發(fā)酵工程基本操作

1、2021/3/271 第一節(jié) 嚴(yán)格消毒滅菌 控制有害微生物主要有以下幾種措施 2021/3/272 除菌的方法 培養(yǎng)基的加熱滅菌（包括常壓或蒸汽高 壓加熱法） 空氣的過濾除菌 紫外線或電離輻射 化學(xué)藥物滅菌 2021/3/273 培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 2021/3/274 一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素一、影響培養(yǎng)基滅菌的因素 1、pH值的影響 pH值對(duì)微生物的耐熱性影響很 大,pH為6.0-8.0時(shí)微生物最不 易死亡, pH 6.0時(shí)氫離子易 滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。 2021/3/275 2、培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的成分中,油脂、糖類、蛋白質(zhì)都 是傳熱的不良介質(zhì),會(huì)增加微生物的耐熱 性,使滅菌困難。

2、 濃度較高的培養(yǎng)基相對(duì)需要較高溫度和 較長時(shí)間滅菌。 高濃度的鹽類,色素則削弱其耐熱性,故 較易滅菌。 2021/3/276 3、培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì) 培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)大,滅菌困難,反之, 滅菌容易。一般說來,含有顆粒對(duì)培養(yǎng)基 滅菌影響不大,但在培養(yǎng)基混有較大顆粒, 特別是存在凝結(jié)成團(tuán)的膠體時(shí),會(huì)影響滅 菌效果,必須過濾除去。 2021/3/277 二、滅菌的實(shí)際操作二、滅菌的實(shí)際操作 （一）空罐滅菌（一）空罐滅菌 空罐滅菌也稱空消。無論是種子罐、發(fā)酵罐、 還是尿素（或液氨）罐、消泡罐,當(dāng)培養(yǎng)基 （或物料）尚未進(jìn)罐前對(duì)罐進(jìn)行預(yù)先滅菌,為 空罐滅菌。 為了殺死所有微生物特別是耐熱的的芽孢,空 罐

3、滅菌要求溫度較高,滅菌時(shí)間較長,只有這樣 才能殺死設(shè)備中各死角殘存的雜菌或芽孢。 2021/3/278 （二）實(shí)罐滅菌（二）實(shí)罐滅菌 將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中用蒸汽加熱,達(dá)到預(yù)定 滅菌溫度后,維持一定時(shí)間,再冷卻到發(fā)酵溫度, 然后接種發(fā)酵,這叫做實(shí)罐滅菌,又稱分批滅菌。 操作要點(diǎn): 三路進(jìn)汽:直接蒸汽從通風(fēng)、取樣和出料口進(jìn) 入罐內(nèi)直接加熱,直到所規(guī)定的溫度,并維持一 定的時(shí)間。這就是所謂的“三路進(jìn)氣”。 2021/3/279 培養(yǎng)基連消工藝流程圖培養(yǎng)基連消工藝流程圖 2021/3/2710 2021/3/2711 （2）過濾除菌法 是將液體或氣體用微孔薄膜過濾,使大于 孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留,

4、從而達(dá)到 除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí),過濾除菌大多 用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng) 液。 2021/3/2712 （3）其他方法 在配制培養(yǎng)基時(shí),為避免發(fā)生沉淀,一般 應(yīng)按配方逐一加入各種成分。 另外,加入0.01EDTA或0.01NTA（氮 川三乙酸）等螯合劑到培養(yǎng)基中,可防止 金屬離子發(fā)生沉淀。 最后,還可以用氣體滅菌劑如氧化乙烯等 對(duì)個(gè)別成分進(jìn)行滅菌處理。 2021/3/2713 三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑三、化學(xué)殺菌劑或制菌劑 2021/3/2714 （一）表面消毒劑 常用消毒劑的種類很多,它們的殺菌強(qiáng)度 各不相同。但幾乎都有一個(gè)共同規(guī)律,即當(dāng)其 在極低濃度時(shí),常常會(huì)對(duì)微生物的生命活動(dòng)起

