代謝調(diào)節(jié)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的影響及其機(jī)制研究

1、代謝調(diào)節(jié)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的影響及其機(jī)制研究 研究背景以運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練為主的心臟康復(fù)治療是改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟 病冠心病患者預(yù)后的有效手段。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增強(qiáng)冠心病患者運(yùn)動(dòng)耐量 , 降低 心血管死亡率與住院率 , 顯著提高生活質(zhì)量。冠心病患者控制心絞痛病癥后需要及早進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 , 并在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 同時(shí)接受標(biāo)準(zhǔn)、有效的藥物治療。 以他汀類藥物為代表的調(diào)脂治療是冠心病一級(jí) 與二級(jí)預(yù)防的基石。然而, 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練同時(shí)服用他汀類藥物抵消了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)運(yùn)動(dòng)耐量的獲益作用。 他汀類藥物的骨骼肌不良反響導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)耐量下降。他汀類藥物引起的骨骼肌不良反響可以表現(xiàn)為肌肉酸痛、疲勞或痙攣 ,38% 他汀類藥物

2、相關(guān)肌痛患者不能承受在中度以下日?；顒?dòng)。流行病學(xué)研究顯示 , 他 汀類藥物骨骼肌不良反響發(fā)生率高達(dá) 7%- 29%他汀類藥物的不良反響是患者停藥的主要原因 , 但是停用他汀類藥物導(dǎo)致冠 心病患者死亡率升高。因此需要探究他汀類藥物導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力降低的機(jī)制 , 并尋 找有效的解決方法。線粒體功能障礙是他汀類藥物相關(guān)骨骼肌損傷的主要機(jī)制。 體外研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能夠結(jié)合于線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體川的Q0的位點(diǎn)，阻斷線粒體電子傳遞鏈,進(jìn)而導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少且骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激加重。能量供給減少與氧化應(yīng)激最終導(dǎo)致骨骼肌纖維萎縮 , 骨骼肌功能明顯受損。 因此, 改善骨骼肌線粒體功能是降低他汀相關(guān)骨骼肌損傷的

3、關(guān)鍵。曲美他嗪能夠調(diào)節(jié)線粒體功能 ,并增強(qiáng)骨骼肌的運(yùn)動(dòng)能力。 研究顯示,曲美他 嗪能抑制棕櫚酸造成的線粒體分裂并改善線粒體功能。心衰模型中曲美他嗪通過(guò)增強(qiáng)線粒體復(fù)合體活性與抑制線粒體電子漏保護(hù) 心肌細(xì)胞。曲美他嗪對(duì)骨骼肌也有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)曲美他嗪能夠抑制饑餓和炎癥因子引起的骨骼肌細(xì)胞萎縮和細(xì)胞 骨架紊亂。另外臨床研究顯示 , 在傳統(tǒng)抗心絞痛藥物的根底上 ,早期加用曲美他嗪 , 能夠增強(qiáng)穩(wěn)定性心絞痛患者運(yùn)動(dòng)耐量 , 降低心絞痛發(fā)生頻率。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練聯(lián)合曲美他嗪更顯著提高缺血性心臟病患者運(yùn)動(dòng)耐量。 但曲美他嗪 是否改善他汀類藥物相關(guān)的運(yùn)動(dòng)能力下降尚無(wú)研究報(bào)道。為此,本研究以高脂喂養(yǎng)的 ApoE-/

4、- 小鼠為研究對(duì)象 , 建立他汀類藥物相關(guān) 骨骼肌損傷動(dòng)物模型 , 探討曲美他嗪是否通過(guò)調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝改善他汀類藥 物相關(guān)運(yùn)動(dòng)能力下降。 研究目的 1.探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中 , 曲美他嗪能否降低他汀類藥 物所致骨骼肌損傷 , 增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力 ;2. 明確曲美他嗪是否通過(guò)改善線粒體功能與 調(diào)節(jié)能量代謝降低骨骼肌損傷。研究方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組4周齡ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)4周后稱重,隨 機(jī)分為五組 : 對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀組、運(yùn)動(dòng) +曲美他嗪組、運(yùn)動(dòng) +辛伐 他汀 +曲美他嗪組。運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀組、運(yùn)動(dòng) +曲美他嗪組、運(yùn)動(dòng) +辛伐他 汀+曲美他嗪組的小鼠進(jìn)行 8周的跑步訓(xùn)練

