水稻幾丁質(zhì)酶定向進化

1、i分類號： 067 密級： 公開碩碩 士士 研研 究究 生生 學學 位位 論論 文文論文題目： 水道稻幾丁質(zhì)酶的定向進化 專 業(yè)： 生物化學與分子生物學 研究方向： 植物分子生物學 研 究 生： 袁衛(wèi)生 指導老師： 劉紅全 副教授 論文起止日期 2011 年 5 月至 2013 年 6 月iiiii水稻幾丁質(zhì)酶的定向進化水稻幾丁質(zhì)酶的定向進化研究研究摘摘 要要利用易錯 pcr 和 dna 改組對水稻幾丁質(zhì)酶基因 chab 進行隨機突變。將突變基因產(chǎn)物克隆到分泌型表達載體 pmbp-p，并導入感受態(tài) e.coli top10f構(gòu)建突變體文庫；利用幾丁質(zhì)平板法篩選到了突變體 cha-p。通過正交試

2、驗優(yōu)化得到 cha-p 重組蛋白的最佳表達條件：ph6.5，iptg濃度 0.8mm，33，200rpm，培養(yǎng) 5h；cha-p 胞外酶活力為 80umol/min, 較野生酶活力提高了 2 倍。重組蛋白主要以包涵體形式存在。運用尿素梯度透析復性法對包涵體進行復性，復性后的酶比活力為 0.24u/mg。對突變體進行序列分析發(fā)現(xiàn)：cha-p 的核苷酸序列較野生幾丁質(zhì)酶核苷酸序列發(fā)生了 318 位 ct，368 位 ag，374 位 ag 三個堿基的改變，相應的氨基酸序列發(fā)生了天冬氨酸甘氨酸（123 位 dg） ，酪氨酸半胱氨酸（125 位 yc）的改變。在突變序列中也發(fā)生了一段 (4 位-129

3、 位) 堿基缺失和插入 (736 位-768 位)，插入使得終止密碼子提前出現(xiàn)，造成蛋白質(zhì)翻譯的提前終止。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶 易錯 pcr dna 改組 定向進化 酶活 ivdirected evolution of rice chitinase abstractrandom mutagenesis on rice chitinase gene chab was conducted by using error-prone pcr and dan-shuffing strategythe mutation product was recombinated in expression ve

4、ctor pmbp-p, and transformed into e.coli top10f to construct the mutant library. the mutant strain cha-p was selected using the method of chitin plate. the optimal expression conditions of the mutant cha-p recombinant protein were obtained by orthogonal test which involve: 0.8mm iptg induction, the

5、ph of the medium is 6.5, oscillate fermenting 5h with 200rpm and 33. cha-p extracellular enzyme activity is 80umol/min, which increased twice times compared with that of the wild-type enzyme. the recombinant proteins mainly existed in inclusion bodies. the inclusion bodies were refolded by urea grad

6、ient dialysis refolding method. the enzymatic activity of the renatured recombinant proteins is 0.24u/mg. sequence analysis of the mutant cha-p showed that three nucleotides substitution 318c/t，368a/g and 374a/g occurred，and caused two amino acids mutation of 123d/g and 125y/c. furthermore, the muta

7、tion includes the absence of 126 bases (4 to 129) and 2 bases insertion (736 to 738), which makes the termination codon appeared in advance, and causing premature termination of the protein translation. keywords: chitinase; error-prone pcr; dna shuffling; directed evolution; enzymatic activity目目 錄錄1

8、 1 前言前言 .1 11.11.1 植物幾丁質(zhì)酶特性植物幾丁質(zhì)酶特性 .1 1v1.21.2 植物幾丁質(zhì)酶的分類植物幾丁質(zhì)酶的分類 .2 21.31.3 植物幾丁質(zhì)酶基因研究進展植物幾丁質(zhì)酶基因研究進展 .2 21.3.11.3.1 幾丁質(zhì)酶新發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶新發(fā)現(xiàn) .2 21.3.21.3.2 幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)酶 n-n-端研究端研究 .3 31.3.31.3.3 幾丁酶農(nóng)業(yè)上應用幾丁酶農(nóng)業(yè)上應用.4 41.41.4 問題與展望問題與展望.4 42 2 定向進化定向進化 .6 62.12.1 易錯易錯 pcrpcr.7 72.22.2 dnadna 改組改組.7 72.32.3 篩選方法篩選方法

9、 .8 82.42.4 定向進化的應用定向進化的應用 .9 92.4.12.4.1 工業(yè)領(lǐng)域研究工業(yè)領(lǐng)域研究 .9 92.4.22.4.2 藥用蛋白領(lǐng)域研究藥用蛋白領(lǐng)域研究.9 92.4.32.4.3 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究.10102.52.5 定向進化應用前景定向進化應用前景 .10102.62.6 研究的目的和意義研究的目的和意義 .11113 3 目的基因的體外突變及克隆目的基因的體外突變及克隆.12123.13.1 實驗材料實驗材料.12123.1.13.1.1 菌株菌株 .12123.1.23.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒 .12123.1.33.1.3 試劑試劑 .12123.1.43.1

10、.4 主要儀器主要儀器 .12123.23.2 實驗方法實驗方法 .13133.2.13.2.1 幾丁質(zhì)酶基因突變及篩選文庫的構(gòu)建幾丁質(zhì)酶基因突變及篩選文庫的構(gòu)建 .13133.2.1.13.2.1.1 質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取 .13133.2.1.23.2.1.2 水稻幾丁質(zhì)酶基因水稻幾丁質(zhì)酶基因chabchab的擴增的擴增 .13133.2.1.33.2.1.3 目的基因純化回收目的基因純化回收 .13133.2.23.2.2 易錯易錯 pcrpcr.14143.2.33.2.3 dnadna 改組改組(dna(dna shuffling)shuffling) .14143.2.43.2.4 突

11、變文庫的構(gòu)建突變文庫的構(gòu)建.14143.2.4.13.2.4.1 新鮮感受態(tài)細胞的制備新鮮感受態(tài)細胞的制備.15153.2.4.23.2.4.2 限制性酶切限制性酶切.15153.2.4.33.2.4.3 連接連接.15153.2.4.43.2.4.4 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 .1515vi3.2.53.2.5 篩選篩選 .16163.2.63.2.6 序列分析序列分析.16163.33.3 結(jié)果分析結(jié)果分析.16163.3.13.3.1 質(zhì)粒提取及質(zhì)粒提取及 pcrpcr 鑒定鑒定 .16163.3.23.3.2 體外突變體外突變 .17173.3.2.13.3.2.1 易錯易錯 pcrpcr 結(jié)果結(jié)果

