序列分析軟件DNAMAN_的使用方法中文

1、序列分析軟件序列分析軟件DNAMAN 的的 使用方法簡介使用方法簡介 饒志明饒志明 博士/教授 博士生導(dǎo)師 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室 E-mail: nDNAMAN 是一種常用的核酸序列分析是一種常用的核酸序列分析 軟件。由于它功能強大，使用方便，已軟件。由于它功能強大，使用方便，已 成為一種普遍使用的成為一種普遍使用的DNA 序列分析工具。序列分析工具。 打開打開DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面： n 第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十第一欄為主菜單欄。

2、除了幫助菜單外，有十 個常用主菜單，個常用主菜單， n第二欄為工具欄：第二欄為工具欄： n第三欄為瀏覽器欄：第三欄為瀏覽器欄： 在瀏覽器欄下方的工作在瀏覽器欄下方的工作 區(qū)左側(cè)，可見區(qū)左側(cè)，可見Channel 工具條，工具條，DNAMAN 提提 供供20 個個Channel，點擊，點擊Channel 工具條上相工具條上相 應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的Channel。 n每個每個Channel 可以裝入一個序列。將要分析可以裝入一個序列。將要分析 的序列（的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入 Channel 中可以節(jié)約存取序列時間，加快分中可以節(jié)約存取

3、序列時間，加快分 析速度。析速度。 如何使用如何使用DNAMAN 分析序列分析序列 n1將待分析序列裝入將待分析序列裝入Channel n通過通過File Open 命令打開待分析序列文件，則命令打開待分析序列文件，則 打開的序列自動裝入默認(rèn)打開的序列自動裝入默認(rèn)Channel。 n通過通過Sequence/Load Sequence 菜單的子菜菜單的子菜 單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入 Channel 。 n通過通過Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打開命令打開 一個對話框，通過此對話框可以設(shè)定序

4、列的性一個對話框，通過此對話框可以設(shè)定序列的性 質(zhì)（質(zhì)（DNA 或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段 等參數(shù)。等參數(shù)。 2 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列 n通過通過Sequence/Display Sequence 命令打開對話框，命令打開對話框， n根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的 序列轉(zhuǎn)換形式。序列轉(zhuǎn)換形式。 n對話框選項說明如下：對話框選項說明如下： nSequence &Composition 顯示序列和顯示序列和 成分成分 2 以不同形式顯示序列以不同形式顯示序列 nReverse Complement Sequen

5、ce 顯示待分顯示待分 析序列的反向互補序列析序列的反向互補序列 nReverse Sequence 顯示待分析序列的反向顯示待分析序列的反向 序列序列 nComplement Sequence 顯示待分析序列的顯示待分析序列的 互補序列互補序列 nDouble Stranded Sequence 顯示待分析序顯示待分析序 列的雙鏈序列列的雙鏈序列 nRNA Sequence 顯示待分析序列的對應(yīng)顯示待分析序列的對應(yīng)RNA 序列序列 3DNA 序列的限制性酶切位點分析序列的限制性酶切位點分析 n將待分析的序列裝入將待分析的序列裝入Channel，點擊要分析的，點擊要分析的 Channel，然后

6、通過，然后通過Restriction/Analysis 命令打開命令打開 對話框，對話框， n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nResults 分析結(jié)果顯示分析結(jié)果顯示 n其中包括：其中包括： nShow summary（顯示概要）（顯示概要） nShow sites on sequence（在結(jié)果中顯示酶切位點）（在結(jié)果中顯示酶切位點） nDraw restriction map（顯示限制性酶切圖）（顯示限制性酶切圖） nDraw restriction pattern（顯示限制性酶切模式圖）（顯示限制性酶切模式圖） 3DNA 序列的限制性酶切位點分析序列的限制性酶切位點分析 nIgnore

7、enzymes with more than（忽略大于某設(shè)（忽略大于某設(shè) 定值的酶切位點）定值的酶切位點） nIgnore enzymes with less than（忽略小于某設(shè)定（忽略小于某設(shè)定 值的酶切位點）值的酶切位點） nTarget DNA （目標(biāo)（目標(biāo)DNA 特性）特性） nCircular（環(huán)型（環(huán)型DNA），）， ndam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）甲基化） nall DNA in Sequence Channel（選擇此項，在（選擇此項，在 Sequence Channel 中的所有序列將被分析，如果選中的所有序列將被分析，如果選 擇了擇了D

