反膠束萃取在食品中的研究與進(jìn)展

1、分離工程 期末論文反膠束萃取在食品中的研究與進(jìn)展Research Progress of Reversed Micellar Extraction in Food Science學(xué) 院： 化學(xué)工程學(xué)院 專業(yè)班級： 化學(xué)工程與工藝 化工081 學(xué)生姓名： 林佳楠 學(xué) 號： 050811129 指導(dǎo)教師： 戴衛(wèi)東（副教授） 2011年6月期末論文中文摘要反膠束萃取在食品中的研究與進(jìn)展摘 要：綜述了反膠束萃取技術(shù)在食品科學(xué)中的進(jìn)展，包括酶活性研究，酶的提取、分離純化，蛋白質(zhì)提取、分離純化，氨基酸的合成，從油料作物同時分離油脂和植物蛋白，反膠束體系還可以作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)，具有良好的食品工業(yè)應(yīng)用前景。

2、關(guān)鍵詞：反膠束萃??；蛋白質(zhì)；氨基酸；酶；食品科學(xué)期末論文外文摘要Research Progress of Reversed Micellar Extraction in Food ScienceAbstract: The progress of reversed micellar extraction in food science was reviewed. The enzyme activities，extraction，separation and purification；protein extraction，separation and purification，peptide an

3、d amino acid synthesis；simultaneous extraction of oil and protein from oil crops；degradation of poisonous materials were included in. Reversed micellar system could also be reaction media for enzymes and has a good application in food industryKeywords: reversed micelles extraction；protein；amino acid

4、；enzyme；foods science分離工程期末論文 第 6 頁 共 6 頁 1 引言或緒論隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的溶劑萃取方法難以滿足生化分離的要求。1977年Luisi等人1首次發(fā)現(xiàn)胰凝乳蛋白酶可以溶解于含表面活性劑的有機(jī)溶劑，提出反膠束概念，短短幾十年，反膠束萃技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、氨基酸和細(xì)胞色素等生物活性大分子的分離提純。反膠束萃取技術(shù)基于液-液相轉(zhuǎn)移，萃取條件溫和，萃取效率高且反膠束體系能模擬細(xì)胞天然環(huán)境作為酶催化反應(yīng)介質(zhì)，在食品工業(yè)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。2 反膠束萃取原理和制備2.1 基本原理表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過臨界膠束濃度(CMC)時，便

5、形成聚集體，稱為正常膠束。表面活性劑溶于有機(jī)溶劑，當(dāng)濃度大于臨界膠團(tuán)濃度時，會在有機(jī)相中形成聚集體，稱為反膠束。反膠束中極性頭朝內(nèi)，非極性尾朝外排列形成親水內(nèi)核，稱為“水池”。如圖1所示。萃取時，待萃取的原料液以水相形式與反膠束體系接觸，調(diào)節(jié)各種參數(shù)，使其中要提取的物質(zhì)以最大限度轉(zhuǎn)入反膠束體系(前萃取)，后將含該物質(zhì)的前萃液與另外一個水相接觸，再次調(diào)節(jié)pH、離子強(qiáng)度等參數(shù)分出要提取物質(zhì)。2.2 體系性質(zhì)反膠束體系的性質(zhì)常用參數(shù)W0(或R)，與N來表示，其中W0為水與表面活性劑的摩爾比，是增溶水相對總體積的濃度，N是組成每個反膠柬微粒的表面活性劑分子個數(shù)(聚焦數(shù))。當(dāng)W0一定時，與N決定了膠柬微

6、粒的相對濃度。其中最重要的參數(shù)為W0 。2.3 增溶動力學(xué)蛋白質(zhì)在反膠束中增溶，普遍認(rèn)為動力是蛋白質(zhì)表面的電荷與形成反膠束內(nèi)表面的表面活性劑極性頭之間的靜電引力，如AOT(丁二酸2乙基已基酯磺酸鈉)/異辛烷形成的反膠束中，AOT是陰離子表面活性劑。當(dāng)原料樣pHpl時，蛋白質(zhì)帶正電，則增溶太，pHpl則增溶小。離子強(qiáng)度也有類似現(xiàn)象，很多研究表明蛋白質(zhì)與表面活性劑間的疏水作用也有很大作用。反膠束中，酶的動力學(xué)與水中相似，只是由于酶與表面活性劑作用、底物分配和交換，因而Km(米氏常數(shù))、Kcat(轉(zhuǎn)換數(shù))是復(fù)雜的多變量函數(shù)。2.4 制備方法目前常用轉(zhuǎn)移法、注入法、溶解法制備反膠束體系。3 反膠束萃取