12、.17173.3.2.23.3.2.2 dnadna shufflingshuffling 結(jié)果結(jié)果 .17173.3.33.3.3 突變文庫鑒定突變文庫鑒定.19193.3.43.3.4 序列分析結(jié)果序列分析結(jié)果.19193.43.4 討論討論.21213.4.13.4.1 易錯易錯 pcrpcr.21213.4.23.4.2 dnadna shufflingshuffling.21213.4.33.4.3 突變表達載體構(gòu)建及篩選突變表達載體構(gòu)建及篩選.22224 4 重組菌的誘導表達及酶活力測定重組菌的誘導表達及酶活力測定 .23234.14.1 材料及試劑材料及試劑 .23234.1.1

13、4.1.1 菌種菌種.23234.1.24.1.2 主要試劑與溶液主要試劑與溶液.23234.1.34.1.3 主要儀器主要儀器.23234.1.44.1.4 膠體幾丁質(zhì)的制備膠體幾丁質(zhì)的制備.24244.1.54.1.5 dnsdns 的配制的配制 .24244.1.64.1.6 考馬斯亮藍考馬斯亮藍 g-250g-250 的配置的配置.24244.24.2 實驗方法實驗方法 .24244.2.14.2.1 幾丁質(zhì)酶活測定幾丁質(zhì)酶活測定.25254.2.1.24.2.1.2 氨基葡萄糖標準曲線的繪制氨基葡萄糖標準曲線的繪制.25254.2.2.24.2.2.2 幾丁質(zhì)酶活測定幾丁質(zhì)酶活測定.

14、26264.2.24.2.2 蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定.26264.2.2.14.2.2.1 蛋白含量標準曲線的繪制蛋白含量標準曲線的繪制.26264.2.2.24.2.2.2 可溶性蛋白含量測定可溶性蛋白含量測定 .27274.2.34.2.3 菌體沉淀菌體沉淀 sds-pagesds-page 電泳鑒定電泳鑒定 .27274.2.44.2.4 cha-pcha-p突變體的誘導表達突變體的誘導表達 .28284.2.4.14.2.4.1 cha-pcha-p突變體表達條件優(yōu)化突變體表達條件優(yōu)化 .29294.2.54.2.5 包涵體復性包涵體復性.30304.2.5.14.2.5.1 包

15、涵體的溶解包涵體的溶解.30304.2.5.24.2.5.2 包涵體復性包涵體復性 .3131vii4.34.3 結(jié)果分析結(jié)果分析.31314.3.14.3.1 突變體突變體cha-pcha-p誘導表達結(jié)果誘導表達結(jié)果 .31314.3.24.3.2 cha-pcha-p突變體表達條件的正交優(yōu)化突變體表達條件的正交優(yōu)化 .33334.3.34.3.3 包涵體復性結(jié)果包涵體復性結(jié)果.36364.44.4 討論討論.37374.4.14.4.1 突變體突變體cha-pcha-p的誘導表達的誘導表達 .37374.4.24.4.2 表達條件優(yōu)化表達條件優(yōu)化 .38384.4.34.4.3 可能形成的

16、包涵體原因可能形成的包涵體原因 .38384.4.24.4.2 包涵體的處理及復性包涵體的處理及復性 .38385 5 小結(jié)小結(jié) .4040參考文獻參考文獻.4141致致 謝謝.474701 前言前言甲殼素或甲殼質(zhì)又稱為幾丁質(zhì)，它是由 n-乙酰-d-氨基葡萄糖以 -1,4-糖苷鍵連接而成的長鏈多聚物1。幾丁質(zhì)廣泛存在于水生甲殼類動物、軟體動物和節(jié)肢動物外殼中，如蝦、螃蟹等，同時也是大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分，也存在于一些綠藻中。其在地球上的含量非常豐富，僅次于纖維素，而它又具有比纖維素更加豐富的功能性質(zhì)。可廣泛應用在醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境等許多領(lǐng)域。每年自然界中產(chǎn)生數(shù)量極其巨大的幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)

17、及其降解產(chǎn)物作為重要的有機碳源和氮源，它們參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)交換和能量流動2。幾丁質(zhì)酶是一種能催化降解幾丁質(zhì)的糖苷酶，主要是水解幾丁質(zhì)中 -1，4 糖苷鍵,產(chǎn)生幾丁質(zhì)單糖-n-乙酰氨基葡萄糖（nag） 。很多植物都可以合成不同的幾丁質(zhì)酶，對于植物幾丁質(zhì)酶來說內(nèi)源性底物尚未發(fā)現(xiàn)，但植物幾丁質(zhì)酶也參與植物與微生物之間的相互作用，從而產(chǎn)生幾丁質(zhì)及其相關(guān)的混合物。由于幾丁質(zhì)是很多病菌細胞壁和害蟲等生物體的組成成分，所以幾丁質(zhì)酶能通過水解幾丁質(zhì)從而抵御病原菌和害蟲的入侵。目前已經(jīng)從許多微生物中分離到幾丁質(zhì)酶，并全面了解了其中一些幾丁質(zhì)酶的體外水解能力及對溫度、ph 耐受等生物學性質(zhì)。尤其是真菌幾丁質(zhì)酶在

18、轉(zhuǎn)基因植物中的應用，對真菌病原菌表現(xiàn)出了較好的抑制作用，降低了病原菌所產(chǎn)生的減產(chǎn)危害。這表明微生物幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中將起到重要作用。當然幾丁質(zhì)酶還有其它的一些重要作用,如抗凍害3、植物發(fā)育調(diào)節(jié)4、生物固氮5等方面都發(fā)揮著重要的作用，并與人類有些疾病發(fā)生相關(guān)6，7、廣泛參與了植物光合作用等過程8。幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)后獲得的具有生物活性氨基寡糖素在調(diào)節(jié)植物細胞生命代謝活動中起著重要的作用，其作為植物功能調(diào)節(jié)劑，不僅可以調(diào)控植物基因表達的開放與否，還可以誘導植物產(chǎn)生抗性蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)植物的生長和提高植物對病原微生物的防御能力。這些研究均暗示著幾丁質(zhì)酶具有多種生理功能，可應用領(lǐng)域十分廣泛。目前對幾丁質(zhì)

