濃度為常數(shù). mRNA濃度濃度: dM/dt=k7CC-k11N- M cc濃度濃度: dCC/dt=k4CRPcAMP-k-4CC- CC CRP濃度濃度: dCRP/dt=k1DNA-k4CRPcAMP+k-4CC- CRP n(注：注：M、CC、CRP與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)）與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)） （3）受分解代謝物阻遏的酶生物合成模型）受分解代謝物阻遏的酶生物合成模型 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 假設(shè)假設(shè)K2和和DNA濃度為常數(shù)濃度為常數(shù), ndM/dt=k8RSi-k11M- M ndRSi/dt=k5RASi-k-5RSi- RSi

27、ndRA/dt=k2DNA-k5RASi+k-5RSi- RA （4）誘導(dǎo)系酶合成模型）誘導(dǎo)系酶合成模型 （CRP與與CAMP復(fù)合物的濃度足量或過量）復(fù)合物的濃度足量或過量） 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 K3和和DNA濃度設(shè)定為常數(shù)：濃度設(shè)定為常數(shù)： ndM/dt=k9Ri-k11M- M ndRi/dt=k3DNA-k6RiSr+k-6RSr- Ri ndRSr/dt=k6RiSr-k-6RSr- RSr （5）阻遏系酶合成模型）阻遏系酶合成模型 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)的估算是一項(xiàng)重要?jiǎng)恿W(xué)模型參數(shù)的估算是一項(xiàng)重要 又復(fù)雜的問題又復(fù)雜的問題; 參數(shù)值是通過大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析估參數(shù)值是通過大量實(shí)驗(yàn)數(shù)

28、據(jù)分析估 算出來的算出來的; 數(shù)據(jù)呈隨機(jī)性數(shù)據(jù)呈隨機(jī)性,有時(shí)借助數(shù)學(xué)方法和有時(shí)借助數(shù)學(xué)方法和 計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī). 實(shí)際發(fā)酵過程非常復(fù)雜實(shí)際發(fā)酵過程非常復(fù)雜,以上模型進(jìn)行以上模型進(jìn)行 修正和發(fā)展才可修正和發(fā)展才可; 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 第五節(jié) 固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 又稱固定化活細(xì)胞、固定化增殖細(xì)胞又稱固定化活細(xì)胞、固定化增殖細(xì)胞, ,用各種方法固用各種方法固 定在載體上又能進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。定在載體上又能進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。 是是7070年代后期年代后期(1978)(1978)發(fā)展起來的技術(shù)發(fā)展起來的技術(shù); ; 在發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等胞外酶方面在發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶、蛋白

29、酶、纖維素酶等胞外酶方面 取得了成功。取得了成功。 固定化細(xì)胞：固定化細(xì)胞： 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 一、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)；一、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn)； 二、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)；二、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)； 三、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制。三、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制。 本節(jié)主要內(nèi)容：本節(jié)主要內(nèi)容： 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 一、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn) 1 1、提高產(chǎn)酶率：細(xì)胞密度增大、提高產(chǎn)酶率：細(xì)胞密度增大 生化反應(yīng)加速生化反應(yīng)加速 產(chǎn)酶率提高產(chǎn)酶率提高 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點(diǎn) 2 2、可在高稀釋度下連續(xù)發(fā)酵：、可在高稀釋度下連續(xù)發(fā)酵：D D不影響固定

30、化細(xì)胞不影響固定化細(xì)胞; ; 3 3、基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失；、基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失； 4 4、發(fā)酵穩(wěn)定性好：細(xì)胞受載體保護(hù)，、發(fā)酵穩(wěn)定性好：細(xì)胞受載體保護(hù)，pHpH和和T T適應(yīng)性寬；適應(yīng)性寬； 5 5、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率； 6 6、產(chǎn)品容易分離純化；、產(chǎn)品容易分離純化； 7 7、適于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。、適于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 二、固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制 與游離細(xì)胞發(fā)酵大同小異，需特別注意的幾個(gè)問題：與游離細(xì)胞發(fā)酵大同小異，需特別注意的幾個(gè)問題： 1 1、固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)、固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)

