PPARβδ激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響(可編輯)

1、ppar激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響 中山大學博士學位論文ppar/激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響姓名:張會杰申請學位級別:博士專業(yè):藥理學指導教師:劉培慶20070528/激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響專業(yè): 藥理學博士生: 張會杰導師: 劉培慶教授中文摘要高血壓病是一種常見病、多發(fā)病,極易導致心、腦、腎等靶器官損害,嚴重威脅人類的健康。其中,由心臟成纖維細胞 。增殖和膠原表達過多所導致的心肌纖維化是高血壓心室肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理過程,是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)。目前心肌纖維化的確切發(fā)病機制并不十分明確,但近年來心肌纖維化的治

2、療已成為國內(nèi)外研究的熱點。其中,過氧化物酶體增殖劑激活型受體 ? ,與心肌纖維化的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。和鼬激活可以抑制心肌纖維化,但與它們結(jié)構(gòu)和功能相類似的/對心肌纖維化的作用卻未見報道。本研究旨在細胞水平模擬心肌纖維化,探索/激活對血管緊張素,誘導的成年大鼠膠原表達和細胞增殖的影響及其可能的機制,為心肌纖維化的治療提供新的作用靶點,以有利于抗心肌纖維化藥物的研發(fā)。第章成年大鼠心肌成纖維細胞/的表達情況目的:/體內(nèi)分布廣泛,其中心臟/表達水平較高。心臟主要由心肌細胞和組成。心肌細胞表達邸,但是否表達邛/至今尚未皇些盔堂蔓主堂垡堡塞 墜墾墮燮煎墅盔基:堅墼盛塹絲塑墮墮墮耋壟塑墊墼塑墮叢墅墮

3、見報道。本研究體外成功地培養(yǎng)了成年大鼠,并在此基礎之上探討成年大鼠是否表達/。方法:.采用膠原酶一胰酶一膠原酶消化和差速貼壁法分離成年大鼠。倒置顯微鏡和免疫細胞化學染色鑒定細胞,同時繪制細胞生長曲線了解生長特性。.以乳鼠心肌細胞作為陽性對照,采用和 研究成年大鼠是否表達/。.從水平研究中 個亞型的表達情況。結(jié)果:.采用膠原酶胰酶一膠原酶法分離細胞,細胞收率高,而且培養(yǎng)成本較低。倒置顯微鏡,原代培養(yǎng)的呈梭形或不規(guī)則三角形,胞質(zhì)淡折光性強,細胞核較大,呈橢圓形,無自發(fā)性搏動。培養(yǎng)的細胞波形蛋白染色陽性,因染色陰性,.染色陰性,符合染色特征,細胞純度大于%。第.代的生長曲線無明顯差異,適于開展細胞實

4、驗。.成年大鼠在和蛋白兩個水平都檢測到鄧/表達,而且的/表達量較心肌細胞低.。.同時表達個亞型,/和表達量較高,而表達量最低.。結(jié)論:我們建立的成年大鼠培養(yǎng)方法成本較低,細胞收率較高,細胞純度高,第代細胞適于開展相關(guān)實驗。成年大鼠表達/,而且在個亞型中表達量較高。表達邸/是開展后續(xù)實驗的前提和基礎。關(guān)鍵詞:細胞培養(yǎng);/;受體表達;第章對心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響目的:和激活可以抑制心肌纖維化,但與它們結(jié)構(gòu)和功能相類似的誘導的成/對心肌纖維化的效應卻未見報道。本研究成功地建立了年大鼠膠原表達和細胞增殖的模型,并在此基礎之上探討岬激動劑對細胞膠原表達和細胞增殖的影響。方法:.摸索四年大

5、鼠膠原表達和細胞增殖的量效和時效關(guān)系,建誘導的膠原表達和細胞增殖模型。立.利用法探索成年大鼠使用的安全劑量范圍。.采用、摻入和.摻入等方法,探討對誘導的成年大鼠膠原表達、膠原合成和細胞增殖的影響。結(jié)果:.作用于,可以濃度依賴和時間依賴地促進表達型膠原。.作用于.,可以濃度依賴和時間依賴地增加對.的攝取量。.對的細胞數(shù)無影響儼. .對照組,而的明顯地降低的細胞數(shù)尸. .對照組。.小預處理 ,可以濃度依賴性地抑制誘導的膠原表達和膠原合成,而本身對細胞的膠原表達和膠原合成的無影響?！皾舛纫蕾囆缘匾种普T導的攝取,而不影響細胞對.的基礎攝取量。結(jié)論:成功建立 誘導的膠原表達和細胞增殖的細胞模型。/激動劑

