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文檔簡介
1、凝膠電泳及其應用凝膠電泳及其應用 主要內容主要內容 凝膠電泳相關概念凝膠電泳相關概念1 凝膠電泳的原理凝膠電泳的原理2 凝膠電泳的應用凝膠電泳的應用3 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳4 2 v 凝膠:凝膠是膠體體系的一種存在形式,它是由膠體體系中分散相顆 粒相互聯(lián)結,搭成具有三維結構的骨架后形成的,具有空間網狀結構 體系,膠體體系中原有的分散介質(液體)充填在網狀結構的空隙之 中。 v 電泳:帶電顆粒在電場作用下,向著與其電性相反的電極移動,稱為 電泳(electrophoresis, EP)。利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達 到分離的技術稱為電泳技術。 v 分類: 凝膠電泳相關概念
2、凝膠電泳相關概念 凝膠電泳原理凝膠電泳原理 v 當一種分子被放置在電場當中時 , 它們就會以一定的速度 移向適當的電極 , 這種電泳分子在電場作用下的遷移速度 , 叫做電泳的遷移率。 v 它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。 也就是說 ,電場強度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數量 越多 ,其遷移的速度也就越快 , 反之則較慢。由于在電泳 中使用了一種無反應活性的穩(wěn)定的支持介質 , 如瓊脂糖凝 膠和聚丙烯酰胺凝膠等 , 從而降低了對流運動 , 故電泳的 遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。已知摩擦系數是 分子的大小、極性及介質粘度的函數 , 因此根據分子大小 的不同、構成或形狀的差
3、異 , 以及所帶的凈電荷的多少 , 便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分 彼此分離開來。 凝膠電泳原理圖凝膠電泳原理圖 電泳過程中分子遷移的規(guī)律,小分子走在前頭,大分子滯后。電泳過程中分子遷移的規(guī)律,小分子走在前頭,大分子滯后。 凝膠電泳凝膠電泳裝置圖裝置圖 垂直式電泳裝置水平式電泳裝置 影響凝膠電泳的因素影響凝膠電泳的因素 v樣品本身:帶電量,分子大小,形狀樣品本身:帶電量,分子大小,形狀 v電場強度:電壓電場強度:電壓 v緩沖液:成分,緩沖液:成分, pH ,離子強度,離子強度 v支持介質:電滲作用,吸附作用支持介質:電滲作用,吸附作用 v溫度溫度 凝膠電泳應用凝膠電泳應用
4、v 凝膠電泳通常用于分析用途,但也可以作為制備技術,在 采用某些方法(如質譜(MS)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克 隆技術、DNA測序或者免疫印跡)檢測之前部分提純分子。 v 凝膠電泳被廣泛用于分子生物學、遺傳學和生物化學。 v 大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝 膠電泳(PAGE)。 v 蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰 胺凝膠中進行(SDS-PAGE),現以其為例進行實驗說明。 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 v 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide,簡
5、稱Acr) 和交聯(lián)劑N, N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene- bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑(四甲基乙二胺TEMED) 和催化劑(過硫酸胺或核黃素)的作用下聚合并聯(lián)成三維網 狀結構的凝膠,以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝 膠電泳。 (polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置圖聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置圖 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 1.1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準備準備2 2個干個干 凈的小燒杯凈的小燒杯 2.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃
6、板在灌膠支架上固定好 聚丙烯酰胺凝膠電泳確定蛋白質分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳確定蛋白質分子量 配配 膠膠 分離膠分離膠( (10% 10ml10% 10ml) )濃縮膠濃縮膠(5% 10ml)(5% 10ml) ddHddH2 2O O 4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml 30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7ml BufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml 0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-H
7、Cl 1.25ml 10%SDS10%SDS100l100l100l100l 10%Ap10%Ap50l50l100l100l TEMEDTEMED10l10l10l10l 7.電泳槽中加入緩沖液,接通電源,進行電泳。 8.凝膠板剝離與染色:電泳結束后,撬開玻璃板,將凝 膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內,加入考馬斯亮藍染色染 色液,染色1小時左右。 9.脫色:染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次,再用脫色 液脫色,直到蛋白質區(qū)帶清晰。 10.實驗結果分析 按下式計算相對遷移率: 每個蛋白標準的分子量對數對它的相對遷移率作圖得 標準曲線,量出未知蛋白的遷移率即可測出其分子量, 這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測 定才具有可靠性。 = 蛋白樣品距加樣端遷移距離cm 溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離cm 相對遷移率 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定多肽鏈分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳測定多肽鏈分子量 影響凝膠電泳的因素影響凝膠電泳的因素
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