5、刺激作用,隨著濃度逐漸增高,就相繼出現(xiàn)制菌 和殺菌作用,因而形成一個(gè)連續(xù)的作用譜。 表面消毒劑是指對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性,不能 用作活細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑。 2021/3/2715 為比較各種表面消毒劑的相對(duì)殺菌強(qiáng)度,常采 用在臨床上最早使用的消毒劑石炭酸作為 比較的標(biāo)準(zhǔn),并提出了石炭酸系數(shù)這一指標(biāo)。 所謂石炭酸系數(shù),指在一定時(shí)間內(nèi)被試藥劑能 殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石 炭酸的最高稀釋度的比率。一般規(guī)定處理時(shí)間 為10分鐘,而供試菌定為Salmonellatyphi（傷寒 沙門氏菌）。 2021/3/2716 消消 毒毒 試試 驗(yàn)驗(yàn) 以人工染菌實(shí)物為消毒對(duì)象,模擬現(xiàn)場(chǎng)表面

6、污染大腸桿菌液。 消毒前采樣:放置無菌規(guī)格板,取無菌棉拭于 含5ml稀釋液試管中沾濕, 在規(guī)格板空心處旋轉(zhuǎn) 自左至右涂抹整個(gè)區(qū)域 消毒后采樣:在前采樣地點(diǎn)旁用0.05過氧乙 酸溶液消毒物體表面,30分鐘后將無菌棉 拭于 含5ml采樣液試管中沾濕,作為消毒后樣液。 將 消 毒 前 后 樣 液 充 分 振 蕩 搖 勻 后 稀 釋 培養(yǎng)待凝固后37培養(yǎng)2448小時(shí),作菌落計(jì) 數(shù)。 2021/3/2717 滅菌效果監(jiān)測(cè)滅菌效果監(jiān)測(cè) 、高壓蒸氣滅菌效果監(jiān)測(cè) (1) 高壓蒸氣滅菌指示卡:將卡片放入滅菌器 不同部位,觀察滅菌后指示卡顏色變化。 (2)芽胞菌片法:將每片染有嗜熱脂肪桿菌芽胞 105cfu/ml

7、的菌片包好、放入滅菌器內(nèi)。滅菌后 作細(xì)菌計(jì)數(shù)測(cè)定。 對(duì)照是不經(jīng)滅菌的菌片,芽 胞完全被殺滅或殺來率達(dá)99.9999為合格。 2021/3/2718 、紫外線消毒效果監(jiān)測(cè) 微型紫外線強(qiáng)度計(jì):使用時(shí)打開儀器開關(guān), 裝入電池,打開電源開關(guān) ,接通電源,將測(cè)定電 壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至電壓一方,此時(shí)指針應(yīng)超過中 線。 測(cè)定時(shí),將測(cè)定電壓轉(zhuǎn)換開關(guān)撥至測(cè)定一方,打 開紫外線燈照射分鐘后,將紫外線燈強(qiáng)度計(jì) 置于紫外線燈下垂直的中央進(jìn)行照射, 直 至儀表指針穩(wěn)定,所示之值即為該紫外線燈的 強(qiáng)度值(uw/cm2) 。 2021/3/2719 (2)紫外線強(qiáng)度與消毒劑量指示卡: 測(cè)定燈管強(qiáng)度時(shí),將卡片置于離紫外燈管 的中

