生化實驗三果蔬中蛋白質含量測定

1、綜合實驗一： 果蔬成分的生化分析果蔬成分的生化分析 實驗一實驗一 果蔬中維生素果蔬中維生素C的定量測定（的定量測定（4學時）學時） 實驗二實驗二 果蔬中總糖及還原糖含量的測定（果蔬中總糖及還原糖含量的測定（4學時）學時） 實驗三實驗三 果蔬中蛋白質含量的測定（果蔬中蛋白質含量的測定（4學時）學時） 實驗四實驗四 果蔬中過氧化物酶分析（果蔬中過氧化物酶分析（12學時）學時） 實驗材料：實驗材料： 冬棗柚子冬棗柚子14組組 梨（梨（2個品種）個品種）58組組 盤菜蘿卜盤菜蘿卜 912組組 果蔬中蛋白質含量的測定果蔬中蛋白質含量的測定 （考馬斯亮藍法）（考馬斯亮藍法） 1、掌握蛋白質測定的方法和技術

2、。、掌握蛋白質測定的方法和技術。 2、了解果蔬中蛋白質的含量。、了解果蔬中蛋白質的含量。 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色， 最大光吸收在最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{ 色，最大光吸收在色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復染料復 合物在波長為合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正處的光吸收與蛋白質含量成正 比，通過測定比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結處光吸收的增加量可知與其結 合蛋白質的量。合蛋白質的量。 1、可

3、見光分光光度計、可見光分光光度計 2、旋渦混合器、旋渦混合器 3、試管、試管16支支 1、標準蛋白質溶液、標準蛋白質溶液牛血清清蛋白牛血清清蛋白(bsa)： 配制成配制成1.0mg/ /mL和和0.1mg/ /mL的標準蛋白質溶液。的標準蛋白質溶液。 2、考馬斯亮蘭、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：染料試劑： 稱稱100mg考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250，溶于，溶于50mL 95%的乙醇的乙醇 后，再加入后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀釋至的磷酸，用水稀釋至1L。 3、0.05mol/ /L Tris-HCl緩沖液（緩沖液（pH6.8） 4、各種果蔬、各種果蔬 1、標準曲線繪制：、標準

4、曲線繪制： 取取6支試管，按下表加入各試劑。支試管，按下表加入各試劑。 管號管號 試劑試劑 012345 100 g / /mL牛血清白蛋牛血清白蛋 白溶液白溶液mL 0 0.20.40.60.81.0 蒸餾水蒸餾水mL 1.00.80.60.40.20 考馬斯亮藍液考馬斯亮藍液mL 5.05.05.05.05.05.0 加入考馬斯亮藍加入考馬斯亮藍G-250蛋白試劑后，搖蛋白試劑后，搖 勻，放置勻，放置2min后，在后，在595nm波長下比色測定，波長下比色測定， 記錄記錄A595。 以各管相應標準蛋白質含量（以各管相應標準蛋白質含量（ g）為橫）為橫 坐標、坐標、A595為縱坐標，繪制標準

5、曲線。為縱坐標，繪制標準曲線。 2、樣品制備樣品制備： 稱取稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內， 加入加入1mL H 2O或 或0.05mol/ /L Tris-HCl緩沖液緩沖液 （pH6.8）研成勻漿，轉入離心管，再用）研成勻漿，轉入離心管，再用2mL水或水或 緩沖液緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部 轉入離心管，轉入離心管，3500rpm離心離心1520min，其上清液，其上清液 即為蛋白質提取液，供分析用。即為蛋白質提取液，供分析用。 （注：盤菜，蘿卜稀釋至（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL） 3、樣品測定樣品

6、測定： 試管中加自制蛋白質樣品試管中加自制蛋白質樣品1.0mL ，再加入，再加入 5.0mL考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻，放置試劑，搖勻，放置5min后，后， 在在595nm波長下比色，記錄波長下比色，記錄A595。 根據(jù)所測根據(jù)所測A595從標準曲線上查得蛋白質含量。從標準曲線上查得蛋白質含量。 、如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的、如果測定要求很嚴格，可以在試劑加入后的 520min內測定光吸收，因為在這段時間內顏色內測定光吸收，因為在這段時間內顏色 是最穩(wěn)定的。比色反應需在是最穩(wěn)定的。比色反應需在1h內完成。內完成。 、測定中，蛋白、測定中，蛋白-染料復合物會有少部分吸附

