心肌細(xì)胞在高的壓下的基因表現(xiàn)心臟纖維母細(xì)胞在缺氧下的基因表現(xiàn)形式

1、臺(tái)北市立第一女子高級(jí)中學(xué)校內(nèi)科展作品說(shuō)明書(shū)簡(jiǎn)介科 別： 生物編號(hào) ：B06作品名稱：心肌細(xì)胞在高壓下的基因表現(xiàn)班 級(jí)：二年溫班指導(dǎo)老師：陳怡旴 老師 、陳錦澤 教授 作 者：蔡迪姍、吳嘉蕓一、研究動(dòng)機(jī)：高血壓所誘發(fā)的機(jī)械性展延是造成心肌肥大的基本因子。目前雖 已知機(jī)械性展延與心肌肥大之間的關(guān)聯(lián)性，但確實(shí)知分子機(jī)制則尚未 完全明朗。傳統(tǒng)上研究缺氧（ Hypoxia）之基因表現(xiàn)層次大多侷限於單 一基因或少量基因，並無(wú)大量相關(guān)基因表現(xiàn)之研究。因此本實(shí)驗(yàn)主要 應(yīng)用近幾年才發(fā)展出來(lái)的微陣列基因分析技術(shù)來(lái)探討心肌細(xì)胞在展 延造成之高壓環(huán)境下其基因表現(xiàn)型式和相對(duì)量的分子關(guān)係。二、研究目的：利用活體外心肌細(xì)胞

2、培養(yǎng)系統(tǒng)，經(jīng)機(jī)械性展延的處理後，進(jìn)而抽 取和純化 RNA 並進(jìn)行微陣列基因分析技術(shù)，以提供高壓時(shí)心肌細(xì)胞 之基因表現(xiàn)的不同型式和相對(duì)量的重要訊息。三、實(shí)驗(yàn)器材：新生鼠數(shù)隻、 CO2 Incubactor、Flexercell strain units、 Microarray四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 將新生鼠的心肌細(xì)胞培養(yǎng)在可伸縮的矽膠膜培養(yǎng)皿上，利用 flexercell strain units 施以 20%的展延力，以模擬心肌細(xì)胞在高血壓時(shí) 的搏動(dòng)。然後抽取 total RNA ，並純化得 mRNA，經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄作用得 到 cDNA，再經(jīng)過(guò) PCR後製成 cDNA probe，點(diǎn)在晶片上，與已知 DN

3、A 的片段進(jìn)行雜漬反應(yīng)。再經(jīng)電腦掃描分析得到數(shù)據(jù)化的結(jié)果，了解基 因表現(xiàn)量之增減。五、實(shí)驗(yàn)方法：一、心肌細(xì)胞之細(xì)胞培養(yǎng) ：包括初代心肌細(xì)胞之培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。1. 從 CO2 Incubator 取出 primary cell 的培養(yǎng)皿(直徑 810cm)。2. 用 pipette抽掉舊 medium，以 35c.c的. PBS 清洗 23 次。3. 加入 11.5ml Trypsin + EDTA，搖晃，使細(xì)胞 detach。因?yàn)?Trypsin 可切斷細(xì)胞附著在 plate的 protein；而 EDTA 可拿走 2+ 2+Ca 、 Mg 等可促使細(xì)胞附著於 plate上的物質(zhì)。4. 放入

4、CO2 Incubator 35分鐘，以加速作用。取出後，輕拍。5. 加入 5c.c.的新 medium，搖均勻後和細(xì)胞一起吸到 tube中。6. 再加入 5c.c.的 medium 反覆吸抽使細(xì)胞完全吸至 tube中。7. 搖均勻後放入離心機(jī)， 1200 rpm, 6 min, 468. 取出 tube，吸掉上清液9. pipetting : 加 5c.c. medium到 tube中，用 pipette反覆抽吸約 20 下10. count cell numbera. 取一滴 (50 L)等量 Trypan Blue Stain 0.4%混和均勻，滴在血球計(jì) 算盤上b. 蓋上蓋玻片後，在