8、央處,將圖案一面朝向燈管,照 射一分鐘（照射時(shí)間要準(zhǔn)確）后,圖案正 中涂層由白色變?yōu)樽霞t色。與周圍相應(yīng) 色塊相比,可測(cè)知所照射的強(qiáng)度。 新燈管以不低于100uw/cm2為合格,舊 燈管低于70uw/cm2應(yīng)更換。 2021/3/2720 第二節(jié)第二節(jié) 空氣的凈化空氣的凈化 2021/3/2721 一、空氣中微生物的分布一、空氣中微生物的分布 空氣中微生物的含量和種類,隨地區(qū),季節(jié)和空 氣中灰塵粒子多少,以及人們的活動(dòng)情況而異。 .北方氣候干燥,寒冷,空氣中的含菌量較多,離 地面越高,含菌量越少;一般每升高10米,空氣 中的含菌量就降低一個(gè)數(shù)量級(jí); 城市的空氣中含菌量較多,農(nóng)村的空氣中含菌 量較

9、少,一般城市空氣中雜菌數(shù)為30008000個(gè) 米3 。 2021/3/2722 空氣中的微生物種類以細(xì)菌和細(xì)菌芽胞較多, 也有酵母,霉菌和病毒。 這些微生物大小不一,一般附著在空氣中的灰 塵上或霧滴上,空氣中微生物的含量一般為 103104個(gè)米3。 灰塵粒子的平均大小約0.6m左右,所以空氣 除菌主要是去除空氣中的微粒(0.6-1m ） 2021/3/2723 二、空氣除菌二、空氣除菌 工業(yè)發(fā)酵對(duì)空氣處理的要求隨發(fā)酵產(chǎn)品和菌種不同 而異。 半固體制曲和酵母生產(chǎn)中無菌要求不十分嚴(yán)格,一般 無需復(fù)雜的空所凈化處理; 密閉的深層通氣發(fā)酵需嚴(yán)格的純凈培養(yǎng),進(jìn)入發(fā)酵罐 前空氣必須進(jìn)行冷卻、脫水、脫油和過

10、濾除菌等處 理。 2021/3/2724 （二）發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度（二）發(fā)酵對(duì)空氣無菌程度 的要求的要求 好氣性發(fā)酵過程中需要大量的無菌空氣,空氣要 作到 絕對(duì)無菌在目前是不可能的,也是不經(jīng)濟(jì)的。 發(fā)酵對(duì)無菌空氣的要求是 :無菌,無灰塵,無雜質(zhì), 無水,無油,正壓等幾項(xiàng)指標(biāo); 發(fā)酵對(duì)無菌空氣的無菌程度要求是:只要在發(fā)酵 過程中不因無菌空氣染菌,而造成損失即可。 在工程設(shè)計(jì)中一般要求1000次使用周期中只允許 有一個(gè)菌通過,即經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為 N=10-3 2021/3/2725 二、空氣除菌的方法二、空氣除菌的方法 （一）（一） 輻射殺菌輻射殺菌 （二）（二） 熱殺菌熱殺菌 （三）（三

11、） 靜電除菌靜電除菌 （四）（四） 過濾除菌過濾除菌 2021/3/2726 一輻射滅菌法一輻射滅菌法 最常用的是用紫外光線進(jìn)行無菌室滅菌。無菌室 常用的紫外燈功率為30W,安裝在操作臺(tái)上方一 米左右高處,每次照射15-30min既可。 紫外線有很強(qiáng)的殺菌力,但穿透力很弱,一張薄紙 即可完全擋住紫外線,因此待滅菌物品必須置于 紫外光直接照射下,而且在一定范圍內(nèi)作用強(qiáng)度 與距離平方成反比。 2021/3/2727 此外,紫外線對(duì)人體組織有一定刺激作用,眼睛、 皮膚受照射后會(huì)產(chǎn)生某些癥狀,所以工作人員在 無菌室操作時(shí)應(yīng)關(guān)閉紫外燈 2021/3/2728 二、熱滅菌二、熱滅菌 原理:基于加熱后微生物