7、于染料復合物會有少部分吸附于 比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽比色杯壁上，實驗證明此復合物的吸附量是可以忽 略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）， 可用塑料或玻璃比色皿，測定完后可用可用塑料或玻璃比色皿，測定完后可用95%的乙醇的乙醇 將藍色的比色杯洗干凈。將藍色的比色杯洗干凈。 果蔬中蛋白質含量的測定果蔬中蛋白質含量的測定 （Folin-酚試劑法酚試劑法 ） 1、掌握蛋白質測定的方法和技術。、掌握蛋白質測定的方法和技術。 2、了解果蔬中蛋白質的含量。、了解果蔬中蛋白質的含量。 。 本方法最大的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法本方法最大的

8、優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法 靈敏靈敏100倍，較紫外分光光度法靈敏倍，較紫外分光光度法靈敏1020倍。倍。 1、分光光度計、分光光度計 2、電熱恒溫水浴箱、電熱恒溫水浴箱 3、試管、試管 15150mm 4、刻度吸管、刻度吸管 0.5mL、1mL、5mL 5、試管架、試管架 6、容量瓶、容量瓶 500mL 7、坐標紙、坐標紙 1、甲試劑：、甲試劑： ：2g無水碳酸鈉，加入無水碳酸鈉，加入0.1mol/ /L氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液 100mL混勻；混勻； ：稱?。悍Q取CuSO45H2O 0.5g，加入，加入1%（35mmol/ /L） 酒石酸鉀鈉溶液酒石酸鉀鈉溶液100mL，混勻。，混勻。 使

9、用前將與按使用前將與按50:1混合即成堿性硫酸銅溶混合即成堿性硫酸銅溶 液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和液。（混合后，試劑只能使用一天，但堿性溶液和 0.5% CuSO45H2O溶液可分別長期保存）溶液可分別長期保存） 2、乙試劑：、乙試劑： 在在2L磨口回流裝置中加入磨口回流裝置中加入100g鎢酸鈉，鎢酸鈉，25g鉬鉬 酸鈉及酸鈉及700mL蒸餾水，再加入蒸餾水，再加入50mL 85%磷酸及磷酸及 100mL濃濃HCl，充分混合后用小火回流，充分混合后用小火回流10小時?；匦r?；?流完畢冷卻后，加入流完畢冷卻后，加入150g鋰，鋰，50mL蒸餾水及液體蒸餾水及液體 溴數(shù)滴，搖勻

10、后再開口沸騰溴數(shù)滴，搖勻后再開口沸騰15分鐘，以驅逐過量溴。分鐘，以驅逐過量溴。 溶液冷卻后稀釋至溶液冷卻后稀釋至1000mL，溶液呈透明淡黃色，溶液呈透明淡黃色， 置于棕色瓶中暗處冰箱內可長期保存。置于棕色瓶中暗處冰箱內可長期保存。 使用前用標準使用前用標準NaOH溶液標定，以酚酞為指示溶液標定，以酚酞為指示 劑，標定其酸度為劑，標定其酸度為1 mol/ /L，此為乙試劑應用液，此為乙試劑應用液， 置冰箱中可長期保存。置冰箱中可長期保存。 3、牛血清白蛋白標準液（、牛血清白蛋白標準液（200 g g/ /mL）：）： 準確稱取牛血清白蛋白粉末準確稱取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用，用0.1

11、 mol/ /L NaOH溶液潤濕溶解，加蒸餾水到溶液潤濕溶解，加蒸餾水到250mL。 4、0.05mol/ /L Tris-HCl緩沖液（緩沖液（pH6.8） 5、各種果蔬、各種果蔬 1、標準曲線繪制：、標準曲線繪制： 取取7支試管，按下表加入各試劑。支試管，按下表加入各試劑。 試劑試劑0123456 牛血清牛血清 白蛋白白蛋白 標準液標準液 0.0mL 0.1mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL 蒸餾水蒸餾水1.0mL 0.9mL0.8mL0.6mL0.4mL0.2mL0.0mL 甲試劑甲試劑5.0mL 5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL 混勻，

12、于混勻，于2025（或室溫下）放置（或室溫下）放置10min 乙試劑乙試劑0.5mL 0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL 迅速混勻，迅速混勻，2025（或室溫下）放置（或室溫下）放置 30min，用分光光度計，在波長，用分光光度計，在波長500nm下，下， 以以“0”號管調零，測定各管吸光度。號管調零，測定各管吸光度。 以各管吸光度為縱坐標，各標準蛋白濃以各管吸光度為縱坐標，各標準蛋白濃 度為橫坐標，繪制標準曲線。度為橫坐標，繪制標準曲線。 2、樣品制備樣品制備： 稱取稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內，待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內， 加入加入1mL H 2O或

