溫度因素對薯蕷多糖測定的影響研究(

1、溫度因素對薯蕷多糖測定的影響研究 基金項目：國家科技基礎(chǔ)性工作和社會公益研究專項資金資助（NO. 2003DEB6J074）； 國家科技支撐計劃項目資金資助（NO. 2006BAD06B05）。作者簡介：張衛(wèi)明（1957-），男，安徽蕪湖人，研究員，主要從事農(nóng)林特產(chǎn)資源保護與產(chǎn)業(yè)開發(fā)。通訊方式：botanyzh,衛(wèi)明1，單承鶯1，杭悅宇2，姜洪芳1，張玖1（1南京野生植物綜合利用研究院，210042；2中科院/江蘇省植物研究所，210014）摘要 目的：考察水提溫度、原料干燥溫度等因素對薯蕷多糖含量測定的影響。方法：以河南鐵棍山藥、昆明栽培山藥、浙江文成參薯以及福建

2、三明褐苞薯蕷為試樣，在不同溫度下干燥和提取，采用硫酸-苯酚法測定多糖含量。結(jié)果：樣品的干燥溫度對多糖含量測定結(jié)果影響不大，而水提溫度對于多糖含量測定結(jié)果影響極大。結(jié)論：薯蕷多糖測定中的提取溫度以不超過65為宜，提取溫度過高時會因原料中淀粉溶出而導(dǎo)致多糖測定結(jié)果大幅虛高。關(guān)鍵詞 薯蕷屬，山藥，參薯，褐苞薯蕷，多糖測定薯蕷屬（Dioscarea）是薯蕷科中最大的一個屬。全世界薯蕷科有6屬約650余種，薯蕷屬就占了600種以上，主要分布在東南亞、非洲及中美、南美等熱帶和亞熱帶地區(qū)，少數(shù)幾種分布于歐洲和北美洲。我國約有55種、11變種、1亞種，主要分布于長江以南1。薯蕷屬植物大多具有較粗大的地下塊莖或

3、根狀莖，是該屬植物的主要食用或藥用部位。其中薯蕷（D. polystachya Turcz., 原稱D. opposita Thunb）的塊莖又稱山藥，早在神農(nóng)本草經(jīng)中就被列為上品，具有健脾、補肺、固腎、益精等功效，是藥食兩用的佳品。同屬的山薯（D. fordii）、褐苞薯蕷（D. persimilis）、參薯（D. alata）等在部分地區(qū)也作為山藥主流商品使用，成為較有影響的地方性藥材。山藥塊莖中主要含有淀粉、蛋白質(zhì)、多糖及黏液質(zhì)，并含有多種游離氨基酸、尿囊素、膽堿等成分2。其中多糖被認(rèn)為是山藥補益作用的活性成分，因而普遍受到關(guān)注，常被作為藥材及其制劑的品質(zhì)評價和質(zhì)量控制指標(biāo)。但是薯蕷屬植

4、物的多糖比較復(fù)雜，文獻報道不一。山藥的黏液質(zhì)是一類含磷的的復(fù)合多糖，Satoh等3早年報道它是甘露聚糖和植酸的復(fù)合物，山藥黏液質(zhì)B（Dioscroreamucilage B）后又被闡明是甘露聚糖和含磷蛋白質(zhì)的復(fù)合物，分子量約為200萬，其中蛋白質(zhì)約占64%。山藥中另一類重要的多糖為雜多糖，例如趙國華等4分離到的RDPS-1，平均分子量為41000，由摩爾比為1: 0.4: 0.1的葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。Tadashi Kiho等5分離到的山藥多糖Y-N分子量約為370000，其糖基組成則為6:1摩爾的甘露糖和葡萄糖。杭悅宇等6測得的商品山藥多糖的糖基摩爾比則為6.45（甘露糖）:1（葡萄

5、糖）:1.26（半乳糖）。不同文獻報道的山藥多糖的提取得率及其糖基組成隨提取溫度的不同而差異極大。以冷水或溫水浸提時，得到的是以葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成的雜多糖，得率也較低，一般不超過1%。而以沸水煮提時，得到的則主要是葡聚糖7，且得率往往可以超過10%。由于這些文獻采用的是不同的研究材料，相互間很難進行嚴(yán)格的比較，這對山藥及其藥源替代品的品質(zhì)評價帶來了很大的不便。鑒于近期的研究報告（論文、課題鑒定材料等）中，溫浸和煮沸兩種不同的提取方法仍在分別被采用，本文以河南鐵棍山藥、昆明栽培山藥、浙江文成參薯以及福建三明褐苞薯蕷為試驗材料，比較了水提溫度對多糖含量測定結(jié)果的影響。黏液質(zhì)作為一類復(fù)合多糖