6、可以抑制誘導的細胞膠原表達和細胞增殖,其中抑制細胞膠原表達的效應與其降低細胞膠原的合成有關(guān)。關(guān)鍵詞:;膠原表達;細胞增殖;細胞培養(yǎng)第章/激活介導對心肌成纖維細胞的效應目的:可以抑制誘導的細胞膠原表達和細胞增殖。的效應除町能通過激活郵來實現(xiàn)外,也町能通過調(diào)節(jié)的表達量或通過不依賴于/的途徑來實現(xiàn)。本研究觀察了對 /表達量的影響,并利用干擾,來探索的作用是否依賴于階。方法:.采用和 探討是否影響 /的表達量。.以作為陰性對照,對針對/的、和轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細胞后,和 檢測各組細胞邸/的表達水平,篩選有效干擾序列。.有效于擾序列抑制細胞/表達后,采用 、.誘導的細胞膠原表達、膠原合成和?摻入等方法研究對和細

7、胞增殖的效應有無變化。結(jié)果:.、和組細胞/的表達量與對照組相比無差異.。不影響. .對照組。而對/的表達儼.對都顯著地抑制細胞/的和蛋白表達儼.和蛋白表照組,其中的抑制作用最強,分別降低/達%和%。.抑制/表達后,逆轉(zhuǎn)了對誘導的細胞膠原表達、膠原合成和細胞增殖的抑制作用儼.組。而 對的效應無影響妒.組。結(jié)論:不影響 /的受體表達量:能顯著地抑制/的表達;對的效應具有/依賴性。因此,/激活介導了對的效應。關(guān)鍵詞:酬。爐翼廄受冀斧。裴培養(yǎng)第章初步探討/激活所產(chǎn)生效應的機制目的:本實驗旨在研究/激活所產(chǎn)生效應的可能機制。以往的研究表明,誘導的膠原表達和細胞增殖可能與其刺激細胞生成活性氧,有關(guān)。而激動

8、藥通過調(diào)節(jié)細胞的生成,可以抑制細胞膠原表達和細胞增殖。鄧/的效應也可能與其調(diào)節(jié)細胞的生成有關(guān)。方法:.熒光顯微鏡和流式細胞儀測定是否影響誘導的生成。.采用、摻入和.摻入等方法,探討是否參與對膠原表達、膠原合成和細胞增殖的抑制作用。結(jié)果:的生成顯著增加.,.與對照組相比,組組細胞的生成無明顯變化尸.。而預處理后顯著地抑.組。制誘導的生成.促進膠原表達、膠原合成和細胞增殖,而生成抑制劑.和可以同等程度地抑制誘導的細胞膠原表達、膠原合成和細胞增殖。結(jié)論:抑制誘導的膠原表達和細胞增殖的作用與其抑制細胞的生成有關(guān)。參與了/激活所產(chǎn)生的效應。關(guān)鍵詞:;怕:;膠原表達;細胞增殖論文總結(jié):本研究首次發(fā)現(xiàn)成年大

9、鼠表達/,鄧/激動劑可以抑制誘導的膠原表達和細胞增殖,的效應與其激活胂和抑制生成有關(guān)。我們的研究為/激動劑用于心肌纖維化的治療提供了依據(jù),將有利于抗心肌纖維化藥物的研發(fā)。主坐盔堂墮主堂垡墮皇 墜墾箜堂適塾盔基:堂墼墮塹絲塑墮壁堡耋壟塑塑墮壟墮塑墅墮 /: :. , . .,. 勰., .,事/一 . .墜墾墮塑適型盔墾:堅盟盛塹絲塑墮墮墮室姿塑塑墮塑墮盟墅墮坐盔堂堡主堂堡迨塞/ . / ./ , ./.,. . . /. .,. %. . . ./ .?/. /./, .;/; ; ., / , / ,. . .,.? .?一. 尸. .,兒 . . 一 . ?. ?一“ . ? . .; ;

10、 ;/,. , . ,./. / .墨/ .,. . .,.缸. ./ ./仃 妒.,/晰儼.% %,邵/ .鄧/. ,. / ./ .,/些盔堂豎主堂堡絲塞墜曼墮絲堡型盔墾:壘盟盛塹絲塑墮墮墮塞壟塑塑墮絲墮盟墅墮.;/; ; / ?. ,. /. . . . ?. , 儼. /? .,墜墨咝壅適墅盔基:壘墼墮塹絲塑墮墮墮耋壟塑塑墮絲墮盟芝旦生坐盔堂墮主堂垡迨窒., ,.烈/.;, 氣岱/ / / .,口/ . 縮略詞表前 言高血壓病是一種常見病、多發(fā)病,極易導致心、腦、腎等靶器官損害,嚴重威脅人類的健康。其中高血壓左室肥厚既是高血壓病重要的并發(fā)癥,又是心肌梗死、心力衰竭和猝死等心臟事件的獨立