5、,每周跑步訓(xùn)練 5天。運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀組小鼠在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的根底上給予 20mg/kg/d 辛伐他汀灌胃。 運(yùn)動(dòng)+曲美他嗪組小鼠在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的根底上給予 30mg/kg/d 曲美他嗪灌胃。運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀 +曲美他嗪組小鼠在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的根底上給予20mg/kg/d 辛伐他汀與 30mg/kg/d 曲美他嗪灌胃。灌胃總時(shí)間為 8 周。2. 運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)z測(cè)各組小鼠運(yùn)動(dòng)能力。單杠實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備45cmx 45cm鐵絲網(wǎng) , 鐵絲粗 2mm 網(wǎng), 格 18mm。鐵絲網(wǎng)懸于軟墊上方50cm小鼠置于鐵絲網(wǎng)中心，經(jīng)頭側(cè)翻轉(zhuǎn)鐵絲網(wǎng)，計(jì)算 小鼠力竭掉落時(shí)間。每只小鼠檢測(cè)3次,計(jì)算平均值，每次試驗(yàn)間隔20min以上。

6、拉力檢測(cè)：訓(xùn)練 小鼠雙上肢拉緊測(cè)力計(jì) , 輕拉小鼠尾使小鼠騰空直至小鼠上肢離開(kāi)測(cè)力計(jì) , 記錄 測(cè)力計(jì)顯示數(shù)值。檢測(cè) 3 次, 計(jì)算平均值。運(yùn)動(dòng)耐力檢測(cè) ： 采用平臺(tái)式跑步機(jī)進(jìn)行耐力檢測(cè)。起始運(yùn)動(dòng)速度 13m/min, 每 3min 速度增加 2m/min, 起始跑道坡度為 0, 每 3min 坡度增加 2直至 14。紀(jì)錄小鼠力竭時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間與運(yùn)動(dòng)距離。3. 血液指標(biāo)檢測(cè)小鼠心尖取血約 1mL,肝素抗凝,2 000rpm4 C離心15min,分 離血漿。拜耳 1650 血生化自動(dòng)檢測(cè)儀檢測(cè)血漿葡萄糖、總膽固醇、低密度脂蛋 白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯與游離脂肪酸水平。采用試劑盒檢測(cè)血漿

7、CK乳酸水平。4.病理學(xué)檢測(cè)對(duì)腓腸肌進(jìn)行 HE染色觀 察骨骼肌形態(tài)改變。Laminin免疫熒光觀察中心核纖維水平。 Slow MyHC與 Fast MyHC免疫熒光 檢測(cè)肌纖維分型。對(duì)腓腸肌進(jìn)行PAS染色觀察骨骼肌糖原含量。Gomori染色檢測(cè)碎裂紅纖維(RRF)水平。5. 骨骼肌線粒體功能檢測(cè)提取骨骼肌線粒體 , 采用試劑盒檢測(cè)線粒體復(fù)合體 川、檸檬酸合酶活性JC-1檢測(cè)線粒體膜電位。6.骨骼肌氧化應(yīng)激水平檢測(cè)提取 骨骼肌線粒體，Amplex Red檢測(cè)線粒體內(nèi)過(guò)氧化氫水平；腓腸肌組織制成勻漿，檢 測(cè) SOD與 GSH/GSS水平。結(jié)果1.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與辛伐他汀對(duì) ApoE-/-小鼠的血脂、CK