19、酶的特性、基因結(jié)構(gòu)、分類、分子進化、生物學作用及轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的研究越來越深入，近年來已成為作物抗真菌病害的研究熱點之一。1.1 植物幾丁質(zhì)酶特性植物幾丁質(zhì)酶特性大多數(shù)植物幾丁質(zhì)酶的分子量為 15-55kd，最適 ph 為一般低于 7，對溫度相對穩(wěn)定；等電點有的偏酸，有的偏堿，所以有酸性和堿性幾丁質(zhì)酶之分,植物1體內(nèi)通常含有 1 種或幾種幾丁質(zhì)酶9。植物幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生主要有組成型的和誘導型。正常情況下，植物幾乎不表達幾丁質(zhì)酶，極少數(shù)植物會表達幾丁質(zhì)酶但含量很低。當植物受到卵菌、真菌、細菌、病毒和害蟲等外來侵害時，植物可以產(chǎn)生大量的不同防御性相關(guān)蛋白質(zhì)（pr）來抵御。特別是在植物被感染的部位 p

20、r 含量會明顯增加，含量可提高到原來的十幾倍甚至幾百倍，從而避免植物遭受某些真菌、病毒等的侵害，但這種反應對病原菌和害蟲抑制效果并不明顯。水楊酸、茉莉酸、乙烯、-葡聚糖低聚糖、幾丁質(zhì)、殼聚糖寡糖和脂多糖等信號分子也能分別誘導植物產(chǎn)生防御相關(guān)蛋白10-11。 幾丁質(zhì)酶可以水解幾丁質(zhì)中的 -1,4 糖苷鍵，將 2-乙酰氨基-2-脫氧-d-葡萄糖線性多糖水解成甲殼低聚糖。1.2 植物幾丁質(zhì)酶的分類植物幾丁質(zhì)酶的分類在 cazy 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列將植物幾丁質(zhì)酶歸類到gh18 和 gh19 家族中12。這兩個家族的酶存在不同的催化反應機制，在進行水解反應時，gh18 家族幾丁質(zhì)酶利用底

21、物輔助催化，導致異構(gòu)體的零捕獲量13。gh19 家族幾丁質(zhì)酶利用一種反向催化機制，其中的兩個酸性氨基酸殘基催化反向異構(gòu)水解反應14。gh18 幾丁質(zhì)酶的催化區(qū)域是一個由（/）8 組成的桶狀折疊結(jié)構(gòu)，而 gh19 幾丁質(zhì)酶的催化區(qū)域則有是由 -螺旋構(gòu)成的。據(jù)報道，按照它們的分子組成，植物幾丁質(zhì)酶至少分成五類，classes i，ii和 iv 幾丁質(zhì)酶含有 gh19 家族的催化區(qū)域。classes i 幾丁質(zhì)酶有三個功能區(qū)組成：富含半胱氨酸 n-端幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，富含脯氨酸(pro)、甘氨酸(gly)、精氨酸(arg)的可變交聯(lián)區(qū)，高度保守的 c-端催化區(qū)。class iv 的催化區(qū)域小于 clas

22、ses i 和 ii，其中 classes i 和 iv 在 n 端含有碳水化合物結(jié)合模塊。classes iii 和 v含有 gh18 家族的催化區(qū)域，但 class v 的催化區(qū)域比 classes iii 的催化區(qū)域大；classes iii 缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)且該酶催化區(qū)的序列與 classes i 有很大差別，classes v 幾丁質(zhì)酶在 n 端有一個重復的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)。classes i 和 iv 在 n 端有富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)（cbd），但 classes iv 在催化區(qū)域發(fā)生了四個氨基酸殘基缺失，且與 classes i 催化區(qū)的同源性較低。classes ii 缺少

23、cbd區(qū)和交聯(lián)區(qū)，但它的催化區(qū)和 classes i 該功能區(qū)極為相似。幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)雖然不是催化能力和抗菌活性必不可缺少的，但其能增加抗菌效果15。21.3 植物幾丁質(zhì)酶基因研究進展植物幾丁質(zhì)酶基因研究進展1.3.1 幾丁質(zhì)酶新發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶新發(fā)現(xiàn)自 brogue16等 1991 年首次報道菜豆幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因煙草植物提高立枯絲核菌(rhizoctonia solani)的抗性以來，植物幾丁質(zhì)酶基因常作為抗病基因轉(zhuǎn)入受體植物以提高對目的病原真菌的抗性。植物和細菌的幾丁質(zhì)酶對真菌有抑制能力這一事實很早就已被人們所知17，18，但任何單一的植物或細菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶都不能表現(xiàn)出合適的抗菌能力。kana

24、ishisak19等人對豬籠草分泌液中 class iv 幾丁質(zhì)酶研究發(fā)現(xiàn)在其活性位點有 5 個亞位點，這些位點對(glcnac)n 的水解反應是有利的，但對于高聚底物分子沒有作用。催化(glcn- ac)n（n=4 或5）的水解反應中檢測到底物抑制現(xiàn)象。這對于研究豬籠草分泌液中幾丁質(zhì)酶的作用來說是一個很重要的發(fā)現(xiàn)。shaoyun wang20等人從蠶豆的種子獲得的一種新型的幾丁質(zhì)酶，對其抗菌性和熱穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)：該酶對菜豆綿腐病菌, 香碗豆萎凋病菌，蘋果粗皮病菌，互隔交鏈孢霉,葡萄孢菌和鐮刀菌都有抑制作用；在 20，30，40，50和 58保持 10min，該酶仍保持很高的生物活性。這表明

25、該酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要的抗真菌能力。haixia yang21等人從石榴種子中分離純化得到一種新的有很強鈣離子結(jié)合能力的幾丁質(zhì)酶。經(jīng)免疫組化和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)這種幾丁質(zhì)酶不像已發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶那樣定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡內(nèi)，而是存在于石榴種子的造粉體間質(zhì)中。通過對等電點聚焦實驗及氨基酸序列研究結(jié)果表明該酶的等電點為 4.41；有類似 18 家族的兩個保守區(qū)域，序列中富含天冬氨酸和谷氨酸，含有 21 個天冬氨酸殘基,是目前已知的 class中最多的一種幾丁質(zhì)酶，信號肽序列中含有很高比例的疏水性氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)該酶在種子的發(fā)芽過程中起著重要作用,鈣離子有利于蛋白三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,且不影響酶的活性。1.3.2

