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文檔簡介
1、定量PCR中-ct值的含義實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。 一. 實時熒光定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。1. Ct 值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個很重要的概念 Ct值。C代表Cycle,t代
2、表threshold,Ct值的含義是:每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如圖1所示)。圖1. Ct值的確定 2. 熒光域值(threshold)的設定PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系1,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代Ct值(如圖2所示)。因此,只要獲得未知樣品的C
3、t值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。圖2. 熒光定量標準曲線4. 熒光化學熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料2。現(xiàn)將其原理簡述如下:1) TaqMan熒光探針:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的53外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖3所示。圖
4、3. TaqMan 熒光探針工作原理2)SYBR熒光染料:在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。二內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的意義1幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介3:1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模
5、板4。2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)5。3)PCRELISA法:利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗地高辛或生物素酶標抗體辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCRELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的6。2內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中
6、的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時,檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,所得結(jié)果有很大差異(見圖4),因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。圖4. 相同模板在同一臺PCR儀上進行96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定;Ct值則極具重現(xiàn)性三內(nèi)標對熒光定量PCR的影響 1實時熒光定量PCR無需內(nèi)標實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光
7、信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的:1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。(見圖4)2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。2內(nèi)標對實時熒光定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標,則P
8、CR反應變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著7,8。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。也正是這個原因,傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標,但仍然只是一種半定量的方法。美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較,得出的結(jié)論是:內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的,而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方9。Applied Biosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準,可實現(xiàn)多色熒光同時檢測,
9、但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法,而不用內(nèi)標進行定量。綜上所述,利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性最好的定量方法,已得到全世界的公認,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域10,11,12,13。參考文獻1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. DNA/RNA Real-Time Qua
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16、R反應前 15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值是PCR第315個循環(huán)熒光信號標準差的10倍,熒光域值設定在 PCR擴增的指數(shù)期。CT值:表示每個PCR反應管內(nèi)熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明,各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,CT值越小。反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)??v坐標代表CT值。因此,只要獲得未知樣品的CT值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。擴增曲線PCR過程中,以循環(huán)數(shù)為橫坐標,以反應過程中實時熒光強度為縱坐標所做的曲線 判斷擴增曲線是否良好的指標主要有幾個方面:1、曲線拐點清楚,特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯,擴
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