6、，也應(yīng)該計入總多糖。眾所周知，去皮后的新鮮山藥表面粘滑，但若干燥后再復(fù)水處理，粘滑程度則大為降低。這一現(xiàn)象提示，作為粘液質(zhì)的蛋白復(fù)合多糖在脫水后其立體精細(xì)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了某些改變。那么干燥溫度是否會顯著影響這類復(fù)合多糖的提取率并進而影響總多糖的測定結(jié)果？為此，本文就樣品干燥溫度也進行了適當(dāng)?shù)膶Ρ仍囼灐? 材料與方法1.1 實驗材料薯蕷（D. polystachya）樣品2個：分別采自河南溫縣（鐵棍山藥）與云南昆明；參薯（D. alata）樣品1個：采自浙江文成；褐苞薯蕷（D. persimilis）樣品1個：采自福建三明。以上樣品均為當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N，采集時間同為當(dāng)年11月上、中旬，均經(jīng)中科院/江蘇

7、省植物研究所杭悅宇研究員鑒定。樣品（鮮樣）削皮、切丁后置65烘箱內(nèi)干燥，粉碎成40目粗粉，部分直接供試，其余則根據(jù)實驗設(shè)計于105干燥至恒重后供試。1.2 藥品與試劑無水葡萄糖、尼泊金乙酯、苯酚、濃硫酸、乙醇、碘、碘化鉀等，均為市售分析純。1.3 儀器恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備總廠），超聲波裝置（BRANSON-200，U.S.A.），精密天平（EL-410S，U.S.A.），紫外分光光度計（TU-1800，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。1.4 實驗方法1.4.1 多糖提取與測定1.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取105干燥至恒重的無水葡萄糖0.100g，蒸餾水溶解并定容至100mL，精密

8、移取10mL，再次定容至100mL，此時終濃度為0.10mg/mL。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00mL于10mL具塞試管內(nèi)，補充水至2.00mL，另取一支空管加入2.00mL蒸餾水作對照。每管各精密加入濃度20g/L的苯酚溶液（新鮮配制）1mL，濃硫酸5mL，混勻，放置5min，沸水浴加熱顯色5min，冷水浴冷卻30min，在485nm處測定吸光度。測定結(jié)果見表1，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。標(biāo)準(zhǔn)方程為y=5.8884x+0.0618（R2=0.9990）。表1 葡萄糖含量梯度液的吸光度12345678葡萄糖含量（mg）0.010

9、0.0200.0400.0600.0800.1000.1500.200吸光度（A485）0.1080.1690.2970.4220.5510.6600.9491.224圖1：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線1.4.1.2 樣品含量的測定稱取以設(shè)定溫度（見1.4.2.2）干燥的樣品40目粗粉1.0g左右，精密稱定。置250mL三角瓶中，加入100mL80%乙醇，回流2h，冷卻后用濾紙濾去乙醇溶液，再次加入100mL80%乙醇，回流1.5h，冷卻過濾，將濾紙和濾渣置三角瓶中一起烘干，精密加入99mL蒸餾水，1mL3%尼泊金乙酯溶液，稱重，置水浴鍋中以設(shè)定條件（見1.4.2.1）提取3h。取出靜置，冷卻，補加蒸餾水至

10、原重，過濾，取中段濾液，密封置于冰箱4下保存。集齊所需樣品濾液后，每份精密移取1.00mL，置10mL具塞試管內(nèi)，加入蒸餾水1.00mL，按1.4.1.1節(jié)自“加入苯酚溶液”起操作，測定吸光度（每份樣品做3個平行管）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中葡萄糖含量，再乘以系數(shù)0.9換算為多糖（以葡聚糖計）含量，統(tǒng)一按絕干品計。1.4.2 不同提取溫度和樣品干燥條件對多糖測定結(jié)果的比較1.4.2.1提取溫度對多糖測定結(jié)果的影響將1.4.1.2節(jié)操作中水浴浸提溫度設(shè)為45、55、65、80和100五個水平，樣品干燥條件設(shè)定為105，以觀察提取溫度對多糖提取率的影響。其中45、55、65和80水浴提取時輔以超聲

11、波處理（每小時用超聲波處理一次，每次15min）；100沸水浴提取需冷凝回流，不再超聲波處理。1.4.2.2 樣品干燥條件對多糖測定結(jié)果的影響將1.4.1.2節(jié)操作中稱取樣品的干燥條件設(shè)為65和105兩個水平，而水浴浸提溫度設(shè)定為45和80，以觀察多糖提取率是否受樣品干燥溫度的影響。65下干燥的樣品計算時再以其干燥至105恒重時的干燥失重率（含水率）進行修正。1.4.3 不同提取溫度下所得溶液碘色反應(yīng)比較取105干燥處理的樣品在提取溫度分別為45、55、60、65、70、75、80和100下按1.4.1操作，提取所得的溶液進行碘色反應(yīng)，以檢驗水提液中是否有淀粉溶出。2 結(jié)果與討論2.1提取溫度

12、對多糖測定結(jié)果的影響（見表2）表2 提取溫度對多糖測定結(jié)果的影響（n=3）樣品提取溫度多糖含量（%）相對平均偏差（%）450.531.34550.660.57河南鐵棍山藥650.731.60805.710.231008.331.32450.872.51550.931.05昆明山藥651.532.90807.001.0210010.023.49450.650.58550.730.63浙江參薯651.081.368014.391.0610015.913.59450.441.82550.601.25福建褐苞薯蕷650.780.62808.761.751009.712.432.2樣品干燥條件對多糖測定

13、結(jié)果的影響（見表3）表3 樣品干燥溫度對多糖測定結(jié)果的影響（n=3）樣品實驗條件多糖含量（%）相對平均偏差（%）河南鐵棍山藥105干燥，45提取0.531.3465干燥，45提取0.560.59105干燥，80提取5.710.2365干燥，80提取5.572.53昆明山藥105干燥，45提取0.872.5165干燥，45提取0.713.46105干燥，80提取7.001.0265干燥，80提取6.802.80浙江參薯105干燥，45提取0.650.5865干燥，45提取0.610.34105干燥，80提取14.391.0665干燥，80提取13.693.05福建褐苞薯蕷105干燥，45提取0.