26、 幾丁質(zhì)酶幾丁質(zhì)酶 n-端研究端研究naoyuki umemoto22等人對來自于煙草的 class v 幾丁質(zhì)酶，通過定點突變法將位于底物結(jié)合區(qū)的色氨（trp326）突變成丙氨酸和苯丙氨酸后，該酶的熱穩(wěn)定性降低了 5-7，催化活力顯著降低。這說明了 trp326 殘基對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面起著很大作用，且在 glu115 作為質(zhì)子供體提供的水解環(huán)境存在時對于保持穩(wěn)定催化活力方面也可能起到一定的增強作用。lysm 是一個由 45 個氨基酸組成的蛋白功能區(qū)，最初在少數(shù)幾種細菌自溶蛋白質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)。shoko onaga23等人在琉球鳳尾蕨類中發(fā)現(xiàn)了 prchi-a 這種新的幾丁質(zhì)酶，該酶屬于class

27、es iii 類，n-端有兩個 lysm 功能區(qū)域，其幾丁質(zhì)結(jié)合能力及抗菌特性研究3表明 prchi-a 是主要通過 lysm 實現(xiàn)幾丁質(zhì)的結(jié)合，lysm 雖然沒有催化活力，但卻有利于提高植物的抗菌能力。1.3.3 幾丁酶農(nóng)業(yè)上應用幾丁酶農(nóng)業(yè)上應用目前，在植物抗病基因工程研究中，幾丁質(zhì)酶基因主要應用于 3 個方面：1）把其它來源的幾丁質(zhì)酶基因?qū)爰闹髦参镏? 以提高寄主植物幾丁質(zhì)酶的表達水平。2）改造植物原有的幾丁質(zhì)酶基因，改換強啟動子、導入增強子等，以增加幾丁質(zhì)酶基因的表達量。 3）改造野生生防菌株，通過轉(zhuǎn)基因，使生防菌株獲得新的抗病機制。多年的研究結(jié)果表明24,25,26,27，不僅單獨轉(zhuǎn)

28、化植物幾丁質(zhì)酶基因可獲得對病原真菌抗性提高的轉(zhuǎn)基因植株, 而且與其他抗菌蛋白基因如-1，3-葡聚糖酶基因、核糖體失活蛋白基因等共轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生協(xié)同作用而對病原真菌抗性進一步增強, 研究結(jié)果促進了不同植物來源幾丁質(zhì)酶基因的挖掘和利用價值評價。朱荷琴28等將幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因?qū)肟裹S萎病性較差的受體（中棉所 24），獲得的轉(zhuǎn)基因株系 61217-1 抗黃萎病性極顯著提高，達抗病水平，且能穩(wěn)定遺傳。苦瓜幾丁質(zhì)酶基因 mcchit1 基因具有廣譜抗菌性,張長偉29等將其遺傳轉(zhuǎn)化水稻，采用“逐代增加選擇壓,抗中選抗”的方法，篩選出了稻瘟病抗性優(yōu)良、抗譜明顯拓寬、產(chǎn)量性狀較好的轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定株系。木霉菌產(chǎn)生

29、的幾丁質(zhì)酶在相同的條件下表現(xiàn)出的抗菌能力比目前任何其它來源的幾丁質(zhì)酶抗菌能力都強，木霉菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶抗菌范圍也更廣 30。g v s saiprasad31等人利用來自木霉菌的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因在 camv35s 啟動子的控制下成功導入煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草對木霉菌表現(xiàn)出了顯著的抑制作用。linus moses kosambo-ayoo32等人將源自哈茨木霉菌的幾丁質(zhì)酶基因和殼聚糖酶基因同時轉(zhuǎn)入高梁基因組中，成功地獲得了對炭疽病有抵抗作用的轉(zhuǎn)基因高梁，從而可以有效降低炭疽病所導致的高梁減產(chǎn)程度。1.4 問題與展望問題與展望植物疾病對全世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)都是一個巨大的挑戰(zhàn)，含有幾丁質(zhì)酶等病程相關(guān)蛋白質(zhì)

30、的轉(zhuǎn)基因作物可以增強植物抵抗病菌的入侵能力，所以轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植被看作應對這一挑戰(zhàn)的有效方法。雖然近幾年，越來越多轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出了抗真菌活性，一些含有抗病蟲的轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶的活性得到了提高，但這些轉(zhuǎn)基因植物卻沒有表出相應的抗菌能力。例如，轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)雖然幾丁質(zhì)酶的活性得到了顯著的4提高，但卻對生活在其根際的病原真菌沒有抵抗能力33。在 arlorio 等34進行的研究發(fā)現(xiàn)水解酶對于外生菌根和石楠菌根真菌沒有抑制作用。有兩種可能可以解釋幾丁質(zhì)酶對于不同的真菌表現(xiàn)出不同的抗性作用。第一，可能是由于不同的真菌的細胞壁所含的幾丁質(zhì)的比例不同：那些細胞壁中幾丁質(zhì)所占比例低的真菌，不易

31、被幾丁質(zhì)酶發(fā)現(xiàn)。第二，可能是在不同的真菌細胞壁幾丁質(zhì)中暴露出的對幾丁質(zhì)酶敏感的鍵，存在很大的不同：如果幾丁質(zhì)敏感鍵暴露的較少，那么真病原菌就不會及時地受到幾丁質(zhì)酶的水解。當然幾丁質(zhì)酶在植物體內(nèi)的表達水平和定位情況也對其能否發(fā)揮抗菌性起到很重要的作用。例如，堿性幾丁質(zhì)酶定位于植物的液泡中，不可能對生活在細胞間的叢枝菌根真菌起到抑制作用35。因此，即使在叢枝菌根真菌侵染的植物根部幾丁質(zhì)酶水平得到提高也不影響其在根部的生存。伴隨著水解酶在植物體內(nèi)持續(xù)高水平的表達，叢枝菌根真菌也許已經(jīng)適應了那些水解酶的存在，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其它的真菌在水解酶存在仍能生存的情況36，37。隨著對幾丁質(zhì)酶作用機理研究的深入，通過

