分子生物學(xué)第08章PCR-聚合酶鏈反應(yīng)

1、8.1 PCR 的基本原理的基本原理 8.2 PCR 條件的優(yōu)化條件的優(yōu)化 8.3 由基本由基本 PCR 擴(kuò)展的相關(guān)技術(shù)及其應(yīng)用擴(kuò)展的相關(guān)技術(shù)及其應(yīng)用 8 PCR聚合酶鏈反應(yīng) PCR的特點(diǎn) 聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增）是一種體外擴(kuò)增DNA片片 段的方法，與用載體和宿主細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)段的方法，與用載體和宿主細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò) 增相比，有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，并有許多增相比，有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，并有許多 特殊的用處。特殊的用處。 PCR的基本原理一 PCR的基本原理二 圖圖81 PCR的的 基本原基本原 理理 PCR反應(yīng)的體系 1 D

2、NA模板模板 2 一對(duì)引物一對(duì)引物 3 耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶 4 4dNTP 5 緩沖液緩沖液 6 Mg2+、K+離子離子 7 酶活性保護(hù)劑酶活性保護(hù)劑 PCR儀 PCR儀實(shí)際上就是一種溫度循環(huán)儀，它儀實(shí)際上就是一種溫度循環(huán)儀，它 能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦 控制。常用的反應(yīng)容器有控制。常用的反應(yīng)容器有0.2ml的薄壁的薄壁 Eppendorf管和毛細(xì)玻璃管。管和毛細(xì)玻璃管。 對(duì)DNA模板的要求 對(duì)對(duì)DNA模板純度的要求不很高，但必須除去模板純度的要求不很高，但必須除去 DNA聚合酶抑制劑。理論上有一個(gè)聚合酶抑制劑。理論上有一個(gè)DNA

3、模板分子就模板分子就 可以擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物，實(shí)際上使用可以擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物，實(shí)際上使用pgng級(jí)的模板級(jí)的模板 量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模 板板DNA分子不宜太長(zhǎng)，可用切點(diǎn)稀少的限制酶切成分子不宜太長(zhǎng)，可用切點(diǎn)稀少的限制酶切成 較短的片段。由于環(huán)狀較短的片段。由于環(huán)狀DNA模板的擴(kuò)增效率較線狀模板的擴(kuò)增效率較線狀 DNA模板低，所以最好先將環(huán)狀模板低，所以最好先將環(huán)狀DNA用限制酶切成用限制酶切成 線狀再行擴(kuò)增。線狀再行擴(kuò)增。 RNA模板應(yīng)先逆轉(zhuǎn)錄成模板應(yīng)先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。 引 物 1 長(zhǎng)度一般為長(zhǎng)度一

4、般為1530個(gè)核苷酸。引物太短與模個(gè)核苷酸。引物太短與模 板結(jié)合的位點(diǎn)特異性差，引物太長(zhǎng)與模板結(jié)板結(jié)合的位點(diǎn)特異性差，引物太長(zhǎng)與模板結(jié) 合的速率下降，影響合的速率下降，影響PCR的效率。的效率。 2 不應(yīng)有超過(guò)不應(yīng)有超過(guò)3個(gè)連續(xù)的個(gè)連續(xù)的C或或G。引物自身不存。引物自身不存 在互補(bǔ)序列，兩個(gè)引物之間也不能有超過(guò)在互補(bǔ)序列，兩個(gè)引物之間也不能有超過(guò)4 個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)的情況。個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)的情況。 3 當(dāng)引物的當(dāng)引物的3端有足夠長(zhǎng)與模板互補(bǔ)的序列時(shí)，端有足夠長(zhǎng)與模板互補(bǔ)的序列時(shí)， 引物的引物的5端可以不與模板互補(bǔ)，利用這點(diǎn)可端可以不與模板互補(bǔ)，利用這點(diǎn)可 在在PCR產(chǎn)物的兩端加上特殊序列（如限制性

5、產(chǎn)物的兩端加上特殊序列（如限制性 內(nèi)切酶位點(diǎn)）。內(nèi)切酶位點(diǎn)）。 圖圖82 引物引物5端外加端外加BamH酶切酶切 位點(diǎn)摻入產(chǎn)物的兩端位點(diǎn)摻入產(chǎn)物的兩端 引 物 4 為了方便為了方便PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和分析，可以在引產(chǎn)物的檢測(cè)和分析，可以在引 物的物的5端以同位素或非同位素修飾（端以同位素或非同位素修飾（32P、熒、熒 光素、生物素等）。光素、生物素等）。 5 當(dāng)要擴(kuò)增的當(dāng)要擴(kuò)增的DNA序列不知，但知其編碼的氨序列不知，但知其編碼的氨 基酸序列，可反推出基酸序列，可反推出DNA序列，為設(shè)計(jì)引物序列，為設(shè)計(jì)引物 提供依據(jù)。因簡(jiǎn)并密碼的存在，反推出的提供依據(jù)。因簡(jiǎn)并密碼的存在，反推出的 DNA序列是不