11、危險因素。高血壓左室肥厚主要包括兩方面的改變:心肌細胞肥大、肌絲排列紊亂及收縮力下降;心臟成纖維細胞過度增殖和膠原表達增多,兩者共同構(gòu)成了左室肥厚的細胞病理學基礎【”。增殖和膠原表達過多所導致的心肌纖維化是左室肥厚由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理過程,是引發(fā)心力衰竭的核心環(huán)節(jié)。目前心肌纖維化的確切發(fā)病機制并不十分明確】,但近年來心肌纖維化的治療已成為國內(nèi)外研究的熱點。其中,過氧化物酶體增殖劑激活型受體與心肌纖維化的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。心肌纖維化心臟由心肌細胞和間質(zhì)細胞組成。心肌細胞占心臟總體積的%,但細胞數(shù)僅占心臟細胞總數(shù)的/。出生后心肌細胞喪失增殖能力,是高度分化的終末細胞,主要起收縮功能

12、【】。問質(zhì)細胞由、微血管平滑肌細胞、神經(jīng)細胞、巨噬細胞等組成,它們僅占心臟體積的%,但其細胞數(shù)占心臟細胞總數(shù)的/。約占心臟細胞總數(shù)的%,非心肌細胞的%,是合成心肌膠原的主要細胞,也是心肌纖維化的主要效應細胞【】。心肌纖維化主要的病理特征是過度增殖和膠原表達增多【。心肌纖維化使心肌硬度增加,順應性下降,導致心臟舒張、收縮和傳導功能都發(fā)生障礙,同時致動脈血管壁增生,管腔縮小,毛細血管密度降低,心肌血供減少,心肌功能受損【】。因此,心肌纖維化是心力衰竭、心律失常和猝死發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前心肌纖維化的確切發(fā)病機制并不十分明確。以前的研究認為,心肌纖維化的形成過程中,心室負荷增加等血流動力學因素起著決定

13、性作用。但近來研究發(fā)現(xiàn),上述觀點并不正確,具體原因如下:單純心臟容量負荷增加和心肌組織牽張并不足以導致心肌纖維化。高血壓心臟病患者心肌纖維化不僅出現(xiàn)主些盔堂墮主堂魚堡塞 墜墾竺塑塹型盔基:壘墼盛塹笙塑墮墮墮壅壟塑塑墮塑墮笪墅墮在左心室,也出現(xiàn)在右心室,甚至室間隔。等【采用免疫組織化學方法研究發(fā)現(xiàn),在不同的高血壓模型中,血管周圍纖維化不僅出現(xiàn)在肥厚的左心宦,而且也出現(xiàn)在未發(fā)生肥厚的右心室。降壓藥物逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的能力不依賴于其降壓療效【。心肌纖維化可能是刺激膠原合成的因子和抑制膠原合成的因子作用失衡所致,當刺激膠原合成的因子增多和/或抑制膠原合成的因減少,其總效應即表現(xiàn)為刺激膠原合成,促進心肌纖

14、維化【】。促進膠原合成的因子有、轉(zhuǎn)化生長因子.。、內(nèi)皮素.和醛固酮掣,;抑制膠原合成的因子有前列腺素、氧化氮和緩激肽等?。心肌纖維化主要分為以下三種類型,】:反應性血管周圍纖維化:心肌膠原首先在心臟冠狀動詠周圍聚集,這是心肌纖維化的早期階段,也是程度最輕的心肌肌纖維化。間質(zhì)纖維化:心肌膠原由冠狀動脈周圍擴展到生理狀態(tài)無膠原存在的肌間隙。修復性或替代性纖維化:心肌細胞周圍膠原沉積的增多和膠原類型的改變降低了心肌收縮的勢能儲備,使心臟的后負荷增高,這種收縮能力和后負荷的不平衡導致心肌細胞壞死。為了維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性,壞死心肌細胞周圍的增殖、合成新的膠原,替代已經(jīng)壞死的心肌細胞,形成“疤痕”

15、。目前心肌纖維化的研究主要采用兩類模型:體內(nèi)模型和體外模型【。體內(nèi)模型包括醋酸脫氧皮質(zhì)酮鹽大鼠、腹主動脈縮窄大鼠,灌注大鼠等。體外模型有、缺氧復氧、醛固酮等誘導的膠原表達和細胞增殖。其中,誘導的膠原表達和細胞增殖是目前最常用的心肌纖維化體外模型,本研究亦采用該體外模型。二心肌纖維化的治療目前心肌纖維化的治療已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點,可能用于心肌纖維化治療的藥物主要有如下幾類:一抑制腎素一血管緊張素系統(tǒng)的藥物腎素一血管緊張素系統(tǒng)通過產(chǎn)生作用于心肌上的受體,可以促進增殖、膠原蓄積和整體動物發(fā)生心肌纖維化抑制腎素一血管緊張素系統(tǒng)的藥物可以用于治療心肌纖維化,此類藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥和受體阻

