農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性陰性細(xì)菌，細(xì)菌， 它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷 部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根冠癭瘤或發(fā)狀根。 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌 感染柳樹感染柳樹 產(chǎn)生產(chǎn)生 冠癭瘤冠癭瘤 原理：原理： 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有TiTi質(zhì)粒和質(zhì)粒和 RiRi質(zhì)粒質(zhì)粒，其上有一段，其上有一段T-DNAT-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口 進(jìn)入細(xì)胞后，可將進(jìn)入細(xì)胞后，可將

2、T-DNAT-DNA插入到植物基因組中。插入到植物基因組中。 因此，農(nóng)桿菌是一種因此，農(nóng)桿菌是一種天然天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人 們將們將目的基因目的基因插入到經(jīng)過改造的插入到經(jīng)過改造的T-DNAT-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的區(qū)，借助農(nóng)桿菌的 感染實(shí)現(xiàn)感染實(shí)現(xiàn)外源基因外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過 細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些

3、單子葉植物（尤其是水稻）中也 得到了廣泛應(yīng)用。得到了廣泛應(yīng)用。 StoryStory 冠癭瘤病冠癭瘤病：雙子葉植物經(jīng)常發(fā)生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形 似帽狀而得名。 1907年， Smith pilot protein? nuclear localization?(VirD2) VirC2.0226,23C?processing of T-DNA(VirC1) VirE2.027, 60.5C/M? single-strand DNA-binding protein (VirE2) virB9.511 26,12,11,87,23,32,5.5, 25,32,48,38 MT-D

4、NA transfer apparatus? T-DNA加工和轉(zhuǎn)移加工和轉(zhuǎn)移 Vir基因表達(dá)調(diào)控的問題，知道基因表達(dá)調(diào)控的問題，知道VirA和和VirG基因誘導(dǎo)其它基因誘導(dǎo)其它Vir基基 因的表達(dá)，當(dāng)因的表達(dá)，當(dāng)VirD操縱元的被誘導(dǎo)表達(dá)后，其中的操縱元的被誘導(dǎo)表達(dá)后，其中的VirD1和和 VirD2蛋白質(zhì)具有核酸內(nèi)切酶的活性蛋白質(zhì)具有核酸內(nèi)切酶的活性(Yanofsky MF. 1986)， 能夠在能夠在T-DN A邊界重復(fù)序列的特異位點(diǎn)切開邊界重復(fù)序列的特異位點(diǎn)切開T-DNA單鏈，因此單鏈，因此 T-DNA往往以單鏈形式進(jìn)入植物細(xì)胞。但是在植物細(xì)胞中也發(fā)往往以單鏈形式進(jìn)入植物細(xì)胞。但是在植物

5、細(xì)胞中也發(fā) 現(xiàn)雙鏈現(xiàn)雙鏈T-DNA分子。分子。 切刻位點(diǎn)切刻位點(diǎn)(nick site)可作為可作為DNA從從5向向3合成的起始位合成的起始位 點(diǎn)，新的點(diǎn)，新的DNA鏈合成后，鏈合成后，T-DNA單鏈即被替換單鏈即被替換 (displacement)釋放出來釋放出來(圖圖2)。當(dāng)然這種缺刻也可通。當(dāng)然這種缺刻也可通 過重組系統(tǒng)把過重組系統(tǒng)把T-DNA雙鏈從雙鏈從Ti質(zhì)粒上解離下來。質(zhì)粒上解離下來。 缺失研究也表明：右邊界重復(fù)序列缺失后，缺失研究也表明：右邊界重復(fù)序列缺失后，T-DNA不能轉(zhuǎn)不能轉(zhuǎn) 移，而左邊界重復(fù)序列的缺失會(huì)稍稍降低移，而左邊界重復(fù)序列的缺失會(huì)稍稍降低T-DNA轉(zhuǎn)移頻率轉(zhuǎn)移頻率