8、raw restriction pattern，那么當(dāng)所有的，那么當(dāng)所有的 channel 中共有兩條中共有兩條DNA 時，則只能選擇兩個酶分時，則只能選擇兩個酶分 析，如果共有三個以上析，如果共有三個以上DNA 時，則只能用一個酶分時，則只能用一個酶分 析。）析。） n選擇所需的項目，然后按提示操作點擊按扭，出現(xiàn)下選擇所需的項目，然后按提示操作點擊按扭，出現(xiàn)下 列對話框：列對話框： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nEnzyme n代表（代表（enzyme data file），點擊旁邊的下拉按鈕，），點擊旁邊的下拉按鈕， 出現(xiàn)兩個默認(rèn)選項，出現(xiàn)兩個默認(rèn)選項，restrict.enz 和和d

9、namane.enz， n如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文 件名。件名。 n其中其中restrict.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含180 種限制酶，種限制酶， dnamane.enz 數(shù)據(jù)文件包含數(shù)據(jù)文件包含2524 種限制酶。種限制酶。 n選擇其中一個數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中選擇其中一個數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中 列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則 對應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。對應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。 n要自制酶切列表，可以從左邊酶列

10、表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例 如如puc18 multiple cloning sites），）， n然后點擊按鈕出現(xiàn)下列對話框：然后點擊按鈕出現(xiàn)下列對話框： n輸入要保存酶列表的文件名，點擊按鈕即可保存。自制酶列表可輸入要保存酶列表的文件名，點擊按鈕即可保存。自制酶列表可 以方便分析特定的酶切位點。以方便分析特定的酶切位點。 nCutter 酶切識別序列長度；酶切識別序列長度； nEnd 酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，酶切產(chǎn)生的末端，其中包括， nBlunt（平頭末端），（平頭末端）， n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,

11、n3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)， n系統(tǒng)根據(jù)系統(tǒng)根據(jù)cutter 和和end 的設(shè)定情況的設(shè)定情況,在左邊酶列表中顯示符合條在左邊酶列表中顯示符合條 件的酶。最后，點擊按鈕執(zhí)行操作。件的酶。最后，點擊按鈕執(zhí)行操作。 4DNA 序列比對分析序列比對分析 （Dot Matrix Comparision） n要比較兩個序列，可以使用要比較兩個序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比對工具提供的序列比對工具Dot Matrix Comparision （點矩陣比較）通過（點矩陣比較）通過 Sequense/Dot matrix comparision 命令打開比對界面，命令打開比對

12、界面， n點擊對比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列點擊對比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列 對話框：對話框： 參數(shù)說明如下： nSequence type 序列類型序列類型 nSequence 1 參加比對的第一序列選擇框，框內(nèi)選項參加比對的第一序列選擇框，框內(nèi)選項 說明如下：說明如下： n如果要比對的序列在如果要比對的序列在Channel 中，點擊下拉箭頭，選中，點擊下拉箭頭，選 擇相應(yīng)的擇相應(yīng)的Channel，則被選中的，則被選中的Channel 中的序列作中的序列作 為參加比對的第一序列；為參加比對的第一序列； n也可以從文件夾中選擇參加比對的序列，在也可以從文件夾中選擇參加比對的序列，在File

13、選擇選擇 框上點擊即可。通過框上點擊即可。通過Length 選擇參加比對的序列片選擇參加比對的序列片 段。段。 nSequence 2 參加比對的第二序列選擇框；選項說明參加比對的第二序列選擇框；選項說明 同上同上 nShow Sequence 選擇此項，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時，選擇此項，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時， 將顯示同源性；將顯示同源性； nAnnotations 是否顯示注釋是否顯示注釋 nComparision 比對參數(shù)，比對參數(shù)， n其中其中Window 代表代表Window size（單位比對長度），（單位比對長度）， nMismatch 代表代表Mismatch size（單位比對長