5、A、B 處滴上已染色的 cell solution，放在顯微 鏡下數(shù)c. 可算 9 大格中細(xì)胞，再除以 9，或算其中 1 大格1 大格數(shù) * 104 * 2 * 10c.c. = total cell number11. 各取 8c.c.的 medium 分至 5 培養(yǎng)皿中再將 2 c.c.的細(xì)胞分至新的 5 個(gè)培養(yǎng)皿，搖勻後，靜置一段時(shí)間。12. 放入 CO2 Incubator二、RNA分離，純化和鑑定：採(cǎi)用 Guanidine isothiocyanat之e 方 法分離出 total RNA，然後經(jīng)由吸光值和電泳分析以確定其濃度和純 度，最後純化出 mRNA。RNA 的分離1、將 pla

6、te自 CO2 Incubactor中拿出，以 PBS清洗 12 次。2、加入 35ml 的 GIT，再放至 shaker上搖晃數(shù)分鐘。GIT 的作用： a.溶掉細(xì)胞膜，使 RNA 跑出來(lái)。b.抑制 RNase，防止 RNase吃掉 RNA。3、用刮棒從 plate上刮下，吸至 tube中，加 GIT 至 5ml。4、加入等量（5ml）的 pheno（l 酚）及 1.5ml 的 chloroform至 tube。5、用 shaker搖勻。6、以 2000rpm，4離心 20 分鐘，分離出上下兩層（上面：水層 RNA；下面：有機(jī)層） ，中間有一類似薄膜物（ protein）。7、將上清液吸到新的

7、 tube，但不可吸到中間的 protein 和下層的 有機(jī)層。8、在放置上清液的 tube中加入半量的冷凍（ -70）無(wú)水（ 99.5 ）酒精，讓 RNA 沉澱。9、放至-70的冰箱中凍 2 小時(shí)。10、拿出後直接以 2000rpm離心 20 分鐘，得上清液和質(zhì)塊沉澱物 （RNA pellet）。11、去掉上清液，再離心（用真空離心機(jī)）使溶液乾掉。12、加入 DEPC，溶解 RNA。13、用光電比色機(jī)測(cè) OD（吸光度），OD260OD280越接近 2，表示 所萃取的 total RNA 越純。14、亦可去跑電泳，若跑不出來(lái)，則表示 RNA 被 RNase吃掉了， 而接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)也不用做了。M

8、ake Gel （ solution）H2OAgarose10*MOPS14.42 ml0.24 g2 mlFormadahyde3.58 mlTotal20 mlStep1. 調(diào)配 10*MOPS 和 Formadahyd，e 混和在一起 （用量筒 ），放置一旁2. 用燒瓶， 3 次水和 Agarose 混和在一起3. 放入微波爐加熱 1.52 min （因不同劑量有所不同 ）4. 用水降溫至約 5060（以免塑膠融化 ）5. 加入 10*MOPS和 Formadahyde混 和液，混和後快速到入模中6. 用針頭戳泡泡 （小泡可以引到邊邊 ）7. 水平置於室溫約 30 min，OKRNA 的

9、純化1、用微量吸管吸取適量的 total RNA（不超過(guò) 1mg）移入無(wú) Rnase 的微量離心管中。2、加入 DEPC處理過(guò)的水，再加入 Buffer OBB和 Oligotex Suspensio，n 然後反覆抽吸使其均勻。3、將此微量離心管置入 70水浴中使作用 3 分鐘（為了將 RNA 之二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞）。4、取出後置於室溫中作用 10 分鐘。5、移入微量離心機(jī)中，以 14000rpm離心兩分鐘，使 Oligotex： mRNA複合物沉澱下來(lái)。6、再加入 Buffer OW2與 Oligotex：mRNA 複合物混合均勻，然後 移入含 Spin column（離心管柱） 的微量離心管內(nèi)，