16、斷藥。一系列動物實驗表明,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥一群多普利【】、喹那普利、雷米普利刀和賴諾普利【朝能夠減輕大鼠心肌膠原沉積、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化。動物實驗的結(jié)果在臨床研究中得到了進一步的驗證。一項研究采用賴諾普利治療左室肥厚伴左室舒張功能減退的高血壓病人,藥物治療個月后,病人左室舒張功能顯著改善,心肌纖維化明顯減少【】。等【報道高血壓心臟病患者采用培哚普利治療個月后,動脈纖維化顯著降低,冠脈血流顯著增加。動物實驗表明受體阻斷藥一氯沙坦能夠促進自發(fā)性高血壓大鼠心臟的膠原降解,抑制心肌纖維化【.在一項名高血壓心臟病患者參與的臨床試驗中,氯沙坦治療個月后,病人的心肌纖維化程度明顯降低【。雖然動物實驗和臨床

17、研究均證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥和受體阻斷藥具有抗心肌纖維化作用,但目前臨床研究樣本數(shù)均較少皆小于例,因此尚需大規(guī)模的隨機對照臨床試驗進一步驗證。二醛固酮拮抗藥近年來,人們發(fā)現(xiàn)醛固酮拮抗藥可以減輕心肌纖維化。體外研究表明,醛固酮可以促進合成膠原,而安體舒通可以阻止醛固酮的效應捌。這一效應也在動物實驗中得到了證實,安體舒通可以抑制醛固酮誘導的心肌纖維化嘲,安體舒通和依普利酮均能降低自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的程度瞄,。但迄今為止,尚無臨床證據(jù)表明醛固酮拮抗藥能減輕高血壓心臟病患者的心肌纖維化。三內(nèi)皮素受體拮抗藥表達和受體,通過作用于受體,可以促進增殖和細胞合成膠原、提高基質(zhì)金屬蛋白酶的活性【。受

18、體拮抗藥可以誘導的增殖和膠原代謝【。受體拮抗藥也可以抑制抑制和鹽大鼠的心肌纖維化囂。但臨床研究表明,受體拮抗藥對于慢性心衰患者發(fā)生的急性心肌梗塞沒有改善作用【。四他汀類藥物他汀類藥物是臨床上常用的降血脂類藥物,但近來研究發(fā)現(xiàn)其具有抗心肌纖維化的作用。他汀類藥物町以降低壓力超負荷動物和肥厚性心肌病動物的心肌纖維化“。他汀類藥物也能夠抑制.還原酶,減少其下游產(chǎn)物甲羥戊酸的合成,使蛋白不能在細胞膜上的定位和活化,從而抑制的增殖【】。但目前尚無臨床試驗證實他汀類藥物口丁以抑制心肌纖維化。五抗細胞因子治療目前,系統(tǒng)研究過的抗纖維化細胞因子有腫瘤壞死因子.,干擾素叫和.,其中有關(guān)的研究最多。?是重要的促纖

19、維化生長因子,活化的.町以抑制的降解、促進的合成。掣采用.中和性抗體降低了壓力超負荷大鼠的心肌纖維化。等九發(fā)現(xiàn).中和性抗體可以拮抗.的致肝纖維化作用。六代謝抑制劑心肌纖維化過程中,細胞外基質(zhì),代謝紊亂起了非常重要的作用。作用于代謝關(guān)鍵酶如的藥物可以治療心肌纖維化。等【】研究發(fā)現(xiàn),非選擇性抑制劑一可以降低心梗小鼠的左心室擴張和纖維化。類似的研究中,非選擇性抑制劑.町以減輕大鼠心肌纖維化,部分恢復心臟的功能【】。多西環(huán)素是唯一批準臨床使用的抑制劑,但其適應癥僅限于治療牙周疾病【】。目前,尚無臨床試驗證實多西環(huán)素可以抑制心肌纖維化。七毗非尼酮吡非尼酮是一種解熱鎮(zhèn)痛藥,不少研究表明吡非尼酮具有抗纖維化

20、作用。吡非尼酮能夠抑制鹽大鼠的左室肥厚和心肌纖維化四,減輕阿霉素誘導的心臟氧應激損傷和后續(xù)的心肌纖維化刺。另外,吡非尼酮也能抑制博來霉素誘導的肺纖維化。吡非尼酮抗纖維化的機制并不十分清楚,可能與其降低.表達從而抑制成纖維細胞增殖和膠原合成有關(guān)【。吡非尼酮治療特發(fā)性肺纖維化和腎小管間質(zhì)性纖維化的期臨床試驗已經(jīng)在進行【,但其對心肌纖維化的效果還有待于臨床試驗進行評價。八曲尼司特曲尼司特屬鄰氨基苯甲酸類抗炎藥,臨床上常用于皮膚疾病和過敏性疾病的治療,近來發(fā)現(xiàn)曲尼司特具有抗心肌纖維化作用。等采用鹽大鼠模型證實曲尼司特可以抑制心肌纖維化。九核受體激動藥和激動藥,詳見下一部分。三過氧化物酶體增殖劑激活型受