7、技術(shù)在食品中的研究進(jìn)展3.1 反膠束萃取技術(shù)分離蛋白質(zhì)和氨基酸3.1.1 分離蛋白質(zhì)混合物不同種類的蛋白質(zhì)分子由于體積、表面電荷分布、疏水性質(zhì)等的不同，在反膠束體系兩相間有不同的分配系數(shù)，調(diào)節(jié)體系相關(guān)參數(shù)可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)選擇性萃取入反膠束有機(jī)相或富集于水相主體溶液，使混合體系的蛋白質(zhì)分級分離。Lee等人2以反膠束萃取技術(shù)分離混合蛋白質(zhì)體系中的乳白蛋白和乳球蛋白(質(zhì)量比為1:1)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始水相總蛋白質(zhì)濃度為1 mg/mL、pH為9、鈉離子濃度為0.1 moI/L時，萃取后85的乳白蛋白進(jìn)入AOT/異辛烷反膠束粒，而80的乳球蛋白仍殘留于水相溶液。Su等人3用AOT/異辛烷反膠束體系分離牛

8、初乳乳清蛋白質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水相主體溶液pH值為6.35，鈉離子強(qiáng)度為0.1 mol/L時，反膠束萃取后90以上的免疫球蛋白G留在水相溶液，而其他蛋白質(zhì)基本進(jìn)入反膠束有機(jī)相。Nishiki等人在二烷基磷酸鹽/異辛烷反膠束體系中研究溶菌酶和肌紅蛋白的分離行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水相KCl濃度為0.1 mol/L、pH為9.0時，溶菌酶基本進(jìn)入反膠柬微粒，而肌紅蛋白則留在水相；調(diào)節(jié)第二水相pH 1112時，90以上的溶菌酶可以反萃取到濃度為1.5 mol/L的KCl溶液中。3.1.2 從發(fā)酵液中直接分離純化蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)混合物的研究主要為純酶形成的純物質(zhì)模型系統(tǒng)，反膠束萃取法還可以從復(fù)雜的培養(yǎng)基，如發(fā)

9、酵液或粗提液中直接萃取蛋白質(zhì)。Krienger等人4用AOT/異辛烷反膠束體系從桔青霉(Penicillium citrinum)的粗提物中提取和純化了脂肪酶。發(fā)酵結(jié)束后桔青霉菌絲體經(jīng)過濾，收集含有脂肪酶的上清液得到粗提液，再經(jīng)萃取可得脂肪酶。Soni等人5用同樣的反膠束體系從發(fā)酵液中提取了黑曲霉(Aspergillus niger)的胞外酸性磷酸酯酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取和反萃取在最優(yōu)條件下，可從最初發(fā)酵液中獲得29的酸性磷酸酯酶。Yang等人6用反膠束萃取從豬血漿中分離純化球蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水相的pH值和鹽(NaCl)濃度和有機(jī)相表面活性劑(A0T)的濃度是影響萃取球蛋白的最重要的因素。在

10、400 mmol/L NaCl，350 mmol/L AOT 和pH =7.0時，保證產(chǎn)物純度為85的條件下，可獲得97的收獲率。Giouvenco7用反膠團(tuán)萃取法從全料液中提取和純化棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的胞內(nèi)脫氫酶，將全細(xì)胞的懸浮液注入十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)/己醇一辛烷反膠束溶液中，完整的細(xì)胞在表面活性劑的作用下被溶裂，析出酶進(jìn)入反膠束的“水池”中，經(jīng)反萃可選擇性地回收濃度很高的酶。在最優(yōu)條件下，對分子質(zhì)量較小的羥丁酸脫氫酶(Mw 63ku)和異檸檬酸脫氫酶(Mw 80ku)，反萃液中酶活性的回收率超過100(相對于用無細(xì)胞抽提液)，分子質(zhì)量較