8、水平的影響與對(duì)照 組相比,運(yùn)動(dòng)組ApoE-/-小鼠血脂、CK水平無(wú)顯著變化；與運(yùn)動(dòng)組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐 他汀組 ApoE-/- 小鼠血漿脂質(zhì)水平顯著降低 ; 與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/-小鼠血漿CK水平顯著升高。說(shuō)明辛伐他汀能夠降低運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/-小 鼠的血脂水平，升高血漿CK水平,即辛伐他汀能夠?qū)е鹿趋兰p傷。2.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與辛伐他汀對(duì) ApoE-/-小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響與對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng) 組 ApoE-/- 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng)。與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 APoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能力降低。上述結(jié)果說(shuō)明辛伐他汀能夠抵消運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì) ApoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能

9、力的增強(qiáng) 作用。 3. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與辛伐他汀對(duì) ApoE-/- 小鼠骨骼肌纖維的影響與對(duì)照組相比 , 運(yùn)動(dòng)組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纖維橫截面積增加 ； 與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠肌纖維橫截面積降低。中心核纖維是骨骼肌纖維損傷后修復(fù)的表現(xiàn) , 與對(duì)照組相比 , 運(yùn)動(dòng)組ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纖維無(wú)顯著變化 ； 與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纖維增加。說(shuō)明辛伐他汀能夠?qū)е鹿趋兰±w維萎縮與 損傷。4. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與辛伐他汀對(duì)骨骼肌纖維分型的影響與對(duì)照組 ApoE-/- 小鼠相 比,運(yùn)動(dòng)組ApoE-/-小鼠慢型肌纖維比例顯著

10、增加。與運(yùn)動(dòng)組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他 汀組 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維減少。另外與運(yùn)動(dòng)組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維與快型肌纖 維橫截面積顯著降低。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠增加慢型肌纖維含量 ,辛伐他汀降低運(yùn) 動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維含量 , 并導(dǎo)致快型與慢型肌纖維萎縮。5. 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與辛伐他汀對(duì) ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代謝的影響與對(duì)照組相 比,運(yùn)動(dòng)組ApoE-/-小鼠骨骼肌糖原含量降低,與運(yùn)動(dòng)組相比，運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌糖原含量增加。另外與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠血漿乳酸含量增加 , 說(shuō)明辛伐他汀

11、抑制運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌有氧代謝。與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)組ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF無(wú)顯著變化；與運(yùn)動(dòng)組相比， 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF顯著增加,提示辛伐他汀導(dǎo)致線粒體功 能障礙。6.曲美他嗪與辛伐他汀對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/-小鼠血脂、CK水平的影響與 運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+曲美他嗪組 ApoE-/- 小鼠血漿葡萄糖與脂質(zhì)水平無(wú)顯著變化。與運(yùn)動(dòng)+曲美他嗪組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組 ApoE-/- 小鼠血脂水 平顯著降低。辛伐他汀導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練ApoE-/-血漿CK水平升高；與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗦組CK水平降低。上述結(jié)果

12、說(shuō)明曲美他嗪不降低小鼠血脂水平 , 也不影響辛伐他汀的降脂作用 但是曲美他嗪能夠顯著降低血漿 CK水平，即曲美他嗪能夠降低辛伐他汀導(dǎo)致的 骨骼肌損傷。 7. 曲美他嗪與辛伐他汀對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能力的影響與 運(yùn)動(dòng)組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組ApoE-/ 小鼠運(yùn)動(dòng)能力顯著降低。與運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀組相比 , 運(yùn)動(dòng) +辛伐他汀 +曲美他嗪組 ApoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能 力增強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明 , 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中 , 辛伐他汀能夠降低 ApoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能力 , 而辛伐他汀根底上加用曲美他嗪后 ApoE-/- 小鼠運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng) , 因此運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠的運(yùn)動(dòng)能力得到恢復(fù)。8