10、以 14000rpm離心一 分鐘。7、取出 Spin column置於另一新的微量離心管中，加入 Buffer OW2，14000rpm離心一分鐘，流出液不要。8、再將 Spin column置於另一新微量離心管內(nèi)，加入經(jīng) 70處理 的 Buffer OEB 與 Oligotex：mRNA 複合物混合均勻， 14000rpm一分鐘。9、重複 8之步驟， 14000rpm離心 2分鐘。10、將 8和 9之純化液混合，即可獲得 mRNA。三、mRNA 的反轉(zhuǎn)錄作用mRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄作用形成 cDNA，其反應(yīng) mRNA，DTT，Ige pa，l Primer，dNTP 和 200U Supersc

11、rip II reverse transcriptas，e 在 440C 下作 用 45分鐘，在加入含 MgCl2，DTT，dGTP，KH2PO4和 10U terminal deoxynucleotide transferase 進(jìn)行 tailing 反應(yīng)，行成完全的單股 cDNA。四、聚合酵素鏈鎖反應(yīng)單股 cDNA 再以 PCR 進(jìn)行複製，反應(yīng)總體積含 cDNA ， formamide，Primer， dNTP 和 4.5U DNA polymerase。 PCR的原理能使 DNA 在微量試管中擴(kuò)增至 106 倍以上。 首先，在要擴(kuò)增的 DNA 片段兩端分別設(shè)置一個(gè)前置引子 (forwar

12、d primer) 和反置引子 (reverse primer)使之與已變性的單股目標(biāo) DNA 作緩 冷配對(duì) (annealing)後，利用 DNA 聚合酵素 (DNA polymerase)以目標(biāo) DNA 的兩股分別作為模板，來(lái)合成新的 DNA 股。經(jīng)由(1) 變性反應(yīng) (denaturation)使 DNA 的兩股分離。(2) 緩冷配對(duì)反應(yīng) (annealing)使引子與目標(biāo) DNA 配對(duì)。(3) 延伸反應(yīng) (extension)合成新的 DNA 股。 註：反應(yīng)條件為 94C,15sec.和 650C,30sec.和 680C,120sec共. 30 個(gè) 循環(huán)。再進(jìn)行 680C,420se

13、c.的延伸反應(yīng)。這樣循環(huán)操作每次可使 DNA 的量增加一倍，若重複操作多次，以理 想的數(shù)學(xué)式子計(jì)算，重複操作 PCR 30cycles，DNA 的分子數(shù)將會(huì)擴(kuò)增 到 230 左右。擴(kuò)充的大量 DNA 分子就可提供 Microarray 的實(shí)驗(yàn)使用 。五、微陣列基因分析技術(shù)： mRNA 經(jīng)由反轉(zhuǎn)錄酶作用成 cDNA probe，再以附著多種基因之晶片膜進(jìn)行雜漬反應(yīng)，經(jīng)由電腦軟體分析 獲得結(jié)果。1. 基因來(lái)源：（1）藉由基因庫(kù)得到所需要的基因PCRGene Library cDNA（2）直 接合成 oligonucleotide直接在晶片上合成寡核甘酸，或依傳統(tǒng)的方法合成寡核甘酸後 再將基因點(diǎn)上，

14、可檢測(cè)基因的突變和多型性。2. Microarray 的步驟：（1）從細(xì)胞中分離所需的 RNA 。（2）將上方 1之基因來(lái)源的 DNA 經(jīng)由 arrayer（註）機(jī)械手臂點(diǎn)在 尼龍膜 Nylon 或 Nitrocellulose membrdue 醋酸纖維膜上。（3）將抽取的 RNA 弄成 Probe（探針 ），與點(diǎn)上的基因片段進(jìn)行雜漬 反應(yīng)（Hybridization）（ 註）。（4）已 呈色之 cDNA array 經(jīng)由 Laser scanner掃描獲得影像 （image）。（5）影像再經(jīng)由電腦 Data processing 比對(duì)分析獲得結(jié)果。 註： arrayer 唯一種機(jī)械手臂，探