21、體年等首先發(fā)現(xiàn)了一種新的核受體,它能被過氧化物酶體增殖劑 ,激活,而被命名為過氧化物酶體增殖劑激活型受體 ,。還能被脂肪酸及其代謝產(chǎn)物激活而被稱為脂肪酸受體。迄今為止,哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)種亞型:./和。各亞型結(jié)構(gòu)相似,但組織分布和配體有所差異【】。結(jié)構(gòu)模式見圖,可分為個結(jié)構(gòu)域或個功能域。氨基端的/區(qū)是調(diào)節(jié)域;中部的區(qū)是結(jié)合域;區(qū)是連接域:羧基端的/區(qū)是配基結(jié)合域。主要分布在肝臟、心臟、腎臟和褐色脂肪組織,是貝特類藥物如非諾貝特作用靶點;.主要分布在脂肪組織中,是噻唑烷二酮類化合物如羅格列酮作用靶點;毋/分布較為廣泛,沒有組織特異性,、和是其特異性配體。圖 的結(jié)構(gòu)模式圖屬于型核受體,小分子的激動劑

22、進入細胞核內(nèi)后,結(jié)合到的上,激活。目前認為活化的可能通過兩種機制一轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制機制而發(fā)揮作用,具體作用模式見圖。配體激活的首先與核內(nèi)的維甲酸受體結(jié)合形成異源二聚體,特異性地結(jié)合靶基因啟動子中的反應元件,促進目的基因轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮相應的作用,這種作用機制稱之為轉(zhuǎn)錄激活。另外,活化的不與結(jié)合,通過蛋白一蛋白日】相互作用,調(diào)節(jié)核因子,、激活蛋白一,、信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活等的活性,影響相應基因的轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮作用,這種作用機制稱之為轉(zhuǎn)錄抑制【.。審琴審.:敲矗。孟鬟念毒 箏聲效盔孫一.冀,了,繭,一艫耐口舛. 最 圖 弛的作用模式圖配體激活后的可能對某些細胞的生長、分化甚至凋亡產(chǎn)生重要的影響。文獻表

23、明與動脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥大和心肌纖維化等心血管疾病、糖尿病、肥胖和某些腫瘤細胞的生長有密切關(guān)系陸。四與心肌纖維化目前有關(guān)心肌纖維化治療的研究較多,但絕大多數(shù)藥物都處在細胞和動物實驗階段,僅有少數(shù)藥物進入臨床試驗階段,但效果并不令人滿意【】。因此,研發(fā)新的抗心肌纖維化藥物成為人們迫切的要求。中山大學博士學位論文/激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響近年來,與心肌纖維化的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。大量的研究證實,激動藥具有抗心肌纖維化的作用。等卵采用灌注的大鼠研究了激動藥非諾貝特對心肌纖維化和心肌炎癥的影響。非諾貝特通過降低的活性,減少致炎因子.、.、和.的生成,從而抑制誘導的

24、大鼠心肌膠原蓄積和心肌炎癥。等】研究表明非諾貝特能夠抑制腹主動脈縮窄大鼠和鹽大鼠的心肌纖維化。前者與非諾貝特抑制.活性,減少生成量有關(guān)。后者與非諾貝特抑制.活性,減少致炎因子.,、.和.的生成有關(guān)。石榴花提取物是和的雙重激動劑,通過調(diào)節(jié).的活性可以減輕糖尿病脂肪大鼠的心肌纖維化四.一系列體內(nèi)外實驗表明,激動藥可以抑制心肌纖維化。等發(fā)現(xiàn)羅格列酮減輕鹽大鼠心肌纖維化的作用部分與其降低.活性、減少的生成量有關(guān)。缺氧復氧可以刺激增殖、型膠原表達和表達,這可能與缺氧復氧增加細胞活性氧,的生成有關(guān)眥】。匹格列酮通過減少的生成,降低.的活性,可以抑制缺氧復氧刺激的增殖和膠原表達【,】。大量文獻表明,可以促進

25、膠原表達誘導細胞產(chǎn)生有關(guān)口?,嘲。和細胞增殖【槔蛔,這些作用可能與等【例研究發(fā)現(xiàn)匹格列酮可以抑制誘導的細胞型膠原和.表達,這與匹格列酮減少細胞的生成,抑制.的激活有關(guān)。匹格列酮與帕伐他增加,抑制細胞的激活、細胞增汀合用可以調(diào)節(jié)誘導的殖和型膠原表達。綜上,和激動藥可以抑制心肌纖維化,這可能與藥物抑制生成和或調(diào)節(jié)與和的相互作用有關(guān)。心臟表達/,而且鄧/的配體結(jié)合域和結(jié)合域與和有%.%的同源序列四,但/激活是否可以抑制心肌纖維化尚未見文獻報道。目前,有關(guān)的研究主要集中在和,而/研究相對較少。這可能與/非特異性分布,無激動藥上市,以及選擇性激動劑、.和等出現(xiàn)較晚年有關(guān)。相關(guān)研究表明,激動劑可以上調(diào)心肌