13、.曲美他嗪與辛伐他汀對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纖維的影響與運(yùn)動(dòng) 組相比, 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌纖維橫截面積降低 ；與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組小鼠骨骼肌纖維橫截面積顯著增加 ； 說(shuō) 明曲美他嗪可以改善辛伐他汀導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/ 小鼠骨骼肌纖維萎縮的 現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌中心核纖維百分比升高 與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組小鼠骨骼肌中心核纖維百 分比顯著降低 ,說(shuō)明辛伐他汀根底上加用曲美他嗪后運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌纖維損傷減少。9.曲美他嗪與

14、辛伐他汀對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠肌纖維分型的影響與運(yùn)動(dòng) 組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維減少 ;與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相 比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維顯著增加。與運(yùn)動(dòng)組相 比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維與快型肌纖維橫截面積降低 :與運(yùn) 動(dòng)+辛伐他汀組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀 +曲美他嗪組慢型肌纖維與快型肌纖維橫截 面積均顯著增加。上述結(jié)果說(shuō)明辛伐他汀導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠慢型肌纖維含量減少 , 慢 型與快型肌纖維萎縮 ;辛伐他汀加用曲美他嗪后運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠慢行肌纖 維含量增加 ,肌纖維

15、增粗。 10.曲美他嗪與辛伐他汀對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌有氧代謝的影響與運(yùn)動(dòng)組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌糖原含 量增加;與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌糖原含量顯著降低。與運(yùn)動(dòng)組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠血漿乳酸水平增加 ;與運(yùn)動(dòng)+ 辛伐他汀組相比 ,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀 +曲美他嗪組 ApoE-/ 小鼠血漿乳酸水平顯著 降低。另外與運(yùn)動(dòng)組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF增加;與運(yùn) 動(dòng)+辛伐他汀組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組ApoE-/-小鼠骨骼肌RRF顯著降上述結(jié)

16、果說(shuō)明辛伐他汀抑制運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代謝 , 辛伐他 汀根底上加用曲美他嗪后運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌有氧代謝得到恢復(fù)。 11. 曲美他嗪在辛伐他汀所致運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌線粒體功能障礙中的作 用與對(duì)照組相比,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著提高ApoE-/-小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合體川活性； 與運(yùn)動(dòng)組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組ApoE-/-小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合體川活性降低； 與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組ApoE-/-小鼠骨骼肌線粒 體復(fù)合體川活性顯著增高。線粒體復(fù)合體活性是維持線粒體膜電位的重要因素。與對(duì)照組相比 , 運(yùn)動(dòng)組 ApoE-/- 小鼠骨骼

17、肌線粒體膜電位增高 ； 與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/-小鼠骨骼肌線粒體膜電位降低；與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀 組+曲美他嗪組ApoE-/ 小鼠膜電位增高。我們通過(guò)檸檬酸合酶活性檢測(cè)線粒體含量。 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高 ApoE-/- 小鼠骨骼 肌線粒體檸檬酸合酶活性 ；與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組檸檬酸合酶活性降低 ； 與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組檸檬酸合酶活性顯著增高。上述結(jié)果說(shuō)明曲美他嗪能夠抵消辛伐他汀所致骨骼肌線粒體功能障礙。 12. 曲美他嗪對(duì)辛伐他汀所致氧化應(yīng)激的作用與運(yùn)動(dòng)組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組 ApoE-/- 小鼠骨骼肌線

18、粒體過(guò)氧化氫水平升高 ； 與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比 , 運(yùn)動(dòng)+辛 伐他汀+曲美他嗪組ApoE-/-小鼠骨骼肌線粒體過(guò)氧化氫水平降低。與運(yùn)動(dòng)組相比，運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組ApoE-/-小鼠骨骼肌SOD舌性與GSH/GSSG 降低；與運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀組相比,運(yùn)動(dòng)+辛伐他汀+曲美他嗪組ApoE-/-小鼠骨骼肌 SOD舌性增強(qiáng),GSH/GSSGI加。上述結(jié)果說(shuō)明辛伐他汀能夠?qū)е逻\(yùn)動(dòng)訓(xùn)練ApoE-/-小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激 , 加用曲美他嗪后運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激水 平降低,即證實(shí)曲美他嗪能夠改善辛伐他汀導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 ApoE-/- 小鼠骨骼肌 氧化應(yīng)激。結(jié)論 1.曲美他嗪能夠降低辛伐他汀所致

