微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告：水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的檢測(cè)摘 要：本實(shí)驗(yàn)以測(cè)定公園河流水的細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的數(shù)量，來測(cè)定特定地點(diǎn)的水質(zhì)情況。初步介紹了一種通用的方法來檢測(cè)水源的健康指標(biāo)，判定水體的質(zhì)量。對(duì)該實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的水源作出了定性的評(píng)價(jià)，以及關(guān)于試驗(yàn)中如何提高梯度重復(fù)的精度的分析。關(guān)鍵字：河流水；細(xì)菌總數(shù)測(cè)定；大腸菌群；EMB培養(yǎng)前言各種天然水中常含有一定數(shù)量的微生物。水中細(xì)菌總數(shù)往往同水體受有機(jī)污染程度呈正相關(guān)，因而是評(píng)價(jià)水質(zhì)污染程度的重要指標(biāo)之一。細(xì)菌總數(shù)是指1mL水樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)cfu/g(mL)，可用稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)。水中大腸菌群的數(shù)量可用來判斷水源是否被糞便污染，并可間接推測(cè)水源受腸道病原菌污染

2、的可能。特征：G-無芽孢桿菌，兼性厭氧、在3724h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。多管發(fā)酵法初發(fā)酵：適當(dāng)稀釋樣品，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；分離培養(yǎng)：伊紅美藍(lán)（EMB）平板上劃線分離，出現(xiàn)紫色、粉紅色特征性菌落；復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證：挑取特征性菌落進(jìn)行乳酸復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證。材料和方法牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：用于水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，瓊脂8g， 蒸餾水1000ml； pH 7.0乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基：用于初發(fā)酵1：蛋白胨 20g、牛膽鹽 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（調(diào)pH值后加）、水 1000mL、pH 7.27.4三倍濃縮液（3）：除水以外，其余

3、成分取三倍用量分裝：1的培養(yǎng)基分裝9ml/管， 3的培養(yǎng)基分裝5ml/管或50ml/瓶，均裝上德漢氏小管。滅菌條件：115 ，15min。EMB培養(yǎng)基：用于大腸菌群菌落鑒定脫水培養(yǎng)基，按說明書操作，水用量為90%。水源：紫竹院河水 儀器： 高壓滅菌鍋、無菌培養(yǎng)皿、試管、吸管、接種環(huán) 、德漢氏小管、溫箱、載玻片、酒精燈、顯微鏡等。試劑 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂粉，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、膽鹽、革藍(lán)氏染色試劑具體實(shí)驗(yàn)步驟：1），相關(guān)器械的滅菌操作，以及前往紫竹院取少量的樣品水。2），按照上述的配料，無菌操作配置培養(yǎng)基。3），細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：取上述樣品水，一

4、次稀釋10-1,10-2,10-3,3個(gè)濃度。對(duì)于每個(gè)濃度，取1ml稀釋液加入冷卻好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，立即混勻，每個(gè)濃度重復(fù)一次。將平皿倒置培養(yǎng)在37的溫箱24h，計(jì)算平皿的細(xì)菌總數(shù)。4），大腸菌群的測(cè)定：將樣品水稀釋成100,10-1,10-2,3個(gè)梯度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析1，細(xì)菌菌落總數(shù)組別稀釋濃度及菌落數(shù)平板菌落狀況報(bào)告方式選取菌落總數(shù)（cfug , cfu/ml10-110-210-311200均小于30最低稀釋度下菌落數(shù)稀釋倍數(shù)8.0102400平均8002,大腸菌群總數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果原溶液10-110-2ck初發(fā)酵產(chǎn)酸+-產(chǎn)氣+-EMB紫黑色+-粉紅色-革蘭氏染色G-+-結(jié)論+0陽

5、性管數(shù)5003，EMB 數(shù)據(jù)值計(jì)算查表可得，MPN=接種量最大的管：1ml 每100ml水樣中菌數(shù)最大可能值：230 95%可信限值 上限：700 下限：70水樣的分析得出這樣的結(jié)果：細(xì)菌總數(shù)：80個(gè)/mL大腸菌群數(shù)：2300個(gè)/L大腸菌群數(shù)占細(xì)菌總數(shù)：2.88%。根據(jù)我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB5749-85規(guī)定細(xì)菌總數(shù)不超過100個(gè)，已達(dá)標(biāo)。大腸菌群不得超過1000個(gè)，超標(biāo)。經(jīng)過嚴(yán)格的消毒處理，大腸桿菌不超過10000個(gè)，水樣達(dá)標(biāo)。結(jié)論：從上述的水樣分析，我們可以得出此處的河流水污染不是很嚴(yán)重，作為景觀水，已經(jīng)達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)，但是此類水是不能作為飲用水的，可能存在一些糞便的污染，導(dǎo)致大腸菌群的數(shù)