26、細胞的過氧化物酶,抑制誘導的心肌細胞凋亡【。另外,研究發(fā)現(xiàn)激活的/可以與.或.相互作用,從面抑制心肌細胞肥大他切。以上文獻提示/撤活可能具有調(diào)節(jié)、?和?的作用。由此,我們提出了設想:激活的也可能具有抑制心肌纖維化的能力。五研究內(nèi)容本研究旨在細胞水平模擬心肌纖維化。探索.倍激活對誘導的成年大鼠膠原表達和細胞增殖的影響及其可能的機制,為心肌纖維化的治療提供新的作用靶點,以有利于抗心肌纖維化藥物的研發(fā).圖是本研究的流程圖.據(jù)圖,本課題的研究內(nèi)容可以分為以下四部分:第部分成年大鼠心肌成纖維細胞/的表達情況第部分對誘導的細胞膠原表達和細胞增殖的影響第部分/激活與對心肌成纖維細胞的效應第部分初步探討,激活

27、所產(chǎn)生效應的機制/甲一圓隧固圖研究流程圖第章成年大鼠心肌成纖維細胞/的表達情況年等首先發(fā)現(xiàn)了一種新的甾體激素類受體,它能被過氧化物酶體增殖劑激活,而被命名為過氧化物酶體增殖劑激活型受體,。目前,哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)種亞型:,/和?！绢?。/體內(nèi)分布廣泛,在心臟、骨骼肌、肝臟和小腸中表達水平較高;在內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞和膠質(zhì)細胞中也有表達。心臟主要由心肌細胞和組成。心肌細胞占心臟總體積的%,細胞數(shù)占心臟細胞總數(shù)的/。心肌細胞表達/,目前有關(guān)心肌細胞/的研究開展較多【“?徹。約占心臟細胞總數(shù)的%,但是否表達邢/至今尚未見報道。本實驗體外成功地培養(yǎng)了成年大鼠,并在此基礎之上研究了成年大鼠是否

28、表達/。材料與方法一材料實驗動物雄性大鼠,體重范圍:?,中山大學實驗動物中心提供。.天的乳鼠,中山大學實驗動物中心提供。主要試劑培養(yǎng)基 美國公司小牛血清 美國公司膠原酶 美國公司胰蛋白酶美國公司酶美國公司美國公司美國公司雙抗美國公司粉 武漢博士德公司粉美國公司免疫組化試劑盒 北京中杉金橋公司顯色試劑盒 北京中杉金橋公司抗體美國公司因子抗體美國公司抗體美國公司試劑美國公司逆轉(zhuǎn)錄酶 大連寶生物公司大連寶生物公司酶抑制劑 大連寶生物公司大連寶生物公司北京普利萊生物公司核蛋白提取試劑盒 美國公司蛋白定量試劑盒 美國公司膜 美國.公司/抗體 美國公司.抗體美國公司偶聯(lián)的二抗 美國公司蛋白分子量 美國公司

29、二抗美國公司化學發(fā)光劑 美國公司國產(chǎn)其他常規(guī)試劑試劑配制.細胞培養(yǎng)主要試劑配制干粉型培養(yǎng)基,水洗培養(yǎng)基培養(yǎng)基:超純水溶解.包裝袋內(nèi)面兩次并倒入培養(yǎng)液中,磁力攪拌使干粉完全溶解,加水至,加.,加雙抗,調(diào)整值至.,加水定容至,.濾膜過濾除菌后分裝,保存.雙抗溶液:使用濃度青霉素為/,鏈霉素/,配成貯存液,.貯存。緩沖液將一包粉,溶解于超純水中,調(diào)節(jié)值至.。.濾膜過濾除菌后分裝,。保存。.%胰酶稱取胰蛋白酶.,加入中,磁力攪拌使其完全溶解,.濾膜過濾除菌,分裝,.保存。溶液: 粉,加入超純水中,磁力攪拌使其稱取完全溶解,不調(diào)值,備用。液中,磁力攪拌使其.%膠原酶:稱取膠原酶,加入完全溶解,調(diào)節(jié)值至.

30、,.濾膜過濾除菌,分裝,貯存。.主要試劑配制溶液:碭乙酸 .吣以. 拉些奎蘭豎主堂垡堡壅壘曼堡塑堡翌盔墾:魚盟盛塹笙塑墮壁墮耋壟塑塑墮堂墮塑塹墮加雙蒸水至,混勻,分裝,室溫保存。溶液: 雙蒸水混勻后,室溫保存,備用。上樣緩沖液:.%溴酚藍,.%甲苯青,%甘油。%瓊脂糖膠:瓊脂糖.,加入溶液,加熱溶解,待溫度降至時,加入.,混勻。. 主要試劑配制/單體貯液%:.先用雙蒸水溶解,攪拌直到溶液變成透明,再用雙蒸水稀釋至,濾紙過濾,棕色瓶保存在。. ?:.蒸餾水溶解后,用濃鹽酸調(diào)至.,最后用蒸餾水定容至,保存。. ?:蒸餾水溶解后,用濃鹽酸調(diào)至.,最后用雙蒸水定容至,保存。%蒸餾水 輕柔攪拌,待溶解后