19、 ApoE-/- 小鼠骨骼肌損傷 ,恢復(fù)運(yùn)動(dòng) 訓(xùn)練對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的改善作用 ;2. 曲美他嗪通過(guò)改善線粒體功能實(shí)現(xiàn)骨骼肌保護(hù)作 用。研究背景我國(guó)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病 冠心病 死亡率仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。糖尿病是冠心病的最重要的危險(xiǎn)因素。與單純冠心病相比 , 合并糖尿病的冠 心病患者發(fā)病年齡更早 , 斑塊不穩(wěn)定性增加 , 導(dǎo)致心力衰竭與死亡率顯著增高。而冠心病患者合并糖代謝紊亂的比例高達(dá) 76.9%。因此探討糖尿病狀態(tài)下動(dòng) 脈粥樣硬化加重的機(jī)制是改善冠心病患者預(yù)后的重要途徑。系統(tǒng)性慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化與糖尿病發(fā)病的共同機(jī)制 , 糖尿病相關(guān)系統(tǒng) 性慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化病變加重的主要原因。 脂肪組織是

20、系統(tǒng)性慢性炎癥的 發(fā)源地。除脂肪細(xì)胞外 , 脂肪組織內(nèi)包含幾乎所有種類的免疫細(xì)胞。因此脂肪組織不 僅在胰島素作用下以脂質(zhì)的形式儲(chǔ)存能量 , 同時(shí)在代謝改變時(shí)調(diào)控炎癥反響。體重和代謝正常個(gè)體的脂肪組織內(nèi)炎癥反響趨于抑制狀態(tài) , 然而在大量能量 超載時(shí), 脂肪組織內(nèi)免疫體系激活。胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞與激活的免疫細(xì)胞分 泌大量脂肪因子、炎癥因子以內(nèi)分泌的形式介導(dǎo)其他器官糖代謝紊亂與慢性炎癥。脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)脂肪組織慢性炎癥主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。 巨噬細(xì)胞是脂肪組織內(nèi)數(shù)量最大的免疫細(xì)胞 , 胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪組織內(nèi)巨噬 細(xì)胞數(shù)量可高達(dá)脂肪組織總細(xì)胞量的 50%。脂肪組織慢性炎癥不僅表現(xiàn)為

21、巨噬細(xì)胞增加 , 還表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn) 化。巨噬細(xì)胞可分為M1型經(jīng)典活化和M2型替代活化巨噬細(xì)胞胰島素抵抗的脂肪組織內(nèi)多為 M1型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原遞呈能力，促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，具有促炎活性。巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化后,表達(dá)大量趨化因子與促炎因子，不但加重脂肪組 織慢性炎癥，而且阻斷脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)通路。因此研究巨噬細(xì)胞M1型極化的 機(jī)制將為控制脂肪組織慢性炎癥提供可靠的理論依據(jù)。脂肪細(xì)胞胰島素抵抗是巨噬細(xì)胞 M1型極化的主要原因，脂肪細(xì)胞釋放的 exosomes介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活。Exosomes是細(xì)胞內(nèi)多囊體與質(zhì)膜融合釋放的胞外 囊泡,攜帶大量與其源細(xì)胞功能密切相