6、唯一的，這時(shí)應(yīng)采用簡(jiǎn)并引物。序列是不唯一的，這時(shí)應(yīng)采用簡(jiǎn)并引物。 表表8 81 1 引物引物 5 5 端修飾技術(shù)端修飾技術(shù) 修飾法修飾法用途用途修飾法修飾法用途用途 1.附加核酸序列附加核酸序列2.功能基因修飾功能基因修飾 酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)便于克隆等便于克隆等同位素同位素(35S, 32P)檢測(cè)，定量檢測(cè)，定量 噬菌體啟動(dòng)子噬菌體啟動(dòng)子 測(cè)序，合成測(cè)序，合成 RNA探針等探針等 生物素生物素檢測(cè)，純化，定量檢測(cè)，純化，定量 蛋白質(zhì)結(jié)合序列蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化，檢測(cè)產(chǎn)物純化，檢測(cè)熒光素?zé)晒馑貦z測(cè)，純化檢測(cè)，純化 酶酶檢測(cè)檢測(cè) Taq DNA聚合酶 現(xiàn)在常用的現(xiàn)在常用的Taq酶，在酶，在95的變

7、性溫度下的變性溫度下 （20秒），經(jīng)過(guò)秒），經(jīng)過(guò)50次循環(huán)仍保持次循環(huán)仍保持65 %的酶活性。的酶活性。 對(duì)于對(duì)于Taq酶的聚合酶活性來(lái)說(shuō)，最佳作用溫度為酶的聚合酶活性來(lái)說(shuō)，最佳作用溫度為 7580，60時(shí)聚合酶活性僅剩時(shí)聚合酶活性僅剩1/2，37時(shí)時(shí) 聚合酶活性僅剩聚合酶活性僅剩1/10。但在許多情況下，需要。但在許多情況下，需要 在低于最適溫度條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，以免引在低于最適溫度條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，以免引 物從模板上解離下來(lái)。物從模板上解離下來(lái)。 Taq DNA聚合酶 Taq酶有酶有53的聚合活性和的聚合活性和53的外切活性，的外切活性， 但缺少但缺少35的外切活性，所以沒(méi)有校正功能，

8、有的外切活性，所以沒(méi)有校正功能，有 時(shí)會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤合成。使用時(shí)會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤合成。使用Taq酶還往往在所有擴(kuò)增酶還往往在所有擴(kuò)增 產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端增加一個(gè)非模板依賴的端增加一個(gè)非模板依賴的A?，F(xiàn)在作為商。現(xiàn)在作為商 品供應(yīng)的品供應(yīng)的Taq酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和 利用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程酶。利用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程酶。 PCR的反應(yīng)體系 PCR中常用的緩沖液是中常用的緩沖液是1050 mmol / L的的 Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.38.9，還需要合適的，還需要合適的Mg2+ 濃度（約濃度（約1.5 mmol / L）和）和K+濃度（濃度（5

9、0 mmol / L），）， 其中其中Mg2+濃度須經(jīng)過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定合適的值，在濃度須經(jīng)過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定合適的值，在 0.05 mmol / L和和5 mmol / L之間試驗(yàn)，按每之間試驗(yàn)，按每0.5 mmol / L增加。增加。Mg2+濃度太高時(shí)非特異擴(kuò)增增加，濃度太高時(shí)非特異擴(kuò)增增加， 太低時(shí)產(chǎn)物減少。太低時(shí)產(chǎn)物減少。 PCR的反應(yīng)體系 Taq酶的用量必須適當(dāng)，一般典型的擴(kuò)增反酶的用量必須適當(dāng)，一般典型的擴(kuò)增反 應(yīng)加應(yīng)加2單位的酶，太高非特異擴(kuò)增增加，太低時(shí)單位的酶，太高非特異擴(kuò)增增加，太低時(shí) 擴(kuò)增效率下降。擴(kuò)增效率下降。4種種dNTP的濃度應(yīng)相等，濃度的濃度應(yīng)相等，濃度 在在20200m

