核酸的分離提取及定量講解

1、動(dòng)物組織中核酸的提取 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x v能夠說(shuō)出組織能夠說(shuō)出組織DNA分離提純的原理及方分離提純的原理及方 法并能夠抽提制備法并能夠抽提制備DNA v能夠說(shuō)出組織能夠說(shuō)出組織RNA分離提純的原理及方分離提純的原理及方 法并能夠抽提制備法并能夠抽提制備RNA。 核酸（核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是遺傳信息的攜帶者， 是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需 要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。要對(duì)核酸進(jìn)行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。

2、 分離純化核酸的原則分離純化核酸的原則 v 應(yīng)保證核酸應(yīng)保證核酸 完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的最基本要求 減少減少對(duì)核酸的降解：對(duì)核酸的降解： 不要過(guò)高；不要過(guò)高； b.b. 控制控制范圍范圍( (pH值值5-9); ); c.c. 保持一定保持一定 減少減少對(duì)核酸的降解：對(duì)核酸的降解： 避免避免破壞核酸結(jié)構(gòu)破壞核酸結(jié)構(gòu) 分離純化核酸的原則分離純化核酸的原則 防止核酸的防止核酸的： a.a.細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。 b.b.進(jìn)行

3、核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬進(jìn)行核酸分離時(shí)最好新鮮生物組織或細(xì)胞樣品，若不能馬 上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或上進(jìn)行提取，應(yīng)將材料貯存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。 c.c.所用器械和一些試劑需所用器械和一些試劑需，提取緩沖液中需加，提取緩沖液中需加 分離純化核酸的原則分離純化核酸的原則 v 排除排除等其他分子的污染等其他分子的污染 2. 無(wú)無(wú)的污染（如抽提的污染（如抽提DNA分子時(shí)應(yīng)分子時(shí)應(yīng) 去除去除RNA分子）。分子）。 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì) v DNA、RNA的理化性質(zhì)特點(diǎn)：的理化性質(zhì)特點(diǎn)： 核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)核酸分子中既含有酸

4、性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán) （氨基），因而核酸具有兩性性質(zhì)，是（氨基），因而核酸具有兩性性質(zhì)，是。 由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性 （氨基）是一個(gè)弱堿，所以（氨基）是一個(gè)弱堿，所以，等電，等電 點(diǎn)比較低。如點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為的等電點(diǎn)為pI 4-4.5，RNA的等電點(diǎn)的等電點(diǎn) 為為pI 2-2.5。 DNA為白色纖維狀固體，為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末狀固體。為白色粉末狀固體。 DNA和和RNA都是極性化合物，因此他們都是極性化合物，因此他們 。 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì) v 核酸的存在方式：核酸的存在方式： DNA和

5、和RNA在細(xì)胞中通常以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。他在細(xì)胞中通常以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。他 們與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物分別稱為們與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物分別稱為DNP（脫氧核糖核蛋白）（脫氧核糖核蛋白） 和和RNP（核糖核蛋白）。（核糖核蛋白）。 核酸純化原理核酸純化原理 DNA分離純化原理分離純化原理： RNA分離純化原理：分離純化原理： DNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟分離純化實(shí)驗(yàn)步驟 剪碎組織剪碎組織 放入勻漿器加入放入勻漿器加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液液7 mL 棄上清。沉淀中加入棄上清。沉淀中加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDT

6、A液液6 mL混勻?；靹颉?勻漿，離心勻漿，離心 5000 r/min ，5 min 沉淀中加入沉淀中加入3 mL 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA, 轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿，轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿， 在攪拌下緩緩滴入在攪拌下緩緩滴入250 g/L SDS 0.4 mL 勻漿，使沉淀懸浮均勻勻漿，使沉淀懸浮均勻 再加入再加入2 mol/L NaCl 4 mL（此時(shí)由于大分子脫氧核糖核蛋白的溶（此時(shí)由于大分子脫氧核糖核蛋白的溶 出，溶液粘度驟然升高，再勻漿，使之均勻）出，溶液粘度驟然升高，再勻漿，使之均勻） 加加氯仿氯仿-異丙醇異丙醇 5 mL，劇烈振搖，劇烈振搖10min。混合物