14、度中許（單位比對長度中許 可的錯配值）要快速比對，需將此項設(shè)為可的錯配值）要快速比對，需將此項設(shè)為0。 nBoth stran 代表代表Both strand（雙鏈比對）選擇此項，（雙鏈比對）選擇此項， 是指用是指用Sequence 2 中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和 Sequence 1 比較。比較。 nSequence 2 正鏈與正鏈與Sequence 1 比較結(jié)果用黑色點比較結(jié)果用黑色點 表示，表示，Sequence 2 負(fù)鏈比對結(jié)果用紅色點表示。負(fù)鏈比對結(jié)果用紅色點表示。 nPlot box 點陣圖表顯示參數(shù)，點陣圖表顯示參數(shù)， nPosition（起點坐標(biāo)）（起

15、點坐標(biāo)） nWidth（寬度值）（寬度值） nHeight（高度值）（高度值） nFrame size（邊框線粗度值）（邊框線粗度值） nDot size（點粗度值）（點粗度值） nGridline（虛線框數(shù)）。（虛線框數(shù)）。 n參數(shù)設(shè)定好后，點擊按鈕執(zhí)行操作。參數(shù)設(shè)定好后，點擊按鈕執(zhí)行操作。 5序列同源性分析序列同源性分析 n（1）兩序列同源性分析）兩序列同源性分析 n通過通過Sequence/Two Sequence Alignment 命令打命令打 開對話框，如下所示：開對話框，如下所示： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nAlignment method 比對方法，比對方法， n通?？?/p>

16、選通?？蛇xQuick(快速比對快速比對)或或Smith&Waterman(最最 佳比對佳比對)， n當(dāng)選擇快速比對時，設(shè)置較小的當(dāng)選擇快速比對時，設(shè)置較小的k-tuple 值，可以提值，可以提 高精確度，高精確度， n當(dāng)序列較長時，一般要設(shè)置較大的當(dāng)序列較長時，一般要設(shè)置較大的k-tuple 值。值。k- tuple 值可選范圍值可選范圍26； n蛋白質(zhì)序列：蛋白質(zhì)序列：k-tuple 值可選范圍值可選范圍13。 （2）多序列同源性分析）多序列同源性分析 n通過打開通過打開Sequence/Multiple Sequence Alignment 命令打開對話框，命令打開對話框， n參數(shù)說明如下

17、：參數(shù)說明如下： nFile 從文件中選擇參加比對的序列從文件中選擇參加比對的序列 nFolder 從文件夾中選擇參加比對的序列從文件夾中選擇參加比對的序列 nChannel 從從channel 中選擇參加比對的序列中選擇參加比對的序列 nDbase 從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對的序列從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對的序列 nRemove 清除選擇的序列（鼠標(biāo)點擊左邊顯示框中的清除選擇的序列（鼠標(biāo)點擊左邊顯示框中的 序列名選擇）序列名選擇） nClear 清除全部序列清除全部序列 n點擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對話框：點擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對話框： n選擇其中一種方法，點擊按鈕，出現(xiàn)下列對話框：選擇其中一種方法，點

18、擊按鈕，出現(xiàn)下列對話框： n如果在前一對話框選擇的是如果在前一對話框選擇的是Fast alignment,則在此對話框中選則在此對話框中選 擇擇Quick alignment,否則選擇否則選擇 Dynamic alignment 即可。其即可。其 它參數(shù)不必改變，點擊對話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。它參數(shù)不必改變，點擊對話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。 n點擊左上角按鈕，可以從彈出的對話框中選擇不同的結(jié)果顯示特點擊左上角按鈕，可以從彈出的對話框中選擇不同的結(jié)果顯示特 性選項。點擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項：性選項。點擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項： 可以通過這些選項，繪制同源關(guān)系圖（例

19、如可以通過這些選項，繪制同源關(guān)系圖（例如Tree/homology tree 命令）。命令）。 n顯示蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（顯示蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（Protein Secondary Structure 命令），命令）， n繪制限制性酶切圖（繪制限制性酶切圖（Restriction Analysis 命令）等。命令）等。 6.PCR 引物設(shè)計引物設(shè)計 n首先，將目標(biāo)首先，將目標(biāo)DNA 片段裝入片段裝入Channel,并激活并激活Channel。 n點擊主菜單欄中的點擊主菜單欄中的Primer 主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，主菜單，出現(xiàn)下拉菜單， n點擊點擊Design PCR Primers for DNA 命

