定量PCR中-ct值的含義

1、定量PCR中-ct值的含義實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。 一. 實時熒光定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。1. Ct 值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代

2、表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。圖1. Ct值的確定 2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系1，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值（如圖2所示）。因此，只要獲得未知樣品的C

3、t值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖2. 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線4. 熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料2?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1） TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖3所示。圖

4、3. TaqMan 熒光探針工作原理2）SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。二內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的意義1幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介3：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模

5、板4。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)5。3）PCRELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCRELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的6。2內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中

6、的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。圖4. 相同模板在同一臺PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性三內(nèi)標(biāo)對熒光定量PCR的影響 1實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光

7、信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。（見圖4）2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。2內(nèi)標(biāo)對實時熒光定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則P

8、CR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著7,8。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方9。Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，可實現(xiàn)多色熒光同時檢測，

9、但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域10,11,12,13。參考文獻(xiàn)1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. DNA/RNA Real-Time Qua

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15、. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46.熒光定量PCR中基線、閾值、Ct值、擴(kuò)增曲線、熔解曲線等基本概念基線（Baseline）：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。熒光域值（threshold）的設(shè)定：一般將 PC

16、R反應(yīng)前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR第315個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。CT值：表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)?？v坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。擴(kuò)增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實時熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線 判斷擴(kuò)增曲線是否良好的指標(biāo)主要有幾個方面：1、曲線拐點清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)