6、量過高，倘若經(jīng)過嚴(yán)格的消毒滅菌，才能飲用。實(shí)驗(yàn)討論：1， 大腸菌群的定義是什么？、為什么要選擇大腸菌群作為水源被腸道病原菌污染的指示菌？大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。而由于大腸菌群分布較廣，在溫血?jiǎng)游锛S便和自然界廣泛存在。大量的調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血?jiǎng)游锛S便、人類經(jīng)?；顒?dòng)的場(chǎng)所以及有糞便污染

7、的地方，而且人、畜糞便對(duì)外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對(duì)人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性。所以大腸菌群是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。 2，EMB培養(yǎng)

8、基含有哪幾種主要成分？在檢查大腸菌群時(shí)，各起什么作用？EMB培養(yǎng)基主要包含以下幾種物質(zhì)：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氫鉀，伊紅Y，美藍(lán)，蒸餾水。EMB培養(yǎng)基的機(jī)制就是靠微生物在發(fā)酵過程中，使培養(yǎng)基發(fā)生分解，產(chǎn)生大量的氫離子，從而改變培養(yǎng)基的PH，由于提前添加的指示劑，在PH值的改變下，就會(huì)發(fā)生顏色的變化，從而鑒定生長(zhǎng)的菌種。在檢測(cè)大腸菌群的時(shí)候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氫鉀提供了磷元素和鉀元素，實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意的問題以及改進(jìn)：1，樣品的問題 由于本實(shí)驗(yàn)是一個(gè)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)，存在一個(gè)嚴(yán)格滅菌的過程。從采樣，到最后的分析，整個(gè)過程不僅不能讓其他雜菌污染，而且還得保證樣品中本身細(xì)菌的總數(shù)基本不損失。1），采樣的

9、器械必須是經(jīng)過嚴(yán)格滅菌的，而且其本身的構(gòu)造不會(huì)對(duì)微生物的生存造成威脅。2），由于樣品會(huì)處于密閉的過程，水中的含氧量會(huì)慢慢降低，所以對(duì)樣品的處理應(yīng)該盡快處理。3），對(duì)于樣品的稀釋不應(yīng)該用蒸餾水，而應(yīng)該用滅菌的生理鹽水，防止細(xì)菌吸水裂解死亡。4），整個(gè)接種的操作必須正確，不能殺死細(xì)菌，或者引入其他雜菌。2，關(guān)于梯度重復(fù)的問題本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到一個(gè)很關(guān)鍵的問題，那就是梯度重復(fù)。對(duì)于一個(gè)梯度的實(shí)驗(yàn)量的統(tǒng)計(jì)和處理，我們常常采用重復(fù)，來解決其實(shí)驗(yàn)誤差所造成的影響，但有些時(shí)候重復(fù)增加了大量的工作量，卻沒有根本提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，僅以本實(shí)驗(yàn)為例。在對(duì)細(xì)菌數(shù)量測(cè)定時(shí)候，我們每個(gè)梯度設(shè)置了2個(gè)重復(fù)，在事實(shí)上，第一個(gè)梯度的

10、準(zhǔn)確性很高，但是在最后一個(gè)梯度，可能存在很大的誤差。在對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行定量分析的時(shí)候，我們往往要考慮很多干擾它的因數(shù)。假定我們所取的樣品現(xiàn)在要進(jìn)行一個(gè)梯度的稀釋后取樣，當(dāng)前濃度為c，取樣的體積為v，那么假定單位體積內(nèi)只存在一個(gè)細(xì)菌，則可以建立如下的數(shù)學(xué)模型：從模型中，我們可以得到最終的表達(dá)式：，當(dāng)取樣體積和梯度恒定的時(shí)候，我們不難發(fā)現(xiàn)，增大取樣的重復(fù)數(shù)，可以提高實(shí)驗(yàn)的精確度，但是當(dāng)c足夠大的時(shí)候，分子本身就會(huì)變得無限小，而分母的一次增量遠(yuǎn)不如多次的。同理，當(dāng)c很小的時(shí)候，分子變得很大，分母變得很小，這個(gè)時(shí)候不增加次數(shù)，或者調(diào)解取樣體積，會(huì)造成很高的實(shí)驗(yàn)誤差，所以，本實(shí)驗(yàn)的三個(gè)精度變量就是梯度，取樣體積，梯度重復(fù)數(shù)。鑒于對(duì)本實(shí)驗(yàn)的最后分析，我們覺得，在后兩個(gè)梯度有必要增加重復(fù)數(shù)，雖然增加了工作量，但是可以有效避免較大的實(shí)驗(yàn)誤差帶來的干擾。同樣，在對(duì)其他的實(shí)驗(yàn)樣品處理過程中，原始濃度一般只需要2個(gè)重復(fù)，隨著數(shù)量級(jí)的增加，其重復(fù)的次數(shù)也應(yīng)該發(fā)生變化，不應(yīng)該不變，諸如在在10-3，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，而10-5時(shí)候，可以設(shè)置8個(gè)重復(fù)，這樣可以在追求最簡(jiǎn)工作量的時(shí)候，獲得最簡(jiǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參考文獻(xiàn)：1 王玉蘭. 環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù).北京，化學(xué)工業(yè)出版社. 2009,3.2 陳堅(jiān). 環(huán)