20、令，出現(xiàn)下列對話框：命令，出現(xiàn)下列對話框： 參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nPrimer locations on target 引物定位引物定位 n其中包括下列選項：其中包括下列選項： nProduct size（擴增目的片段大?。〝U增目的片段大小） nSense primer (正向引物選擇區(qū)正向引物選擇區(qū)) nAntisense primer(反向引物選擇區(qū)反向引物選擇區(qū)) nPrimer 引物特性包括引物特性包括Length(引物長度引物長度)，Tm 值值, GC 含量等參含量等參 數(shù)；數(shù)； nReject primer 引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）引物過濾（將符合引物

21、過濾條件的引物過濾掉） n包括下列選項：包括下列選項： n3dimer(可形成可形成3端自我互補的堿基數(shù)端自我互補的堿基數(shù)) nHairpin stem(可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)) nPolyN(多聚堿基多聚堿基) n3Uique(3端嚴(yán)格配對堿基數(shù)端嚴(yán)格配對堿基數(shù)) nAll matches(引物互補配對百分?jǐn)?shù)引物互補配對百分?jǐn)?shù)) nConsentrations 濃度設(shè)定濃度設(shè)定 nProduct for hybridyzat nPCR 產(chǎn)物用于產(chǎn)物用于Southern Blot 探針雜交探針雜交 7畫質(zhì)粒模式圖畫質(zhì)粒模式圖 n我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作

22、幻燈片，還是發(fā)表文章，我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章， 常常需要質(zhì)粒圖。常常需要質(zhì)粒圖。DNAMAN 提供強大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足提供強大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足 我們的需要。我們的需要。 n通過通過Restriction/Draw map 命令打開質(zhì)粒繪圖界面：命令打開質(zhì)粒繪圖界面： 將鼠標(biāo)移動到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成將鼠標(biāo)移動到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成“I”時，單擊鼠標(biāo)左鍵，出時，單擊鼠標(biāo)左鍵，出 現(xiàn)如下菜單：現(xiàn)如下菜單： n菜單說明如下：菜單說明如下： nPosition 當(dāng)前位置當(dāng)前位置 nAdd Site 添加酶切位點添加酶切位點 nAdd Element 添加要

23、素添加要素 nAdd Text 添加文字添加文字 nInsert Fragment 插入片斷插入片斷 nCopy Fragment 復(fù)制片斷復(fù)制片斷 nCut Fragment 剪切片斷剪切片斷 nRemove Fragment 清除片斷清除片斷 nFrame Thickness 邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié)邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié) n點擊點擊Add Site 選項，出現(xiàn)對話框：選項，出現(xiàn)對話框： n參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nName 要添加的酶切位點的名稱要添加的酶切位點的名稱(例如例如HindIII) nPosition 位置（以堿基數(shù)表示）位置（以堿基數(shù)表示） n點擊點擊Add Element 選項，出現(xiàn)

24、如下對話框：選項，出現(xiàn)如下對話框： 參數(shù)說明如下：參數(shù)說明如下： nType 要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點擊即可切換）要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點擊即可切換） nColor/Pattern 填充色（共有填充色（共有16 種顏色供選擇）種顏色供選擇） nName 要素名稱要素名稱 nStart /End/Size 要素起點要素起點/終點終點/粗細(xì)度粗細(xì)度 核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程 n1.1 核酸序列的檢索核酸序列的檢索 :80/entrez/quer y.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析

25、核酸序列的同源性分析 n1.2.1 基于基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析軟件的核酸序列同源性分析 /blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的兩兩比較核酸序列的兩兩比較 /gorf/bl2.html n1.2.3 核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案方案) n1.3 核酸序列的電子延伸核酸序列的電子延伸 1.3.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸(方案方案) n1.3.2 利用利用Tigem的的EST Mach

26、ine進(jìn)行電子延伸進(jìn)行電子延伸 EST Extractor: http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.ht ml | EST Assembly: http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用利用THC數(shù)據(jù)庫對核酸序列進(jìn)行電子延伸數(shù)據(jù)庫對核酸序列進(jìn)行電子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html n1.4 核酸序列的開放閱讀框架分析核酸序列的開放閱讀框架分析 1.4.1基于基于NCBI/ORF finder的的ORF分析分析 http:/www.ncbi.nlm.nih