11、大的葡萄糖6磷酸脫氫酶(Mw 200ku)不能被抽提出來，至少不能抽提到有活性的酶。細(xì)胞碎片留在反膠束相中是這種方法的一個不利因素，它使得反膠相不能重復(fù)使用。如果可以很便利地回收有機(jī)溶劑和表面活性劑，那么這種細(xì)胞溶解與蛋白質(zhì)萃取相結(jié)合的工藝方法，將成為從細(xì)胞中直接提取蛋白質(zhì)的重要途徑。3.1.2 從油料作物中同時分離油和蛋白質(zhì)植物蛋白提取的傳統(tǒng)方法是從脫脂粕中萃取的，不僅工藝復(fù)雜、能耗高，更重要的是加工過程中容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性；另一方面，傳統(tǒng)方法處理量小，造成大量的蛋白資源浪費(fèi)，而反膠束溶液不僅可以萃取植物蛋白，同時還可以分離出植物油脂，這一技術(shù)一旦有所突破，將引起整個制油工業(yè)發(fā)生質(zhì)的變革 這

12、一研究已成為反膠束技術(shù)在食品科學(xué)中研究的最大熱點(diǎn)之一。趙廷俊等人8用AOT/異辛烷反膠束體系同時萃取分離植物油中蛋白質(zhì)和油脂，其中油脂直接萃取入有機(jī)相中，蛋折質(zhì)則溶入反膠束“水池”內(nèi)，反萃取出蛋白質(zhì)，冷卻反膠束溶液使表面活性劑沉淀分離，最后用蒸餾法將油和烴類分開。實(shí)驗(yàn)采用正交化法，得到蛋白質(zhì)最佳萃取條件是，萃取時間90 min、KCl濃度0.10 mol/L、pH 5.5、AOT/異辛烷濃度0.16 g/mL；最佳反萃取條件是，萃取時間90 min、KCl濃度1.20 mol/L、pH值7.7。陳復(fù)生等9用AOT/異辛浣反膠束體系同時萃取植物蛋白和油脂，采用正交試驗(yàn)，找到了最佳藝條件：時間50

13、 min，KCl濃度0.15 mol/L，AOT/異辛烷為8 g/50mL得到影響萃取效果各因素主次順序：時間AOT/異辛烷KCl濃度3.1.3 氨基酸用反膠束萃取還可以將氨基酸從發(fā)酵液中提取出來。該過程關(guān)鍵在于有效控制影響氨基酸溶解的參數(shù)，這些參數(shù)是反膠束的結(jié)構(gòu)和氨基酸的離子化狀態(tài)。氨基酸的結(jié)構(gòu)和其離子化狀態(tài)將決定反膠束體系內(nèi)的相互作用和氨基酸溶解。氨基酸可以通過靜電或疏水作用增溶于反膠束中。利用氨基酸與反膠束作用的差異，可以選擇性地分離某些氨基酸。翁連進(jìn)等人10已成功開發(fā)了從胱氨酸母液中提取精氨酸的工藝，該工藝采用4級萃取，3級洗滌，可以使反膠束中精氨酸的純度大于98，整個工藝精氨酸的回收

14、率大于98。而目前工業(yè)上仍在應(yīng)用的離子交換法從胱氨酸母液中提取精氨酸的工藝回收率僅為10。Cardoso等11采用三辛基甲基氯化銨(TOMAC)/己醇/正庚烷反膠束體系對3種結(jié)構(gòu)和疏水性不同的氨基酸:天冬氨酸(pI 3.0，疏水性氨基酸)、苯丙氨酸(pI 5.76，弱疏水性氨基酸)和色氨酸(pI 5.88，疏水性氨基酸)的萃取條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，即使等電點(diǎn)十分相近的苯丙氨酸和色氨酸也可以完全分離。3.2 酶學(xué)研究3.2.1 酶活性的研究已報(bào)道有50多種酶的反膠束體系中具催化活性。反膠束體系中核心水團(tuán)分為自由水和結(jié)合水。W0較小時，核心水團(tuán)主要是結(jié)合水；隨W0增大，自由水逐漸增加，核心環(huán)境

15、逐漸接近水溶液。酶分子與表面活性劑問作用取決于酶分子與反膠束性質(zhì)，酶活性主要取決于核心水團(tuán)太小，表面活性劑性質(zhì)，反膠束濃度。研究發(fā)現(xiàn)各種酶活性變化有四種情況。酶活性隨W0增大而逐漸增大，到一定值后基本不變；酶活性隨W0增大而降低；酶活性與W0關(guān)系呈“鐘罩型”曲線，核心水團(tuán)大小合適時，酶活性最大；有些酶在一定的W0值時，酶括性幾倍、幾十倍甚至幾百倍于水中的活性，即所謂酶的“超活性”，如過氧化物酶約為水中的100倍，酸性磷酸酶則為水中的200倍另外各種酶活性與反膠束的組成有關(guān)。Karpe等12研究了凝乳蛋白酶在AOT/異辛烷體系中的酶超活性，用雙電層理論解釋，同時考慮局部電場強(qiáng)度和局部離子強(qiáng)度影響