7、離心。混合物離心 上層水液，下層氯仿，交界面為變性蛋白。上層水液，下層氯仿，交界面為變性蛋白。 收集上層水液邊搖變加入收集上層水液邊搖變加入等體積等體積95% 乙醇乙醇，即可見有長(zhǎng)纖維狀，即可見有長(zhǎng)纖維狀DNA析出析出 5000 r/min 離心離心5 min 3000 r/min離心離心10 min RNA分離純化實(shí)驗(yàn)步驟分離純化實(shí)驗(yàn)步驟 加入加入3 mL 0.05 mol/L 醋酸醋酸-醋酸鈉緩沖液醋酸鈉緩沖液, 250 g/L SDS 0.5 mL，勻漿，勻漿 移入三角燒瓶中，移入三角燒瓶中，65水浴水浴中繼續(xù)中繼續(xù)振搖振搖5-8min， 取出取出流水冷卻流水冷卻 5000 r/min

8、離心離心10 -15min 上層為稍渾濁含有上層為稍渾濁含有RNA的水相，的水相， 中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚中層為變性蛋白質(zhì)，下層為酚 液，管底殘?jiān)幸海艿讱堅(jiān)蠨NA。 收集上層水液于量筒中，測(cè)水液的體積，加入收集上層水液于量筒中，測(cè)水液的體積，加入1/10 體積的體積的2 mol/L 醋醋 酸鈉溶液酸鈉溶液，混勻。再加，混勻。再加2.倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，冷處放置至，混勻，冷處放置至 絮狀沉淀充分形成（絮狀沉淀即為絮狀沉淀充分形成（絮狀沉淀即為RNA） 再加入再加入等體積等體積 80% 酚酚（約（約4mL），勻漿），勻漿 核酸分離純化中各試劑的作用核酸分離

9、純化中各試劑的作用 v DNP在在2 mol/L NaCl中易溶解中易溶解 DNP在在0.14 mol/L NaCl中不溶中不溶 RNP在在0.14 mol/L NaCl中易溶解中易溶解 v DNA酶需要金屬二價(jià)離子酶需要金屬二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用的激活，因此使用 金屬二價(jià)離子螯合劑金屬二價(jià)離子螯合劑EDTA，可抑制，可抑制DNA酶活性。酶活性。 氯仿可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層；氯仿可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層； 異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇有助于消除抽提過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。 DNA溶液是溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，以水合狀

10、態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)， 乙醇會(huì)奪去乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，周圍的水分子，使使DNA失水而易于聚合失水而易于聚合。用。用 無(wú)水乙醇沉淀無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。的方法。 乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理很安全，因此是理 想的沉淀劑。想的沉淀劑。 可用可用95乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn) 遠(yuǎn)比遠(yuǎn)比95乙醇昂貴）但是加乙醇昂貴）但是加95的乙醇使總體積增大，而的乙醇使總體積增大，而 DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而在溶液中有一定

11、程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤損失也增大，尤 其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次 沉淀沉淀DNA時(shí)可用時(shí)可用95乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要 使用無(wú)水乙醇。使用無(wú)水乙醇。 核酸分離純化中各試劑的作用核酸分離純化中各試劑的作用 使混合物中使混合物中DNA沉淀沉淀 提供一定鹽離子促進(jìn)提供一定鹽離子促進(jìn)RNA沉淀沉淀 使蛋白質(zhì)變性，有破胞和抑制核酸酶的作用；使蛋白質(zhì)變性，有破胞和抑制核酸酶的作用； 苯苯是極強(qiáng)烈的是極強(qiáng)烈的，它幾乎使所有遇到的蛋，它幾乎使所有遇到的蛋 白質(zhì)都變性。能增加去除蛋白的效果，并白質(zhì)都變性。能增加去除蛋白的效果，并 。 核酸分離純化中各試劑的作用核酸分離純化中各試劑的作用 u 盡量保持低溫下操作，作時(shí)注意避免破壞核酸結(jié)構(gòu)盡量保持低溫下操作，作時(shí)注意避免破壞核酸結(jié)構(gòu) 一般來(lái)講，核酸沉淀應(yīng)在低溫下長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。但是低溫一般來(lái)講，核酸沉淀應(yīng)在低溫下長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。但是低溫 長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。 因此因此一般使用一般使用0