12、體內(nèi)的蛋白（酶）熱 變性而得以實(shí)現(xiàn)。 熱空氣進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)之前,一般均需用壓縮機(jī) 壓縮,提高壓力。 空氣壓縮后溫度能達(dá)到200度以上,保持一定時(shí) 間后,便可實(shí)行干熱殺菌。 2021/3/2729 利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱量進(jìn)行滅菌的原理 對(duì)制備大量無菌空氣有特別意義。 實(shí)際應(yīng)用中需考慮培養(yǎng)裝置與空氣壓縮機(jī)的相 對(duì)位置,連接壓縮機(jī)與培養(yǎng)裝置的管道的滅菌 以及管道長度等。 2021/3/2730 三、靜電除菌三、靜電除菌 靜電除塵器可除去空氣中的水霧、油霧、塵埃, 同時(shí)也除去微生物。 原理:利用靜電引力來吸附帶電粒子而達(dá)到除塵 滅菌目的。 對(duì)于一些直徑小的微粒,所帶電荷小,不能被吸 附而沉降。 電

13、除 塵 電 源 2021/3/2731 四、介質(zhì)過濾除菌四、介質(zhì)過濾除菌 介質(zhì)過濾除菌是使空氣通過經(jīng)高溫滅菌的介質(zhì) 過濾層,將空氣中的微生物等顆粒阻截在介質(zhì) 層中,而達(dá)到除菌的目的。 從可靠性,經(jīng)濟(jì)適用與便于控制等方面考慮,目 前仍以介質(zhì)過濾法較好,也是大多數(shù)發(fā)酵廠廣 泛采用的方法。 2021/3/2732 發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大發(fā)酵生產(chǎn)中制備無菌空氣的大 致過程致過程 2021/3/2733 要制備較高無菌程度,具有一定壓力的無菌空氣,它 的流程設(shè)備有空氣壓縮機(jī)。 附屬設(shè)備要求盡量采用新技術(shù),提高效率,減少設(shè)備, 精簡(jiǎn)設(shè)備投資、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用和動(dòng)力消耗,簡(jiǎn)便操作。 流程的制訂就根據(jù)所在的地理、

14、氣候環(huán)境和設(shè)備條 件而考慮。 2021/3/2734 在環(huán)境污染比較嚴(yán)重的地方,要考慮改變吸風(fēng) 的條件,以降低過濾器的負(fù)荷,提高空氣的無菌 程度; 在溫暖潮濕的南方,要加強(qiáng)除水設(shè)施,以確保和 發(fā)揮過濾器的最大除菌效率; 在壓縮機(jī)耗油嚴(yán)重的設(shè)備流程中則要加強(qiáng)消除 油霧的污染等等。 2021/3/2735 要保持過濾器有比較高的過濾效率,應(yīng)維持一 定的氣流速度和不受油、水的干擾。 氣流速度可由操作來控制; 要保持不受油、水干擾則要有一系列冷卻、分 離、加熱的設(shè)備來保證空氣的相對(duì)濕度在 50%60%的條件下過濾。 2021/3/2736 高空取氣管是遠(yuǎn)離地面幾十米 的管子。一般而言,地面附近空 氣中

15、所含的微生物和灰塵等均 比高空空氣中含的多,據(jù)資料介 紹,每升高10米,空氣中雜菌可 降低一個(gè)數(shù)量級(jí),因此從高空取 氣要比從低空取氣有利得多。 2021/3/2737 油水分離器油水分離器 其內(nèi)部同時(shí)采用直接攔截, 慣性碰撞,布朗擴(kuò)散及凝聚 等機(jī)理,能有效地去除空氣 中的水、油霧、塵埃,內(nèi)部 不銹鋼絲網(wǎng)可清洗,使用壽 命長。 2021/3/2738 兩級(jí)分離、冷卻、加熱的空氣 除菌流程 粗過濾器粗過濾器壓縮機(jī)壓縮機(jī) 貯罐貯罐 冷卻器冷卻器 絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器 過濾器過濾器 2021/3/2739 高效前置過濾器高效前置過濾器壓縮機(jī)壓縮機(jī)貯罐貯罐 冷卻器冷卻器 絲網(wǎng)分離器絲網(wǎng)分離器加熱器加熱器