31、,用雙蒸水定容到。中山大學博士學位論文/激活對大鼠心肌成纖維細胞膠原表達和細胞增殖的影響%過硫酸胺過硫酸胺.雙蒸水 .溶解后即可使用,最好現(xiàn)用現(xiàn)配。%分離膠和%濃縮膠%分離膠兩塊膠, %濃縮膠兩塊膠,超純水. .%/ . . .%加后,立即混勻即可灌膠。蛋白電泳上樣緩沖液:. . .溴酚蘭.甘油混勻后,分裝于.離心管中,室溫保存。電泳液:.先用雙蒸水溶解,攪拌直到溶液變成透明,加雙蒸水稀釋至。電轉(zhuǎn)液:.先用雙蒸水溶解,攪拌直到溶液變成透明,在用雙蒸水稀釋至.用前加甲醇。緩沖液:.加雙蒸水至,用鹽酸調(diào)至.。緩沖液:混勻后即可使用,最好現(xiàn)用現(xiàn)配。%封閉液:脫脂奶粉溶解在 .緩沖液?？贵w洗脫液.一巰

32、基乙醇加雙蒸水至,混勻,最好現(xiàn)用現(xiàn)配。主要儀器雙人單面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司培養(yǎng)箱 美國公司倒置顯微鏡 德國公司加熱磁力攪拌器 德國公司培養(yǎng)板/瓶/皿美國公司電子分析天平瑞士公司計瑞士公司冷凍高速離心機酶標儀美國.公司超低溫冰箱日本公司紫外可見光光度計美國公司型電泳儀 北京六一儀器廠系列儀 美國公司 美國.公司電泳系統(tǒng) 美國.公司?電轉(zhuǎn)系統(tǒng)美國.公司一成像系統(tǒng)美國公司分析軟件 美國公司二方法成年大鼠培養(yǎng)利用本室建立并已發(fā)表的方法分離及培養(yǎng)成年大鼠取?雄性大鼠,頸椎脫臼法處死,用%的酒精消毒后,無菌條件下開胸取出心臟,放入溶液中。心臟經(jīng)沖洗后,分離去除心房和大血管,把心臟剪成約的碎塊。

33、沖洗心臟碎塊,瞬時離心,棄上清。將心肌組織移至含有小磁珠的錐形瓶中,加入 .%的膠原酶,置于加熱磁力攪拌器上,水浴消化。離心,去上清,生奎蘭堡三堂垡堡塞墜墾鰱亟適墅盔墼:壘巫壁塹絲塑墮壁墮耋壟塑塑墮堂墮墮塹墮洗滌沉淀,離心,收集沉淀。沉淀轉(zhuǎn)移至含有小磁珠的錐形瓶中,加入 .%的胰酶,將錐形瓶囂于加熱磁力攪拌器上水浴消化。收集細胞上清至含等量%小牛血清的培養(yǎng)液中。離心,棄上清液,沉淀中加入含%小牛血清的培養(yǎng)液.毫升重懸細胞。剩余未消化的組織塊繼續(xù)加入胰酶消化。如此重復.次。收集各次消化所得的細胞懸液至一離心管中,離心,收集沉淀,加入 %的膠原酶,吹打,消化。離心,去上清,用含%小牛血清培養(yǎng)液重懸

34、細胞,接種細胞于培養(yǎng)瓶中,、%孵育。輕柔沖洗細胞.次,更換新的培養(yǎng)基。細胞每.天換液次,常規(guī)培養(yǎng),一股天傳代次。乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)利用本室建立并已發(fā)表的乳鼠心肌細胞改良法分離及培養(yǎng)心肌細胞【徹。取.天乳鼠,用%的酒精擦洗胸部及腹部皮膚后,開胸,取出心臟,放入預冷的溶液中。繼續(xù)處理余下的乳鼠。將所有心臟全部移至另一個盛有冷的平皿中,用鑷子剔除心臟上的結(jié)締組織后把心臟剪成的碎塊。將心臟碎塊連同吸至一離心管中,瞬時離心后將上清棄去,再在組織沉淀中加冷的,離心棄上清。.%的胰蛋將剪碎的心肌組織移至含有磁珠的錐形瓶中,加入白酶。于冰上靜置.每隔三分鐘搖一次錐形瓶。后錐形瓶置加熱磁力攪拌器上水浴消化。后

35、收集上清至含等量%小牛血清的冷培養(yǎng)液中。離心,棄上清液,沉淀中加入含%牛血清的培養(yǎng)液.毫升重懸細胞。剩余未消化的組織塊繼。如此重復?次。續(xù)加入胰酶消化,并在消化液加入./收集各次消化所得的細胞懸液至一離心管中,靜置,自然沉降混入的未消化的組織塊,然后輕輕吸取細胞懸液至另一離心管中,離心后用%牛血清重懸細胞,接種細胞于培養(yǎng)瓶中,%孵育.孵育.后,小心收集培養(yǎng)瓶中富集心臟細胞的上層細胞懸液,根據(jù)實驗需要計數(shù)種板,在培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入. 以抑制生長。鑒定目前的鑒定多采用三因子法,即抗、因子和抗體鑒定法。本實驗中,乳鼠心肌細胞作為小的陽性對照。操作步驟按照中杉金橋公司免疫組化染色試劑盒說明書進行,具體