32、幾丁質(zhì)酶基因工程手段培育出具抗性轉(zhuǎn)基因植物將成為防治植物真菌病害的有效途徑。又因其不污染環(huán)境、不產(chǎn)生抗藥性、基因穩(wěn)定遺傳和對病蟲害的抑制作用等特性，所以擴大轉(zhuǎn)入幾丁質(zhì)酶基因植物群體，將成為今后轉(zhuǎn)入幾丁質(zhì)酶基因植物實用化的主要方向38。52 定向進化定向進化體外隨機突變已經(jīng)成為在產(chǎn)生優(yōu)化酶或有特定功能蛋白質(zhì)的常用策略。該策略包括對編碼不同蛋白基因的體外突變，突變蛋白質(zhì)的表達及基于目的特性的蛋白質(zhì)篩選兩個部分。 事實上蛋白質(zhì)體外定向進化并不是一個新的概念，早在上世紀 70 年代有關(guān)蛋白質(zhì)定向進化就已經(jīng)有了比較系統(tǒng)的研究。定向進化一個早期例子是來自大腸桿菌的 ebga 酶蛋白，該酶缺少-半乳糖苷酶活

33、性。通過多次篩選以乳糖為唯一碳源的 lacz 缺少的大腸桿菌株系，結(jié)果表明篩選到的野生型 ebga 酶蛋白進化成了具有 -半乳糖苷酶活性，從而替代了 lacz 基因的功能39。蛋白質(zhì)定向進化是一個用來描述產(chǎn)生突變體和篩選期望特性的突變技術(shù)。在過去三十年里，蛋白質(zhì)定向進化已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)工程中的一個強大有力的技術(shù)平臺。該技術(shù)有效地利用分子生物學工具和高通量篩選技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的進步。這些方法簡化了實驗過程并促進了突變體的篩選鑒定，即使這些突變體在期望特性發(fā)生微小的提高。進一步發(fā)展的 dna 重組技術(shù)可以用于單結(jié)構(gòu)基因或基因的突變，從而為快速生長或高水平表達蛋白質(zhì)找到一個合適的替代宿主。此外，

34、如易錯 pcr 可以通基因的插入或缺失控制突變率進行蛋白質(zhì)修飾。定點突變、定點飽和突變和合成寡核苷酸也能被用于擴大氨基酸的多樣性。雖然突變體的功能互補在篩選突變體仍然是一種極好的選擇，但目前隨著儀器設備靈敏度及許多化學和生物學分析的微型化的不斷發(fā)展，可以依據(jù)目的特性大量的篩選樣品?？焖佾@得基因突變體 dna 序列信息的能力不僅使我們更深刻的理解蛋白質(zhì)序列和功能之間的關(guān)系，而且增強我們選擇最好策略進行特定蛋白質(zhì)進化的能力。一個最有效的蛋白質(zhì)定向策略是逐漸的累積重組突變，同時運用高通量篩選，該策略主要難點在于：突變頻率的控制和篩選方法的選擇。如果突變率過高會增加形成無義或有害突變的機率，而突變率較

35、低則不能起到突變的效果；經(jīng)定向突變后所形成的突變體文庫一般的容量都比較大，給篩選工作帶來不便；所以對于定向進化來說，突變率的控制和高通量篩選方法選擇決定著該策略能否成功。蛋白質(zhì)定向進化不需要事先了解基因表達產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)，就可對目6標蛋白達到改造的目的，所以其應用也越來越廣泛。體外分子進化技術(shù)主要有易錯 pcr、dna shuffling、外顯子改組、隨機引物體外重組法、定點飽和突變法、交錯延伸重組、瞬時模板隨機嵌合生長等策略40。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，通過體外分子進化，可以更快速、靈活和簡便的改造目的基因。從功能出發(fā)，獲得某些優(yōu)化的突變體，一方面可快速將其推向?qū)嶋H應用，另一方面將對蛋白質(zhì)

36、的理論研究起到更大的促進作用41。2.1 易錯易錯 pcr易錯 pcr 是使用最廣泛的體外突變方法之一，常用于誘導形成突變體的一種隨機突變方法，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)工程中有效工具。經(jīng)典的易錯 pcr 是通過改變反應體系中各組成成分的濃度、外加一定濃度的 mn2+及改變反應體系中所使用的聚合酶（沒有 3到點 5的外切酶活性），從而導致擴增出的 pcr 產(chǎn)物發(fā)生堿基錯配。但經(jīng)典的易錯 pcr 方法中由于所用的 taq/pfu 聚合酶沒有校對功能，所以產(chǎn)生的突變存在 atgc 轉(zhuǎn)換和 atta 顛換的傾向，為了彌補這個主要缺陷日本學者 toshifumi minamoto 42等探索出了一種新的易錯 pc

37、r 方法：使用重水代替普通的雙蒸水作為反應體系中的溶劑。他們通過選擇（a) 100% h2o, (b) 100% h2o/0.6 mm mn2+, (c) 99% d2o, (d) 99% d2o/0.6 mm mn2+ 和(e) 99% h218o 五種不同的條件進行 pcr 擴增研究發(fā)現(xiàn)：使用重水作為溶劑時易錯pcr 產(chǎn)生的突變沒有位置偏好性，模反依賴性或發(fā)生產(chǎn)物減少的現(xiàn)象。一般適合較小的基因片段(1000bp)，但也有報道可以用來擴增幾千 bp 基因片段。隨著研究不斷的深入相繼出了以易錯 pcr 技術(shù)為基礎的體外突變技術(shù)，如重疊延伸蛋白域文庫法，該方法是 jose 等43于 2008 年

38、首次提出的，其利用易錯 pcr 技術(shù)引入一個隨機片段，并且在相應的氨基酸序列上做標記，用高保真pcr 擴增上游不被改變的具有一定功能的脫氧核糖核苷酸序列，該序列中的部分序列與被引入的隨機片段重疊后進行雜交延伸反應，產(chǎn)生新的核苷酸序列可以用于構(gòu)建突變克隆文庫。這種方法提高了易錯 pcr 的突變效率，能夠在一個特定的區(qū)域發(fā)生隨機突變，也就是說可以在預期的區(qū)域進行隨機突變。所以，當涉及到多域蛋白質(zhì)的突變時，重疊延伸蛋白域文庫法是首選的方法。重疊延伸蛋白域文庫法與易錯 pcr 和 dna 改組44相比，有重大的提高。該方法的不足是步驟較繁鎖，突變效率有限。2.2 dna 改組改組dna 改組是 ste