16、 過濾器過濾器 2021/3/2740 空氣凈化的流程空氣凈化的流程 吸氣口吸入的空氣先經(jīng)過壓縮前的過濾 進(jìn)入空氣壓縮機(jī)（120-150度） 冷卻（20-25度）,除去油、水,再加熱至30-35 度。 最后通過總過濾器和分過濾器除菌,獲得潔凈 度、壓力、溫度和流量都符合要求的無菌空氣。 2021/3/2741 概述: 目前發(fā)酵工廠采用的空氣過濾設(shè)備大多數(shù)是傳 統(tǒng)的深層過濾設(shè)備,濾層厚度一般為12米,所 用的過濾介質(zhì)一般是棉花、活性炭,也有采用 玻璃纖維、焦炭等。 對(duì)不同的材料,材料的不同規(guī)格,材料的填充情 況不同,都會(huì)得到不同的過濾效果。為了制取 適合要求的無菌空氣,就得深入研究深層過濾 的各

17、種關(guān)系。 2021/3/2742 深層過濾所用的過濾介質(zhì)棉花的纖維直徑一 般為1620微米。 充填系數(shù)為8%時(shí),棉花纖維所形成網(wǎng)格的孔隙 為2050微米,微粒大小為(0.5-2微米)。 微粒隨氣流通過濾層時(shí),濾層纖維所形成的網(wǎng) 格阻礙氣流前進(jìn),使氣流出現(xiàn)無數(shù)次改變運(yùn)動(dòng) 速度和運(yùn)動(dòng)方向,繞過纖維前進(jìn); 這些改變引起微粒以對(duì)濾層纖維產(chǎn)生慣性沖擊、 阻攔、重力沉降、布朗擴(kuò)散、靜電吸引等作用 而把微粒滯留在纖維表面上。 2021/3/2743 空氣過濾除菌空氣過濾除菌介質(zhì)介質(zhì) 、棉花:纖維細(xì)長,16-20um,填充150-200kg/立方米 、玻璃纖維:直徑8-19um,直徑越小越好,但小易斷, 缺點(diǎn)

18、:更換時(shí)碎末飛揚(yáng),過敏 、活性炭 :大表面,物理吸附,空氣阻力小,常夾帶 在二層棉花中降低阻力,為整個(gè)過濾器的1/3-1/2 、超細(xì)玻璃纖維紙:以攔截為主,直徑1-1.5um,有較 高過濾效率。缺點(diǎn)為強(qiáng)度差,受溫后纖維松散。只用 于分過濾器。可加入木漿纖維或其他纖維或采用樹脂 并加疏松劑。 2021/3/2744 、石棉濾板:藍(lán)石棉20加80紙將混合打 漿。溫強(qiáng)度大,過濾效率低,耐蒸氣反復(fù)殺菌。 、燒結(jié)材料過濾介質(zhì):聚乙烯醇過濾板。 、新型過濾介質(zhì) :微孔濾膜 2021/3/2745 提高過濾除菌效率的措施提高過濾除菌效率的措施 鑒于目前所采用的過濾介質(zhì)均需要干燥條件下 才能進(jìn)行除菌,因此需要圍繞介質(zhì)來提高除菌效 率。 2021/3/2746 （1）設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理設(shè)備,選擇合適的空 氣凈化流程,以達(dá)到除油、水和雜質(zhì)的目的。 （2）設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器,選用除菌效 率高的過濾介質(zhì)。 （3）保證進(jìn)口空氣清潔度,如加強(qiáng)生產(chǎn)場(chǎng)地衛(wèi)生 管理,正確選擇進(jìn)風(fēng)口,加強(qiáng)空氣壓縮前的預(yù)處理。 （4）降低進(jìn)入空氣過濾器的空氣相對(duì)濕度,如使 用無油潤滑的空氣壓縮