22、關(guān)的蛋白質(zhì)和RNA成分,通過(guò)受體一配體結(jié)合或膜融合等方式啟動(dòng)靶細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞 ,調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生物學(xué)功能。Exosomes是脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間往來(lái)信息交流的載體。脂肪細(xì)胞釋放 exosomes招募巨噬細(xì)胞,2型糖尿病小鼠的脂肪組織釋放的 exosomes可以促進(jìn)巨 噬細(xì)胞炎癥活性增強(qiáng)。因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞來(lái)源的 exosomes(ADEs攜帶的信號(hào)分子或者其 激活的信號(hào)通路,抑制巨噬細(xì)胞極化,進(jìn)而減輕系統(tǒng)性慢性炎癥,但是ADEs介導(dǎo) 巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制仍待研究。Sonic Hedgehog(Shh)是exosomes攜帶的重 要分泌型形態(tài)因子。Shh分子通過(guò)C端的膽固醇修飾與N端有棕櫚

23、酸修飾結(jié)合于exosomes磷脂 雙分子膜,exosomes攜帶Shh具有更強(qiáng)的活性和更廣的分泌范圍。Shh在免疫系 統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用，成年個(gè)體內(nèi)Shh調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞增殖分化。巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Shh信號(hào)通路,是Shh的靶細(xì)胞之一。Shh促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎 癥因子表達(dá) , 參與巨噬細(xì)胞激活。研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗上調(diào)Shh表達(dá),因此糖尿病狀態(tài)下Shh可能通過(guò)促進(jìn)巨 噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化介導(dǎo)系統(tǒng)性慢性炎癥。 本研究將建立脂肪細(xì)胞胰島素抵抗 模型,探討ADEs攜帶的Shh對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響,及巨噬細(xì)胞極化在脂肪 細(xì)胞胰島素抵抗中的作用。研究目的 1.建立脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型 , 明確胰島素抵抗脂

24、肪細(xì)胞產(chǎn)生的ADEs對(duì)巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)化的作用;2.探討ADEs攜帶Shh介導(dǎo)的 Ptch/PI3K/Gli信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞極化中的作用；3.探討巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)化后 分泌的exosomes對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的影響。研究方法1.脂肪細(xì)胞胰島素抵 抗模型的建立采用胰島素、 3-異丁基,1- 甲基-黃嘌呤與地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)的方法 將 3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。分化成熟的脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組與胰島素抵抗組。 胰島素抵抗組脂肪細(xì)胞在 分化成熟后參加高糖高胰島素刺激 24h。WesternBlot 檢測(cè) p/t-IRS1 、p/t-Akt 、細(xì)胞膜與細(xì)胞漿 Glut4 水平 ,2N

25、BDG 檢測(cè)葡萄糖攝取，油紅O染色檢測(cè)脂質(zhì)含量。2.脂肪細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)照組與胰 島素抵抗組脂肪細(xì)胞通過(guò) Shh cDNA腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)脂肪細(xì)胞與 ADEs Shh表達(dá)， 胰島素抵抗組脂肪細(xì)胞通過(guò) Shh ShRNA腺病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)脂肪細(xì)胞與 ADEsShhS達(dá), 倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率Western Blot與RT-PCR僉測(cè)Shh表達(dá)水平。3.提取ADEs獲取各組脂肪細(xì)胞上清,超速離心獲取ADEs透射電鏡管觀察ADEs超微結(jié)構(gòu)Western Blot檢測(cè)脂肪細(xì)胞與 ADEs Tsg101、CD63 CD81Calnexin與Grp94表達(dá)水平；動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定 ADEs直徑分布;West

26、ern Blot與流 式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADEs攜帶Shh水平。4.ADEs刺激巨噬細(xì)胞別離培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬 細(xì)胞BMDM與RAW264.巨噬細(xì)胞,饑餓24h后,50卩g/mmLADEs刺激巨噬細(xì)胞24h;為明確Ptch與PI3K是否參與ADEs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,分別在ADEs刺激 前2h參加20卩M Ptch抑制劑環(huán)巴胺，ADEs刺激前1h參加10卩M PI3K抑制劑 LY294002。5. 巨噬細(xì)胞極化檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) M1型巨噬細(xì)胞CD11C+與M2型巨噬細(xì) 胞CD206+所占比例；檢測(cè)巨噬細(xì)胞的粘附功能。6.巨噬細(xì)胞信號(hào)通路檢測(cè)收集 ADEs刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞蛋白。We