13、 或0.05mol/ /L Tris-HCl緩沖液緩沖液 （pH6.8）研成勻漿，轉入離心管，再用）研成勻漿，轉入離心管，再用2mL水或水或 緩沖液緩沖液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部 轉入離心管，轉入離心管，3500rpm離心離心1520min，其上清液，其上清液 即為蛋白質提取液，供分析用。即為蛋白質提取液，供分析用。 （注：盤菜，蘿卜稀釋至（注：盤菜，蘿卜稀釋至10mL） 3、樣品測定樣品測定： 取取2只試管編號，按下表加入試劑：只試管編號，按下表加入試劑： 試劑試劑空白管空白管測定管測定管 蛋白質提取液蛋白質提取液 - -1.0mL 蒸餾水蒸餾

14、水1.0mL- - 甲試劑甲試劑5.0mL5.0mL 混勻，于混勻，于2025（或室溫下）放置（或室溫下）放置10min 乙試劑乙試劑0.5mL0.5mL 迅速混勻，迅速混勻，2025（或室溫下）放置（或室溫下）放置 30min，用分光光度計，在波長，用分光光度計，在波長500nm下，以下，以 “0”號管調零，測定各管吸光度號管調零，測定各管吸光度 根據(jù)測定管吸光度，在標準曲線上查出根據(jù)測定管吸光度，在標準曲線上查出 對應的標準蛋白質的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，對應的標準蛋白質的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為每克鮮果蔬中蛋白質的微克數(shù)。即為每克鮮果蔬中蛋白質的微克數(shù)。 1、Folin-酚試劑在酸性條

15、件下較穩(wěn)定，在加入到堿酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，在加入到堿 性的銅離子性的銅離子-蛋白質溶液中時（蛋白質溶液中時（pH約約10），必須立），必須立 即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即即混勻，以便在磷鉬酸、磷鎢酸試劑破壞之前，即 發(fā)生還原反應。發(fā)生還原反應。 2、本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應起干擾、本法受多種因素干擾，凡對雙縮脲反應起干擾 作用的基團以及在性質上是氨基酸或肽的緩沖液均作用的基團以及在性質上是氨基酸或肽的緩沖液均 可干擾可干擾Folin-酚反應。酚反應。 3、所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸也會干擾、所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸也會干擾 Folin-酚反應。在測

16、試時應排除干擾因素或作空白酚反應。在測試時應排除干擾因素或作空白 試驗。濃度較低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等試驗。濃度較低的尿素、胍、三氯乙酸、乙醚等 （各（各0.5%左右）、硫酸鈉、硝酸鈉（各左右）、硫酸鈉、硝酸鈉（各1%）、乙）、乙 醇（醇（5%）等溶液對顯色無影響。但含量高時，必）等溶液對顯色無影響。但含量高時，必 須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只需加濃碳酸鈉須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只需加濃碳酸鈉- 氫氧化鈉溶液即可。若樣品酸度很高，顯色后色淺，氫氧化鈉溶液即可。若樣品酸度很高，顯色后色淺， 則必須提高碳酸鈉則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度氫氧化鈉溶液的濃度12倍。倍。 另外此法也

17、適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。另外此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 考馬斯亮藍考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色， 最大光吸收在最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{，當它與蛋白質結合后變?yōu)樗{ 色，最大光吸收在色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復染料復 合物在波長為合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正處的光吸收與蛋白質含量成正 比，通過測定比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結處光吸收的增加量可知與其結 合蛋白質的量。合蛋白質的量。 1、可見光分光光度計、可見光分光光度計 2、旋渦混合器、旋渦混合器 3、試管、試管16支支 1、標準蛋白質溶液、標準蛋白質溶液牛血清清蛋白牛血清清蛋白(bsa)： 配制成配制成1.0mg/ /mL和和0.1mg/ /mL的標準蛋白質溶液。的標準蛋白質溶液。 2、考馬斯亮蘭、考馬斯亮蘭G-250染料試劑：染料試劑： 稱稱100mg考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250，溶于，溶于50mL 95%的乙醇的乙醇 后，再加入后，再加入120mL 85%的磷酸，用水稀釋至的磷酸，用水稀釋