39、mmer 等45 于 1994 提出來的，該技術(shù)是通過對一組序列相關(guān)的 dna 序列經(jīng)超聲波處理或在 dnasei 的作用下隨機酶切成小片段，然后7在不加引物的情況下，采用有性 pcr 方法進行合成；隨著循環(huán)數(shù)的增加，pcr產(chǎn)物將越來越接近切割前目的基因的長度；最后，用基因兩側(cè)的引物合成全長的基因。圖2.1 dna改組流程研究表明，dan 改組比隨機突變具有較大的優(yōu)勢，隨機突變的方法一般產(chǎn)生 1%的良性突變，但 dna 改組可產(chǎn)生 13%的良性突變。而且，dna 改組還可引入可控制水平的點突變(0.05%-0.7%) ，其所產(chǎn)生的突變基因庫容量遠遠高于隨機突變所產(chǎn)生的點突變庫容量46。在 dn

40、a 改組出現(xiàn)以前，寡核苷酸定向誘變和易錯 pcr 被廣泛用于對蛋白的體外突變，一段時期以來在工業(yè)，醫(yī)藥等領(lǐng)域卻也有著廣泛的應用，盡管這兩種方法只發(fā)生了較低的點突變。通過突變或重組獲得基因文庫的多樣性，一般出發(fā)基因突變文庫利用點突變（如易錯 pcr）或定點突變產(chǎn)生；因為有益突變一般相對于不利突變產(chǎn)生的頻率要低很多，只有單個有益突變在每輪突變循環(huán)中累積并不斷被篩選出。事實上，當產(chǎn)生多突變后，目標蛋白特性發(fā)生改善的機率則迅速降低；因此通過幾輪點突變方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)特性提高是有限且較小的。dna 改組通過引入來自多基因的有益突變定向重組，從而克服了點突變的局限性，相繼出現(xiàn)了 whole-genome s

41、huffling、dna family shuffling、隨機鏈交換突變法，其中隨機鏈交換突變法是 ryota47，48等于 2006 年首次提出的，該方法除了需要在小片段的 3端用末端脫氧轉(zhuǎn)移酶（tdt）隨機的加入 1-5bp 堿基外，其余均與 dna shuffling 步驟幾乎一致，但與 dna shuffling 相比，不需8要一組含點突變的基因或基因家族，可直接以單個基因為父本，而且它產(chǎn)生的突變強度大于 dna shuffling，包含點突變、區(qū)域交換外，還可以產(chǎn)生隨機序列的插入或刪除等，從而提高突變文庫的多樣性47。2.3 篩選方法篩選方法在完成構(gòu)建突變文庫之后最重要的是根據(jù)所要

42、得到的特性選擇合適的篩選模型進行篩選。合理的高通量篩選方案對于定向進化的最終成功至關(guān)重要。篩選方法選用應按照以下標準：第一，對要篩選目的蛋白質(zhì)具有針對性，所篩即所得，這也被稱為定向進化第一定律。第二，必須是高通量的篩選方法。第三，檢測方法必須具有可行性，檢測過程具有一定的靈敏度。目前通常采用的篩選方法是基于生物學表型的篩選，例如對抗生素抗性的基因進行定向進化，只需在提高抗生素濃度的平板上即可進行高效篩選；改造編碼耐熱酶基因的過程，通過提高培養(yǎng)溫度就可以篩選耐熱性提高的酶。生物學表型篩選方法一般簡單有效，但也有其一定的局限性，例如對于不能通過生物學表型鑒定的性狀就不能通過生物學表型方法篩選，因而

43、出現(xiàn)了許多新的篩選方法以應對各種復雜的性狀49。如：流式細胞分選技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、mrna 展示技術(shù)，其中酵母表面展示技術(shù)作為一種真核蛋白質(zhì)系統(tǒng)，近年來已經(jīng)越來越多的應用于酶、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品，生物燃料等方面。其基本原理是：利用外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導入酵母菌細胞內(nèi)，通過該細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至膜表面的機制使目標蛋白質(zhì)固定化表達在細胞表面50。2.4 定向進化的應用定向進化的應用2.4.1 工業(yè)領(lǐng)域研究工業(yè)領(lǐng)域研究趙心清51等利用易錯 pcr 對釀酒酵 4126 的 spt3 進行體外突變，篩選到了對高濃度乙醇耐受性提高的突變株 m25，該突變株利用 125

44、g/l 的葡萄糖進行乙醇發(fā)酵時，終點乙醇產(chǎn)量比對照菌株提高了 11.7。 氫氣是一種有很大應用前景的可替代能源,生物體內(nèi)可以合成釋放出氫氣，其中莢膜紅細菌就是這類生物體，但該菌產(chǎn)氫氣的能力及對溫度的耐受點低。 abdulmecit 52等人利用體外定向進化手段獲得了幾株乙基甲烷磺酸(ems)發(fā)生突變的莢膜紅細菌突變體。對其氫氣產(chǎn)量和耐熱能力鑒定發(fā)現(xiàn)：突變后氫氣產(chǎn)量較未突變前提高了24%，42時依然很穩(wěn)定，這表明定向進化是一種非常有用的方法對于提高工業(yè)微生物某些重要性質(zhì)方面。92.4.2 藥用蛋白領(lǐng)域研究藥用蛋白領(lǐng)域研究定向進化可以用來優(yōu)化藥用蛋白，提高藥用蛋白臨床上的應用價值。目前體外定向進化

45、技術(shù)也被廣泛的應用于改造細胞因子和生長因子、提高抗體表達水平、改變抗體的親和性，在新型疫苗和藥物分子上也有很大突破性研究53-57。chang 等以多種人-inf基因為底物進行 dna 改組，經(jīng)兩輪改組篩選后得到的大多數(shù)突變體的活性較野生型提高了 285000 倍，其中有三個突變體的活性是小鼠自身活性最高的 3.5 倍56。囊性纖維化病是一種與胰腺機能不全有關(guān)的疾病，管腔內(nèi)酸性條件限制了胰腺酶替代治療的作用，尤其是脂肪酶的影響。damien 58等人運用定向進化與合理的設計來提高人類胰腺酶在酸性條件下的催化能力。篩選出了在低 ph 值條件下仍有活性的突變體。經(jīng)過一輪隨機突變產(chǎn)生了一個在酸性培養(yǎng)