27、stern Blot檢測(cè)Ptch與Gli蛋白水平，EMSA檢測(cè)Gli轉(zhuǎn)錄活性。Western Blot檢測(cè)PI3K磷酸化水平。7.脂肪細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)采用transwell小室孔徑0.4卩m,將脂肪細(xì) 胞種于transwell小室上層,將ADEs刺激的RAW264.巨噬細(xì)胞接種于transwell 小室下層,共培養(yǎng)24h。8.巨噬細(xì)胞來(lái)源exosomes刺激脂肪細(xì)胞收集ADEs刺激 RAW 264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清,超速離心收集exosomes,刺激分化成熟的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞。9.脂肪細(xì)胞胰島素抵抗獲取共培養(yǎng)后的脂肪細(xì)胞 ,提取蛋白質(zhì) ,WesternBlot檢測(cè)HSL與IRS

28、-1的蛋白水平。10.檢測(cè)血清e(cuò)xosomes抽取健康志愿者與 2 型糖尿病患者外周靜脈血 , 別離膠促凝固管別離血清 ； 超速離心提取 exosomes, 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)exosomes表型。結(jié)果1.胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的建立高糖高胰島素刺激脂肪細(xì)胞24h后,脂肪細(xì)胞的 IRS-1 Ser307 位點(diǎn)磷酸化水平增高 ,IRS-1 蛋白水平明顯降低 ,Akt 磷酸化水平降低；生理劑量胰島素刺激下GLUT胞膜轉(zhuǎn)位降低,葡萄糖攝取減 少； 脂肪細(xì)胞脂質(zhì)含量增加。上述結(jié)果說(shuō)明我們成功構(gòu)建了脂肪細(xì)胞胰島素抵抗 模型。2.胰島素抵抗脂肪細(xì)胞來(lái)源 ADEs攜帶Shh增加ADEs提取后鑒定電子顯 微鏡觀察

29、ADEs是膜包被的囊泡狀結(jié)構(gòu),直徑在50-100nm之間;ADEs表達(dá)CD63CD81 Tsg101,不攜帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白 Calnexin、Grp94。(2)ADEs攜帶Shh的檢測(cè) 前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞的過(guò)程中穩(wěn)定表達(dá)Shh,ADEs中Shh含量明顯高于超速離心上層液中Shh含量,說(shuō)明脂肪細(xì)胞主要以exosomes的形式分泌Shh。與對(duì)照組脂肪細(xì)胞來(lái)源的 exosomes(CtrlADEs) 相比 , 胰島素抵抗脂肪細(xì)胞來(lái)源的 exosomes(IRADEs攜帶 Shh增加。3.ADES攜帶的 Shh對(duì) BMD與 RAV264.7 巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響與 CtrlADEs相比,IR

30、ADEs促進(jìn)BMD與RAW264.7巨噬 細(xì)胞M1型極化，抑制M2型極化。中和抗體封閉IRADEs攜帶的Shh后,與IRADEs刺激的巨噬細(xì)胞相比,巨噬細(xì) 胞M1型極化顯著降低,M2型極化增加。通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)IRADEs攜帶Shh水 平,IRADEs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型極化降低。與 CtrlADEs 相比, 過(guò)表達(dá) Shh 的 CtrlADEs(AdV-ShhCtrlADEs) 促進(jìn)巨噬 細(xì)胞M1型極化。與IRADEs相比，過(guò)表達(dá)Shh的IRADEs(AdV-Shh IRADEs)進(jìn) 一步促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化。上述結(jié)果說(shuō)明ADEs攜帶的Shh促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化,抑制M2型極化,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞粘附功能。4.Ptch/PI3K/Gli 通路在ADEs攜帶Shh介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1型極化中的作用ADEs攜帶的Shh刺激巨噬細(xì)胞Ptch/Gli表達(dá)上調(diào)與