27、.gov/gorf/gorf.html n1.5 基因的電子表達(dá)譜分析基因的電子表達(dá)譜分析 n1.5.1 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方 案）案） n1.5.2利用利用Tigem的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá) 譜分析譜分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html n1.6 核酸序列的電子基因定位分析核酸序列的電子基因定位分析 1.6.1 利用利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位 /geno me/s

28、ts/epcr.cgi 1.6.2 利用利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因 定位（方案）定位（方案） n1.7 cDNA的基因組序列分析的基因組序列分析 1.7.1 通過從通過從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組 序列的分析序列的分析(方案方案) 1.7.2 通過從通過從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組 序列的分析序列的分析 /genome/seq/pa ge.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通過從通過從Sanger Ce

29、ntre查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 基因組序列的分析基因組序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.s html n1.8 基因組序列的初步分析基因組序列的初步分析 1.8.1 基因組序列的內(nèi)含子基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析外顯子分析 /urllists/ genefind.htm 1.8.2 基因組序列的啟動子分析基因組序列的啟動子分析 http:/www- /projects/promoter.html n1.9核酸序列的注冊 1.9.1 EST序列的注冊

30、(方案) 1.9.2 較長或全長cDNA序列的注冊(方案) n1.10待分析序列所對應(yīng)的已知克隆的獲取 引 物 設(shè) 計 n引物 n引物的重要性 n引物設(shè)計的原則 n引物與PCR n引物設(shè)計軟件 n如何使用Primer Premier 5.0 n引物同源性分析 引物（primers) n引物是人工合成的兩段 寡核苷酸序列，一個引 物與感興趣區(qū)域一端的 一條DNA模板鏈互補， 另一個引物與感興趣區(qū) 域另一端的另一條DNA 模板鏈互補。 3 3 5 5 Sense primer Antisense primer 引物的重要性 n在整個PCR體系中, 引物占有

31、十分重要的 地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特 異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR 的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進(jìn)行 有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié) 果密切相關(guān)。 引物設(shè)計原則 n引物長度 n堿基分布的均衡性 nTm值 n引物二級結(jié)構(gòu) n引物3端 n引物5端 n引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 n引物的保守性與特異性 n擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu) 引物長度 n一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR 或做某些特殊的PCR時應(yīng)使用較長的引物， 但最多不超過50個核苷酸。 堿基分布的均衡性 n同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個 nGC含量一般40-60% nGC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低 的

32、退火溫度不利于提高PCR的特異性 nGC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。 引物Tm值 n一般要求：55-65。 n計算： n對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù) Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 n對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué) 參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這 也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。 nTm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15 引物二級結(jié)構(gòu) n引物二聚體 n盡可能避免兩個引物分子之間3端有有較多 堿基互補 n發(fā)夾結(jié)構(gòu) n尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則 將嚴(yán)重影

33、響DNA聚合酶的延伸。 引物3端 n引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個 堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn) 行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸， 甚至導(dǎo)致PCR擴增完全失敗?？紤]到密碼 子的簡并性，引物3端最后一個堿基最好 不與密碼子第三個堿基配對。 引物5端 n引物5端可以有與模板DNA不配對堿基， 在5端引入一段非模板依賴性序列。 n5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切 位點5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。 n5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn) 物中引入該位點的點突變以作研究。 n5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生 物素、地高辛等）。 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 n過去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢

34、牢結(jié)合在模板上才能 有效地進(jìn)行延伸，故3端最好為G或C。 n現(xiàn)在的觀點認(rèn)為，引物的5端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié) 構(gòu)，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定 性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T，少用G或C。 n僅僅3端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低 穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。 n如果3端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3端幾個堿基與 模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。 引物的保守性與特異性 n保守性：通用引物檢測同一類病原 微生物盡可能多的型別 n特異性：避免非特異性擴增 擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu) n模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)， 在選擇引物時，應(yīng)使擴增區(qū)域盡可能避開這些 區(qū)域。 n擴增區(qū)域的自由能（G。）小于 58.61kJ/mol n引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 nTm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length 引物與PCR n引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L n引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288 G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L) n退火溫度 n最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of produ