6、(Timmerman B1988)，這進(jìn)一步說明，這進(jìn)一步說明T-DNA單鏈?zhǔn)窃趶膯捂準(zhǔn)窃趶?右邊界到左邊界右邊界到左邊界5向向3替換合成中釋放出來的。替換合成中釋放出來的。 右邊界的缺失，使得右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而合成不能起始，因而T-DNA不不 能釋放，所以能釋放，所以T-DNA不能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。而左邊界的缺不能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。而左邊界的缺 失，僅會(huì)影響失，僅會(huì)影響DNA合成過程的終止，可能會(huì)降低導(dǎo)致合成過程的終止，可能會(huì)降低導(dǎo)致T- DNA單鏈釋放，而不會(huì)明顯影響單鏈釋放，而不會(huì)明顯影響T-DNA單鏈的形成。單鏈的形成。 可見可見T-DNA左邊界序列作為合成左邊界序

7、列作為合成DNA的起始位點(diǎn)的效率比的起始位點(diǎn)的效率比 右邊界序列低。這種不同不是由于左右邊界的右邊界序列低。這種不同不是由于左右邊界的24bp重復(fù)序重復(fù)序 列核苷酸不同，而是由于靠近右邊界位置有一個(gè)轉(zhuǎn)移增強(qiáng)列核苷酸不同，而是由于靠近右邊界位置有一個(gè)轉(zhuǎn)移增強(qiáng) 子子(transfer enhancer；overdriverPeralta EG1986) 存在。這個(gè)存在。這個(gè)T-DNA轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列能極其明顯的增加農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移增強(qiáng)序列能極其明顯的增加農(nóng)桿菌 中中T-DNA鏈形成，并且這種作用與它的位置、方向及距離鏈形成，并且這種作用與它的位置、方向及距離 均無關(guān)系。增強(qiáng)子的缺失能夠使農(nóng)桿菌對宿主植物的毒

8、性均無關(guān)系。增強(qiáng)子的缺失能夠使農(nóng)桿菌對宿主植物的毒性 降低。降低。Toro等人發(fā)現(xiàn)等人發(fā)現(xiàn)VirC1蛋白能特異性的結(jié)合這個(gè)增強(qiáng)蛋白能特異性的結(jié)合這個(gè)增強(qiáng) 子，子，VirC操縱元的突變也能導(dǎo)致農(nóng)桿菌的毒性減弱。操縱元的突變也能導(dǎo)致農(nóng)桿菌的毒性減弱。 當(dāng)當(dāng)T-DNA單鏈進(jìn)入植物細(xì)胞后，植物細(xì)胞如何處理這些單鏈單鏈進(jìn)入植物細(xì)胞后，植物細(xì)胞如何處理這些單鏈DNA？ Paul等等 人利用電轉(zhuǎn)移法把單鏈人利用電轉(zhuǎn)移法把單鏈DNA轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，結(jié)果表明，在植物轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，結(jié)果表明，在植物 細(xì)胞中，細(xì)胞中， 單鏈單鏈DNA迅速轉(zhuǎn)變成雙鏈迅速轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子。此外單鏈分子。此外單鏈DNA比

9、雙鏈比雙鏈DNA的轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn) 化效率更化效率更 高。然而高。然而T-DNA分子并非以裸露的單鏈分子并非以裸露的單鏈DNA形式進(jìn)入植物細(xì)胞的。形式進(jìn)入植物細(xì)胞的。T- DNA單鏈單鏈 的的5端共價(jià)的結(jié)合著端共價(jià)的結(jié)合著VirD2蛋白質(zhì)，從而保護(hù)蛋白質(zhì)，從而保護(hù)T-DNA分子免受外切核分子免受外切核 酸酶的降酸酶的降 解，此外解，此外VirD2蛋白質(zhì)上含有核定位的序列，所以結(jié)合在蛋白質(zhì)上含有核定位的序列，所以結(jié)合在T-DNA 5端端 的的VirD2 蛋白質(zhì)象一個(gè)蛋白質(zhì)象一個(gè)“導(dǎo)向儀導(dǎo)向儀”(pilot)指引并保護(hù)指引并保護(hù)T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核中。進(jìn)入植物細(xì)胞核中。 VirE2蛋白蛋白 質(zhì)是一種單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠包裹質(zhì)是一種單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠包裹T-DNA單鏈，和其它單鏈，和其它T-DNA結(jié)結(jié)