10、ol/L之間。反應(yīng)體系中加入之間。反應(yīng)體系中加入BSA或或 明膠可以保護(hù)明膠可以保護(hù)Taq酶活性。在無(wú)熱蓋的酶活性。在無(wú)熱蓋的PCR儀上，儀上， 反應(yīng)液表面應(yīng)加礦物油以阻止蒸發(fā)。反應(yīng)液表面應(yīng)加礦物油以阻止蒸發(fā)。 循環(huán)條件的設(shè)定 變性變性-退火退火-鏈延伸鏈延伸 循環(huán)循環(huán)變性變性退火退火鏈延伸鏈延伸 首輪循環(huán)首輪循環(huán)94 5 min50 2 min72 3 min 中間循環(huán)中間循環(huán)94 1 min50 2 min72 3 min 末輪循環(huán)末輪循環(huán)94 1 min50 2 min7210min 循環(huán)條件舉例循環(huán)條件舉例 循環(huán)條件的設(shè)定 在循環(huán)溫度的設(shè)定中，最重要的是退在循環(huán)溫度的設(shè)定中，最重要的是

11、退 火溫度。退火溫度較低可提高擴(kuò)增效率，火溫度。退火溫度較低可提高擴(kuò)增效率， 但產(chǎn)物的特異性較差；退火溫度較高可提但產(chǎn)物的特異性較差；退火溫度較高可提 高產(chǎn)物的特異性，但擴(kuò)增效率較低。高產(chǎn)物的特異性，但擴(kuò)增效率較低。 嵌套PCR ( nested PCR) 嵌套PCR提高產(chǎn)物特異性的原理 單用第一對(duì)引物擴(kuò)增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。單用第一對(duì)引物擴(kuò)增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。 單用第二對(duì)引物擴(kuò)增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。單用第二對(duì)引物擴(kuò)增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。 以第一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用第二對(duì)引物再次擴(kuò)增，只得到特以第一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，用第二對(duì)

12、引物再次擴(kuò)增，只得到特 異性產(chǎn)物。異性產(chǎn)物。 特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物 特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物 非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物 非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物 反向PCR ( inverted PCR) 錨式PCR ( anchored PCR) RACE Rapid Amplification of cDNA Ends 擴(kuò)增擴(kuò)增mRNA3端或端或5端的序列稱為端的序列稱為RACE。 錨式PCR擴(kuò)增已知序列3側(cè)序列 錨式PCR擴(kuò)增已知序列5側(cè)序列 錨式PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的mRNA序列 要擴(kuò)增全長(zhǎng)的要擴(kuò)增全長(zhǎng)的mRNA，先用，先用oligo(dT) 作引物逆轉(zhuǎn)錄該作引物逆轉(zhuǎn)錄該mRNA成全長(zhǎng)的成全長(zhǎng)的cDNA第一第一

13、 鏈，再給鏈，再給cDNA第一鏈的第一鏈的3端進(jìn)行同聚物加端進(jìn)行同聚物加 尾（如尾（如GGGGG），最后用），最后用oligo(dT)和和 oligo(dC)進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行擴(kuò)增。 不對(duì)稱PCR ( asymmetric PCR) 定量PCR 嚴(yán)格地掌握實(shí)驗(yàn)條件，使嚴(yán)格地掌握實(shí)驗(yàn)條件，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物 量與模板量成正比。這樣可將痕量的模板擴(kuò)量與模板量成正比。這樣可將痕量的模板擴(kuò) 增后檢測(cè)，從而得到原模板的量。增后檢測(cè)，從而得到原模板的量。 此法常用于低豐度此法常用于低豐度mRNA的檢測(cè)。先將的檢測(cè)。先將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以，再以cDNA為模板擴(kuò)為模板擴(kuò) 增出產(chǎn)物，檢測(cè)

14、產(chǎn)物的量從而推算出低豐度增出產(chǎn)物，檢測(cè)產(chǎn)物的量從而推算出低豐度 mRNA的量。這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄的量。這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（RT PCR）。）。 ( quantitative PCR ) 定量PCR中的內(nèi)標(biāo) 由于影響擴(kuò)增產(chǎn)量的因素較多，模板與擴(kuò)增由于影響擴(kuò)增產(chǎn)量的因素較多，模板與擴(kuò)增 產(chǎn)物量的比例關(guān)系難以確定，所以必須在同一次產(chǎn)物量的比例關(guān)系難以確定，所以必須在同一次 PCR中加入內(nèi)標(biāo)。在一次中加入內(nèi)標(biāo)。在一次PCR中同時(shí)加入兩種模中同時(shí)加入兩種模 板，一種是待測(cè)模板，另一種是按確定量加入的板，一種是待測(cè)模板，另一種是按確定量加入的 作為內(nèi)標(biāo)的對(duì)照模板，二者使用相同的引物，對(duì)作為內(nèi)標(biāo)的對(duì)照