46、基條件下活性提高 50%的脂肪突變體，該突變體帶有一個長鏈的三酸甘油脂。序列分析發(fā)現(xiàn)在特定區(qū)域發(fā)生了兩個堿基替換，疏水溝定位在三酸甘油脂的 sn-1 上。其表面上的環(huán)可能是脂肪酶/輔脂肪酶與脂質(zhì)相互作用的媒介。有趣的是前面的兩個替換改變了脂肪酶朝向介質(zhì)和長鏈三酸甘油脂的鏈長度。他們的研究結(jié)果為設計在酸性條件下催化活性提高的脂肪酶提供了支持，并首次證明了與特定鏈長有關(guān)的重要殘基。2.4.3 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究甘蔗巨型螟是一種嚴重危害甘蔗的害蟲，其內(nèi)生的生活方式大大降低了化學和生物控制的效果。kilvia 59等人利用 dna shuffling 對 bacillus thuringiens

47、is cry 蛋白質(zhì)基因進行體外突變，并通過噬菌體展示，篩選到了對甘蔗巨型螟產(chǎn)生毒性的突變體，這一研究對于通過轉(zhuǎn)基因方式來控制甘蔗巨型螟的入侵有重要意義。植物液泡 na+/h+反向轉(zhuǎn)運子在維持細胞離子動態(tài)平衡和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運細胞質(zhì)內(nèi)的 na+到液泡內(nèi)起重要的作用。雖然液泡反向轉(zhuǎn)運子在耐鹽方面起著重要作用，但 na+/h+反向轉(zhuǎn)運子相對較低的交換 na+/h+的 vmax 被證明限制了耐鹽作物分子育種的實施。徐凱60在研究中運用 dna 改組產(chǎn)生和重組了擬南芥液泡na+/h+反向轉(zhuǎn)運子 atnhx1 基因的突變體。運用大型酵母互補系統(tǒng)篩選，證明了 atnhxs1 是一個新的 na+/h+反向轉(zhuǎn)運子。a

48、tnhxs1 在酵母表達證明這個新的反向轉(zhuǎn)運子定位在液泡的膜上，它的表達提高了酵母對 nacl，kcl，licl 和潮霉素 b 的耐受能力。通過測定完好酵母液泡轉(zhuǎn)運離子的能力證明 atnhxs1 蛋白表現(xiàn)出了較高的 na+/h+交換能力，并且它交換 k+/h+的能力也有輕微的改善。102.5 定向進化應用前景定向進化應用前景由于許多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)和功能之間的聯(lián)系尚未弄清，因此定向進化技術(shù)在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域擁有巨大的優(yōu)越性，它能在很短的時間內(nèi)完成自然界上百萬年的進化歷程，在改造蛋白質(zhì)分子特性方面應用越來越廣泛，新的、更好的蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)也在不斷出現(xiàn)。如今，定向進化技術(shù)已被廣泛用于基因的體

49、外進化，出現(xiàn)了一系列具有重要工業(yè)意義或商業(yè)價值的基因和蛋白，大大加速了基因的進化進程，在農(nóng)業(yè)、石油化工、生物工程、人類基因治療研究等重要領(lǐng)域具有廣闊的應用開發(fā)前景。2.6 研究的目的和意義研究的目的和意義幾丁質(zhì)酶在植物病蟲害防治方面所具有的利用價值，已經(jīng)引起人們的普遍重視，農(nóng)業(yè)害蟲及某些真菌病原體內(nèi)存在幾丁質(zhì)酶，它們通過幾丁質(zhì)酶調(diào)節(jié)自身的生理生長過程，保證正常生長及生活，但必需是在合適的時間產(chǎn)生適當水平的幾丁質(zhì)酶。例如成蟲在非蛻皮期過量表達幾丁質(zhì)酶，害蟲等幾丁質(zhì)成分會被水解，從而對其造成一定的損傷，致使昆蟲無法進行正常的生命周期甚至死亡，人們利用這一原理實施農(nóng)業(yè)治蟲高效且環(huán)保。punja 等6

50、1指出，雖然轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因可以增強植物的抗病蟲的能力，但這與物種、基因來源、類型、導入目標植株后在染色體上的定位及病原菌的種類等均有關(guān)系,上述不確定性導致利用導入外源抗病基因來增強植物對真菌性病害的抵抗能力的策略更加復雜。punja 等 61將矮牽牛、煙草和赤小豆的幾丁質(zhì)酶基因分別轉(zhuǎn)入黃瓜中，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因黃瓜對絲核菌、鏈酶菌和葡萄孢菌的抗性并未提高；而在用胡蘿卜為材料的轉(zhuǎn)化試驗中發(fā)現(xiàn)其對同樣的病原菌表現(xiàn)出抗性，煙草幾丁質(zhì)酶基因的效果大大優(yōu)于矮牽牛幾丁質(zhì)酶基因。定向進化可以快速地對蛋白質(zhì)進行改造，優(yōu)化蛋白質(zhì)的某些性質(zhì)，所以可以利用分子定向進化對水稻幾丁質(zhì)酶改造以提高其本身所具有的酶活力，解決物

51、種、基因來源、類型等對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物發(fā)揮其對病蟲防御作用的限制。通過幾丁質(zhì)酶的定向進化不僅可以產(chǎn)生有用的酶，而且對幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)和功能的研究也具有極重要意義。非理性設計可以快速方便地產(chǎn)生同一種幾丁質(zhì)酶的多種不同突變體，這些突變體所表現(xiàn)出來的性能(酶的活力、特異性和穩(wěn)定性等)與其對應的氨基酸序列可形成大量的生物信息庫。分析這些數(shù)據(jù)，找出可能對幾丁質(zhì)酶性能影響較大的氨基酸序列，為幾丁質(zhì)酶的理性設計提供理論依據(jù)，使理性設計更能11充分發(fā)揮其應有的作用，實現(xiàn)對其的改造。為轉(zhuǎn)基因水稻提供研究材料。3 目的基因的體外突變及克隆目的基因的體外突變及克隆3.1 實驗材料實驗材料3.1.1 菌株菌株 菌種 e

52、.coli（top10f，bl21）本實驗室保存。3.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒 pbmp-p 質(zhì)粒及含有水稻幾丁質(zhì)酶基因的（pet28a-chab， ）質(zhì)粒（本驗室保存） 。3.1.3 試劑試劑 pcr 擴增試劑（寶生物公司） 、bamhi/ecori 限制性內(nèi)切酶(fermentas 公司）、dna marker（寶生物公司） ， dnasei（寶生物公司）,t4 dna 連接酶及rnasea ， （寶生物公司） ，膠回收試劑盒（bioflux 公司） 。瓊脂糖:biowest regular溶液 i：50 mmol/l 葡萄糖，25 mmol/l tris-hcl，10 mmol/l edta溶液