16、通過計(jì)算，很好地符合泊松一玻茲曼等式他們認(rèn)為酶超括性是由于：“水池”中底物濃度高于水相中底物濃度；帶負(fù)電的底物與帶負(fù)電的表面活性劑表面產(chǎn)生斥力作用于酶，使酶活性增大。近年來，人們積極尋找具有超活性的酶，特別是在普通水相中活性很低或反應(yīng)要求較高的酶類用來水解油脂等。3.2.2 酶的提取和分離反膠束萃取技術(shù)可以從發(fā)酵液中提取胞外酶。Krishnakant等人采用濃度為0.20 mol/L 的A0T/異辛烷反膠束溶液從全發(fā)酵液中提純磷酸酯酶，通過優(yōu)化工藝過程，酶的回收率為29。劉國軍等人以AOT/異辛烷反膠束溶液從發(fā)酵液中提取納豆激酶，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異丙醇有助于酶的反萃??；經(jīng)反膠束萃取和反萃取后，酶的純化

17、倍數(shù)為2.7，活性為天然酶的80。Chou等人以AOT/異辛烷反膠束溶液從雞蛋中提取溶菌酶，提取所得溶菌酶活性為天然狀態(tài)的90，酶活力達(dá)7.310-4 u/mg。任虹等人13以CTAB/異辛烷反膠束溶液萃取纖維素酶，發(fā)現(xiàn)添加助溶劑正辛醇可以提高萃取率且纖維素酶萃取率隨水相pH值的升高而增大；當(dāng)水相初始pH值為11、KCl濃度為0.05 mol/L、有機(jī)相正辛醇與異辛烷體積比為2：9時，酶的萃取率可達(dá)90以上，適宜條件下反萃取后纖維素酶活性基本不損失。反膠束萃取技術(shù)還可以直接提取胞內(nèi)酶，Giovenco等人14報(bào)道，反膠束萃取技術(shù)從全料液中提取和純化棕色固氮菌的胞內(nèi)脫氫酶。在反膠束的表面活性劑作

18、用下，菌體細(xì)胞先被溶裂，析出的酶進(jìn)入反膠束微粒，可通過反萃取回收高濃度的活性酶。4 結(jié)論隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，開發(fā)和研究新型的下游分離技術(shù)已顯得十分重要。反膠束技術(shù)的研究僅僅二三十年，該技術(shù)在分離和純化生物物質(zhì)方面就有處理量大、可連續(xù)操作和活性損失低等特點(diǎn)。親和配體的引入提高了目標(biāo)物的萃取率及分離的選擇性，以及近年來它與其他應(yīng)用技術(shù)的結(jié)合等方面都顯示了較大的應(yīng)用潛力。許多研究工作已充分說明了反膠束萃取法分離、提取蛋白質(zhì)的可行性和優(yōu)越性；不僅是蛋白質(zhì)和酶能夠被提取，核酸、氨基酸和多肽也可以順利地溶于反膠束中。但對反膠束體系的應(yīng)用現(xiàn)在僅僅停留在研究階段，至今仍無大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用，還存在許多技術(shù)

19、上的問題有待解決?？梢韵嘈烹S著研究的深入反膠束萃取技術(shù)極有可能成為蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)分離、提取的一種重要方法。參 考 文 獻(xiàn)1 Luisi P L，Henninger F，Joppich M et al . Biochemical and Biophysical Research Communications，1994,74:13842 Yee L H，Ungan S R. Selective solubilization of -lactalbumin and -lactoglobulin into reversed micelles from their mixtures J. Journal of Food Science，1998,63（4）；6016053 Su Chiakai，Chiagt B H. Extraction of immunoglobulin-G from colostral wheyJ.J Dairy Sci，2003,86；163916454 Krieger N et a1. Journal of Chemical Technology & Biotechnology，1997，69(1)：77855 Soni K，Madamwar D. Process Biochemistry