15、模板，二者使用相同的引物，對(duì) 照模板與待測(cè)模板的差異應(yīng)盡量小，以便最大程照模板與待測(cè)模板的差異應(yīng)盡量小，以便最大程 度地減少擴(kuò)增效率的系統(tǒng)誤差。對(duì)照模板擴(kuò)增產(chǎn)度地減少擴(kuò)增效率的系統(tǒng)誤差。對(duì)照模板擴(kuò)增產(chǎn) 物和待測(cè)模板擴(kuò)增產(chǎn)物必須能由電泳分辨出來(lái)，物和待測(cè)模板擴(kuò)增產(chǎn)物必須能由電泳分辨出來(lái)， 比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列 中有限制酶切位點(diǎn)的差異。中有限制酶切位點(diǎn)的差異。 熒光定量PCR 1995年美國(guó)年美國(guó)PerKin Elmer公司研制成功具有公司研制成功具有 革命性意義的熒光定量革命性意義的熒光定量PCR技術(shù)，它融合了技術(shù)，它融合了 PCR

16、高靈敏性、高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技雜交的高特異性和光譜技 術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)。熒光定量術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)。熒光定量PCR是直接是直接 探測(cè)探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的 結(jié)果，不需要結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，完全閉后處理或電泳檢測(cè)，完全閉 管操作，在整個(gè)過(guò)程中，僅有加入樣品的一次開(kāi)管操作，在整個(gè)過(guò)程中，僅有加入樣品的一次開(kāi) 蓋。蓋。 TaqMan熒光探針 （線性探針）（線性探針） 在在PCR擴(kuò)增體系中加入一個(gè)特異性的、能與擴(kuò)增體系中加入一個(gè)特異性的、能與PCR 產(chǎn)物中部雜交的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩產(chǎn)物中部雜交的熒

17、光探針，該探針為一寡核苷酸，兩 端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（R）和一個(gè)熒光淬滅）和一個(gè)熒光淬滅 基團(tuán)（基團(tuán)（Q）。探針完整時(shí)，）。探針完整時(shí)，R基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被 Q基團(tuán)吸收，結(jié)果是沒(méi)有熒光出現(xiàn)?；鶊F(tuán)吸收，結(jié)果是沒(méi)有熒光出現(xiàn)。PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增時(shí)， Taq酶的酶的53外切活性將探針酶切降解，使外切活性將探針酶切降解，使R基基 團(tuán)與團(tuán)與Q基團(tuán)分離，基團(tuán)分離，Q基團(tuán)對(duì)基團(tuán)對(duì)R基團(tuán)的熒光淬滅作用消基團(tuán)的熒光淬滅作用消 失，于是產(chǎn)生熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條失，于是產(chǎn)生熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有鏈，就有 一個(gè)一個(gè)R基團(tuán)分離，游離的基團(tuán)分離，游離的R基

18、團(tuán)數(shù)量（也就是熒光強(qiáng)基團(tuán)數(shù)量（也就是熒光強(qiáng) 度）與度）與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度產(chǎn)物的形成完全同步。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度 的變化，機(jī)內(nèi)的電腦可以計(jì)算并直接給出初始模板的的變化，機(jī)內(nèi)的電腦可以計(jì)算并直接給出初始模板的 數(shù)量。數(shù)量。 TaqMan熒光探針工作原理 分子信標(biāo)（環(huán)狀探針）（環(huán)狀探針） 分子信標(biāo)熒光探針的設(shè)計(jì)與分子信標(biāo)熒光探針的設(shè)計(jì)與TaqMan熒光探針熒光探針 相似，只不過(guò)探針的相似，只不過(guò)探針的5端和端和3端的一小段序列被端的一小段序列被 設(shè)計(jì)成互補(bǔ)的，探針沒(méi)有與靶序列雜交時(shí)會(huì)形成莖設(shè)計(jì)成互補(bǔ)的，探針沒(méi)有與靶序列雜交時(shí)會(huì)形成莖 環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)結(jié)構(gòu)，R基團(tuán)和基團(tuán)和Q基團(tuán)靠近，不能產(chǎn)生熒光。當(dāng)基團(tuán)靠近，不能產(chǎn)生熒光。當(dāng) 分子信標(biāo)與靶序列雜交時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被展開(kāi)，使得分子信標(biāo)與靶序列雜交時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被展開(kāi)，使得 R 基團(tuán)和基團(tuán)和Q基團(tuán)分開(kāi)基團(tuán)分開(kāi) 足夠遠(yuǎn)，足夠遠(yuǎn)，