14、441.8265干燥，45提取0.452.36105干燥，80提取8.761.7565干燥，80提取8.880.972.3不同提取溫度下所得溶液碘色反應(yīng)比較結(jié)果（見表4）表4 不同提取溫度下所得溶液碘色反應(yīng)結(jié)果樣品45556065707580100河南鐵棍山藥昆明山藥浙江參薯福建褐苞薯蕷注：“”表示遇碘顯藍(lán)色；“”表示遇碘未顯藍(lán)色上述結(jié)果表明：樣品的干燥溫度對多糖測定結(jié)果影響不大，而水提溫度對于多糖測定結(jié)果影響極大。由結(jié)果可知，當(dāng)水溫由45升至55時，樣品多糖含量分別提高約1.11.4倍；升至65時，樣品多糖含量分別提高約1.41.8倍；而升至80時，河南鐵棍山藥和昆明栽培山藥多糖含量分別提高

15、約8倍、11倍，而褐苞薯蕷和參薯多糖含量更是大幅提高約20倍、22倍；升至100時，兩種山藥樣品多糖含量分別提高12倍、16倍，而褐苞薯蕷和參薯多糖含量則是大幅提高約22倍、24倍。可見在水溫4565的區(qū)間內(nèi)，所有樣品多糖含量基本按相似比例小幅升高，而當(dāng)溫度達到80以上的高溫時，樣品中的多糖含量則是以10倍、20倍的比例大幅激增。這種多糖含量隨樣品提取溫度的升高而大幅度攀升的現(xiàn)象，除去可以用強化了多糖的浸出條件來解釋之外，應(yīng)該在很大程度上還與樣品中所含的大量淀粉有關(guān)。當(dāng)提取溫度高于淀粉糊化溫度時，將導(dǎo)致一部分淀粉被溶出，進而掩蓋了含量本不甚多的雜多糖。這就是為什么熱水提取物主要是葡聚糖6的原因

16、所在。從碘色反應(yīng)結(jié)果可以看出，70是山藥淀粉溶出的一個臨界值，此時多數(shù)樣品中已開始有淀粉溶出。當(dāng)提取溫度高于75時，所有樣品提取液中均已含有淀粉。喬善義等8從商品山藥水煎液中分離到分子量分別為63000和7400Dal.的兩個葡聚糖，經(jīng)波譜法測定，其結(jié)構(gòu)通式為-D-Glc(14)-n。這個結(jié)構(gòu)通式與淀粉一致。具有這類結(jié)構(gòu)的多糖一般易受-淀粉酶的作用而在消化道內(nèi)被水解成葡萄糖，因而不宜視為山藥的活性成分。從這一點上說，在測定山藥多糖含量時，其提取溫度不應(yīng)超過一般淀粉的最低糊化溫度，以本文實驗結(jié)果來看，不宜超過65，以免淀粉溶出，導(dǎo)致結(jié)果大幅度虛高。參考文獻：1 裴鑒等,中國植物志（第16卷，第1

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18、 Hara, Shigeo Ukia. A Glucomannan from the Tubers of Dioscorea japonica Thunb.J. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33(1): 2702756 杭悅宇, 秦慧貞, 丁志遵. 山藥新藥源的調(diào)查和質(zhì)量研究J. 植物資源與環(huán)境, 1992, 1(2): 10157 陶樂平, 吳東儒. 薯蕷多糖的分離、純化、組成及其某些性質(zhì)J. 安徽大學(xué)學(xué)報, 1988, 3: 1028 喬善義, 王立巖, 趙毅民, 等. 山藥多糖的提取分離和結(jié)構(gòu)測定J. 中國天然藥物, 2003, 1(3), 155157Study

19、 on Effect of Temperature Factor in Determination of Polysaccharide from Chinese yamZhang Weiming1, Shan Chengying1, Hang Yueyu2, Jiang Hongfang1, Zhang Jiu1(1, Nanjing Institute for the Comprehensive Utilization of Wild Plant, Nanjing, 210042;2, Institute of Botany, Jiangsu Province and the Chinese

20、 Academy of Sciences, Nanjing, 210014)Abstract: Objective: To investegate the effect of two factors, the temperature in water extraction and the temperature in dry process of raw material, which affect the result of polysaccharide determination. Method: Four species, Dioscorea polystachya from Henan province (Tiegun yam), D. polystachya from Yunnan province (Kunmi