15、針頭與原子筆頭相似。經(jīng) 由電腦的控制，每一次可以在膜上點(diǎn)出一段基因。#若以 cm2 面積大小的模來(lái)作分析：在 arrayer 的控制下 ，若每一個(gè)點(diǎn)面積占 0.1mm2 ，而它與其另一側(cè)的 點(diǎn)相隔個(gè) 0.1mm（也就是說(shuō)每個(gè)單位記成 0.3mm）。則在這一個(gè)晶片 上，我們大約可以點(diǎn) 900 多個(gè)樣本。 註： cDNA 標(biāo)識(shí)成探針再和 cDNA array 進(jìn)行雜漬反應(yīng)： 取已複製過(guò)的 cDNA 與 digoxigenin-11-dUTP （Roche） 進(jìn)行標(biāo)示反應(yīng)，將以標(biāo)示好之探針經(jīng)過(guò)單股化的作用後 ，加入雜漬反應(yīng)液 ，再與 cDNA assay 進(jìn)行雜漬反應(yīng)作用。完成後取出已雜自之 cDN

16、A assay 使用 saline-sodium citrate /0.1%SDS清洗兩次 ，再利用 digoxigenin detection system(Roche) 進(jìn)行呈色反應(yīng)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Putative Gene NameAccession numberRatio of s/cNitric oxide synthaseH678431.70UPAR7419472.00P19 (cyclin-dependent kinase inhibito 2D)R7751738.00Transcription factor AP-2 alphaH018181.68Ciliary neurotr

17、ophic factor receptorR730509.00Purine-rich element binding protein AH4642528.00Transcriptional activator SNF2aH459777.67Transducer of ERBB2H2985720.00Chemokine (C-C motif) receptor2H5825431.50Prefoldin 4W0450732.00Neural-cadherin precursorT775010.20Insulin receptor precursorH039170.02PKD2R482310.04T

18、umor necrosis factor, alpha-induced protein 6R735320.03Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 5H185270.08Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10H445680.04mutL homolog 1H308570.06GlutaredoxinR921980.04七、討論： 何以得知基因表現(xiàn)的差異是因?yàn)槿毖醯臓顟B(tài)所造成，而不是因?yàn)?細(xì)胞的個(gè)體差

19、異或其他影響因素？首先當(dāng)然要盡量 減少不必要的變因 ，所以同一次實(shí)驗(yàn)是由同一隻 老鼠身上取得心臟纖維母細(xì)胞。其次，欲確定基因表現(xiàn)真的為缺氧所 造成，可看兩個(gè)方面： 時(shí)間效應(yīng)與劑量效應(yīng)a. 時(shí)間效應(yīng)： 可對(duì)處?kù)锻瑯尤毖鯒l件下的細(xì)胞，進(jìn)行缺氧時(shí)間長(zhǎng) 短的控制，如我們的實(shí)驗(yàn)中，便有 1 小時(shí)、3 小時(shí)、12小時(shí)、 24小時(shí)、 48小時(shí)不等的缺氧時(shí)間。b. 劑量效應(yīng)： 要造成缺氧條件所用的儀器多灌入 N2 的 Incubacto，r 可藉由調(diào)整灌入 N2 的量，造成不同的缺氧程度，如：正常 應(yīng)有 20的 O2，在 N2 的 Incubactor中，可能只有 3、5、10， 即可對(duì)細(xì)胞造成不同的缺氧狀態(tài)。而上述兩方面，皆有其 正相關(guān)和負(fù)相關(guān) ，即時(shí)間或劑量的增加或 減少，會(huì)造成基因表現(xiàn)隨之增加或減少。故若實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有時(shí)間 效應(yīng)或劑量效應(yīng)，則可確定基因表現(xiàn)量之改變確為缺氧狀態(tài)所造成。八、結(jié)論：分析出心肌細(xì)胞在缺氧時(shí)，其基因表現(xiàn)量的增減。九、參考資料及其他：. Reactive oxygen species modulate endothelin-I-induced c-fos gene expression in cardiomyocytes . T.H. Cheng ,