36、如下:取出培養(yǎng)天的成纖維細胞爬片,使其浸泡于溶液中次,每次。用%多聚甲醛溶液固定,室溫風干后蒸餾水洗次。將%過氧化氫去離子水孵育以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,雙蒸水洗次,每次。溶液。室溫孵育。在玻片上滴加用稀釋的%洗次,每次。滴加試劑封閉液,室溫放置,甩去多余液體,不洗。滴加適當稀釋度的一抗,:、因子:、:,室溫.或過夜.洗次,每次。滴加試劑,室溫放置,洗次,每次.滴加試劑,室溫放置.,洗次,每次。顯色:取蒸餾水,加入試劑盒中、試劑各滴,混勻后加至標本,室溫顯色,鏡下控制顯色時間。蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復染,再用%、%、%、%的酒精溶液系列洗脫,二甲苯透明,封片。顯微鏡下觀察,計數(shù)陽性細胞。生長曲線

37、繪制第、代細胞生長曲線。生長良好的第、代細胞經(jīng)胰酶消化成細胞懸液,按./密度接種于孔板,每消化三孔細胞,計數(shù)取平均值。以培養(yǎng)時間鬟橫坐標,細胞數(shù)為縱坐標,繪制生長曲線。測定表達情況.總提取按說明書步驟提取總:孔板內(nèi)細胞棄去培養(yǎng)基,洗滌一遍。每孔加入 ,吹打細胞,轉(zhuǎn)入.管,室溫靜置。加入氯仿,劇烈振蕩,室溫靜置。,離心,將上層水相轉(zhuǎn)入另一管。加入異丙醇,混勻,室溫靜置。離心,棄上清,留沉淀。%乙醇洗滌沉淀遍。離心,室溫干燥。水, 水浴溶解。加入.總的鑒定. 濃度和純度.%水稀釋倍后,分別測樣品取 樣品,用的、波長下的值,按以下公式計算濃度和純度:濃度蚓“純度/比值為.,說明純度較高,沒有蛋白質(zhì)的

38、殘余比值小于.,說明樣品中有蛋白質(zhì)、酚等污染.鑒定質(zhì)量配制%膠,取樣品.與上樣緩沖液:混勻,上樣,以為緩沖液電泳,電泳。紫外燈下觀察,可見、三條帶。.逆轉(zhuǎn)錄合成參照公司試劑盒說明書,反應體系如下:成分 用量嗵盯甲 “.代.樣品咖水將反應管置入儀中,按以下設置參數(shù)進行逆轉(zhuǎn)錄反應:,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.保存或直接用于。.擴增和引物信息坐盔堂堡主堂垡鯊奎 墜墾墮塑適墮盔墾:堂盟盛塹絲塑墮墮墮耋壟塑塑墼塑墮墮墅墮參照公司試劑盒說明書,反應體系如成分 用量. 酶/ 上游引物.下游引物水“反應條件,。產(chǎn)物電泳分析取 產(chǎn)物與 上樣緩沖液混合后上樣于%瓊脂糖凝膠,同時以 點樣,以為緩沖液電泳。電泳至溴酚藍位于瓊脂糖凝

39、膠的/后,紫外燈下觀察,拍照并進行圖像分析。檢測/表達.核蛋白的提取按公司核蛋白抽提試劑盒的說明書進行,所有步驟均在冰上操作,主要步驟如下:以%接種于培養(yǎng)皿中,細胞生長至%融合狀態(tài)時,培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液,用冷洗次細胞,用少量刮下細胞,離心。估計沉淀細胞的體積,加入含.的 “和,輕輕重懸沉淀,避免泡沫形成。.,.,渦旋。冰上孵育,加入 / 墜曼墮塑量墅盔基:壘墼鏖塹絲塑墮墮墮耋壟塑塑墮壟墮盟絲墮些盔堂堡主蘭垡迨奎.離心,取上清得胞漿蛋白,沉淀為細胞核。. 重懸加入 和肛每含胞核,裂解.,在裂解的過程中要不斷渦漩。.,. . %/ 甘油離心,取上清即為核蛋白。核蛋白.凍存,備用.蛋白含量的測定.制作蛋白標準曲線,室溫融化后,備用?；旌匣旌弦?份溶液取出/與份溶液混合。取孔板,按下表在各孔中依次加入各種試劑?；靹蚝?保溫,酶標儀測定吸光度,繪制蛋白標準曲線。.檢測樣品蛋白含量取分裝后的蛋白,室溫溶解,分別稀釋倍,每孔加稀釋后的樣本,加混合液,每個稀釋樣本加兩個孔?；靹蚝?保溫,酶標儀上進行測定,利用蛋白標準曲線計算樣