31、先預(yù)培養(yǎng)，使固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，長(zhǎng)好后，再用于發(fā)酵先預(yù)培養(yǎng)，使固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，長(zhǎng)好后，再用于發(fā)酵 產(chǎn)酶，其培養(yǎng)基和工藝條件可以相同或不同。產(chǎn)酶，其培養(yǎng)基和工藝條件可以相同或不同。 2 2、溶解氧的供給、溶解氧的供給 由于受到載體的影響，使氧的供給成為主要的限制性因素。由于受到載體的影響，使氧的供給成為主要的限制性因素。 解決辦法：解決辦法： （1 1）加大通氣量（強(qiáng)烈攪拌會(huì)破壞固定化細(xì)胞）；）加大通氣量（強(qiáng)烈攪拌會(huì)破壞固定化細(xì)胞）； （2 2）改變固定化載體，如少用瓊脂等對(duì)氧擴(kuò)散不利的載體；）改變固定化載體，如少用瓊脂等對(duì)氧擴(kuò)散不利的載體； （3 3）過氧化氫酶與細(xì)胞共固定

32、化，培養(yǎng)基加入適量的）過氧化氫酶與細(xì)胞共固定化，培養(yǎng)基加入適量的H H2 2O O2 2； （4 4）降低培養(yǎng)基的濃度，以降低培養(yǎng)基的粘度。降低培養(yǎng)基的濃度，以降低培養(yǎng)基的粘度。 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 3 3、溫度的控制、溫度的控制 連續(xù)發(fā)酵時(shí)，由于連續(xù)發(fā)酵時(shí)，由于D D較高，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較較高，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較 大，先預(yù)調(diào)流加液溫度。大，先預(yù)調(diào)流加液溫度。 4 4、培養(yǎng)基成份的控制、培養(yǎng)基成份的控制 某些固定化載體的結(jié)構(gòu)會(huì)受到某些成份的影響，某些固定化載體的結(jié)構(gòu)會(huì)受到某些成份的影響， 如過量的磷酸鹽會(huì)破壞海澡酸鈣凝膠制備的固定化如過量的磷酸鹽會(huì)破壞海澡酸鈣凝膠制備的固定化 細(xì)胞。細(xì)胞。 第二

33、章發(fā)酵產(chǎn)酶 三、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué) n固定化細(xì)胞體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的動(dòng)力學(xué)描述基固定化細(xì)胞體系中細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的動(dòng)力學(xué)描述基 本與游離細(xì)胞體系相同本與游離細(xì)胞體系相同; ; n在固定化細(xì)胞體系中細(xì)胞分兩部分在固定化細(xì)胞體系中細(xì)胞分兩部分, ,一部分是固定一部分是固定 在載體上的細(xì)胞在載體上的細(xì)胞, ,濃度基本穩(wěn)定濃度基本穩(wěn)定; ;一部分是泄露到培一部分是泄露到培 養(yǎng)液中的細(xì)胞養(yǎng)液中的細(xì)胞, ,如同游離細(xì)胞一樣如同游離細(xì)胞一樣; ; n因此在描述時(shí)分兩部分因此在描述時(shí)分兩部分 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 由于泄露，體系中包括由于泄露，體系中包括 固定和游離細(xì)胞。固定和游離細(xì)胞。 dx/dt=(dx

34、/dt)dx/dt=(dx/dt)g g+(dx/dt)+(dx/dt)f f = =g gx xg g+ + f fx xf f = = mg mgsx sxg g/(k/(ksg sg+s) +s) + +mf mfsx sxf f/(k/(ksf sf+s) +s) 一般，一般，mg mg mf mf 故固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng)故固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng) 明顯受抑制。明顯受抑制。 1 1、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué) 第二章發(fā)酵產(chǎn)酶 一般認(rèn)為：固定在凝膠中的細(xì)胞的產(chǎn)酶模式為非生長(zhǎng)偶一般認(rèn)為：固定在凝膠中的細(xì)胞的產(chǎn)酶模式為非生長(zhǎng)偶 聯(lián)型聯(lián)型; ;游離細(xì)胞的產(chǎn)酶速率依細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同而不同。游離細(xì)胞的產(chǎn)酶速率依細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同而不同。 dE/dt = (dE/dt)dE/dt =