53、：5 mol/l naoh，2% sds 按 1：1 體積現(xiàn)配現(xiàn)用溶液：5 mol/l 乙酸鉀 60 ml，冰乙酸 11.5 ml，水 28.5 ml rnase 溶液：10 mg/ml苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1） te buffer：10 mmol/l trishcl，1 mmol/l edta，ph 8.0氨芐青霉素：（100 g/ml）12iptg：20 mg/ml，0.22 m 濾膜過濾除菌后于-20貯存?zhèn)溆脁-gal：50 mg/ml，用二甲基甲酰胺配制，黑紙包裹后-20貯存3.1.4 主要儀器主要儀器 pcr 儀（bio-rad（s1000） ） ，核酸電泳儀（jy600）

54、 ，紫外透射分析儀（uv-vi） ，凝膠成像系統(tǒng)（美國通用 tmagequant300） ，高速冷凍離心機（biofuge fresco） ，轉(zhuǎn)移脫色搖床（ts-8） ，紫外可見分光光度計（752） ，超凈工作臺（sw-cj-if） ，隔水式恒溫培養(yǎng)箱（gnp-9160）3.2 實驗方法實驗方法3.2.1 幾丁質(zhì)酶基因突變及篩選文庫的構(gòu)建幾丁質(zhì)酶基因突變及篩選文庫的構(gòu)建3.2.1.1 質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取將含有水稻幾丁質(zhì)酶基因（chab）的菌種分別經(jīng)平板劃線培養(yǎng)和液體培養(yǎng)后，用堿性裂解法提取質(zhì)粒。3.2.1.2 水稻幾丁質(zhì)酶基因水稻幾丁質(zhì)酶基因 chab 的擴增的擴增以 a1(5atggtgaac

55、ggctacttgtt 3)，a2（5gatggacgatcagtggttg 3）為引物，質(zhì)粒 pet28a-chab 為模板進行 pcr 擴增；擴增條件：95預變性 5min，95變性 15s，55退火 1min，72延伸 45s，72延伸 10min，30 個循環(huán)。3.2.1.3 目的基因純化回收目的基因純化回收利用 bioflux 膠回收試劑盒對 pcr 產(chǎn)物進行純化，主要步驟如下： 1）用干凈鋒利的手術(shù)刀切下含有目的片段的凝膠部分，并放入 1.5ml 離心管中（注意盡量切去不含 dna 片段的凝膠） ；2）按 1:3 的比例（凝膠的毫克數(shù):融膠液的微升數(shù)）向離心管加入extractio

56、n buffer（注意每份試劑的用量不能超過 400mg 的凝膠） ； 3）在恒溫水浴或金屬浴中 50溫浴，直至凝膠完全融化（溫浴 10min，一般溫浴過程中每隔 2-3min 混勻一次） ；4）將混合液全部轉(zhuǎn)移到 spin column 內(nèi)，于 6000rpm 離心 1min，棄去接液管內(nèi)液體（如混合液大于 750l 可先轉(zhuǎn)移 750l，其余的液體待棄液后再轉(zhuǎn)移） ； 5）加 500l extraction buffer 于 spin column 內(nèi)，13000rpm 離心 60s，并棄去接液管內(nèi)液體；136）加 750l wash buffer 于 spin column 內(nèi)，于 130

57、00rpm 離心 60s，去除接液管內(nèi)液體；7）再次以 13000rpm 的速度離心 1min，然后將 spin column 轉(zhuǎn)移到無菌的1.5ml 離心管中；8）加 30-50l elution buffer、te 溶液或滅菌去離子水于 spin column 內(nèi)，室溫靜置 1min（根據(jù)實驗的實際需要確定 elution buffer 的具體用量，如果長期保存最好用 te。 ） ；9）以 13000rpm 的速度離心 60s，1.5ml 離心管內(nèi)溶液中含有目的 dna 片段，取適量體積（5l）進行電泳檢測，其余放-20 冰箱保存。3.2.2 易錯易錯 pcr以 p1（5-gat ggg

58、atc cgt gaa cgg cta ctt gtt ccg-3畫線處為bamhi 酶切位點）, r1(5-tgc gga att cgt ggt tgg cga cga tct cc-3畫線處為 ecori 酶切位點)為引物，純化的幾丁質(zhì)酶基因 pcr 產(chǎn)物為模板進行易錯 pcr；擴增條件：95預變性 5min，94變性 1min，50退火 lmin，72延伸 1.5min，25 個循環(huán)，置 4保存 15min。3.2.3 dna 改組改組(dna shuffling)1）基因的片段化將純化回收的易錯 pcr 產(chǎn)物 chab 在 16，8min 條件下進行dnasei隨機酶切反應,然后加入

59、 edta 至終濃度為 2.5mm 后，65加熱 10 分鐘使 dnase i失活.電泳上樣緩沖液用 10%的甘油進行稀釋,以便于看清低分子量的條帶，消化的 dna 片斷經(jīng) 2低熔點瓊脂糖凝膠電泳，選取合適大小范圍的 dna 片段(50-200bp)，并回收試劑盒回收 dna 片斷。2）dna 片段的組裝 (無引物 pcr)純化回收的 dna 片段為模板進行無引物 pcr。擴增條件；95預變性5min，94變性 30s，45退火 1min，72延伸 45s，72延伸 10min，30 個循環(huán)。3）無引物 pcr 產(chǎn)物的純化回收用購自 bioflux 公司的膠回收試劑盒進行回收（按照其說明操作）

60、。4）全長基因的擴增(加引物)以 p1（5-gat ggg atc cgt gaa cgg cta ctt gtt ccg-3畫線處為bamhi 酶切位點）, r1(5-tgc gga att cgt ggt tgg cga cga tct cc-3畫線處為 ecori 酶切位點)為引物，純化回收的無引物 pcr 產(chǎn)物為模板進行全14長基因的擴增。擴增條件：95預變性 5min，94變性 30s，58退火45s，72延伸 45s，72延伸 10min，19 個循環(huán)。5）全長基因的回收用購自 bioflux 公司的膠回收試劑盒進行回收(按照其說明操作)。3.2.4 突變文庫的構(gòu)建突變文庫的構(gòu)建將