性病實驗室梅毒SOP（可編輯）

1、 山東省皮膚病醫(yī)院性病實驗室操作手冊文件名稱梅毒螺旋體檢測標準操作規(guī)程編 碼頁 數(shù)實施日期制 訂 人審 核 人批準人制訂日期審核日期批準日期目 的：規(guī)范的梅毒螺旋體檢驗操作，確保檢測結(jié)果準確。適用范圍：性病實驗室工作人員責(zé) 任 人：實驗操作者1、標本的采集與處理1.1標本采集的基本要求規(guī)范化。本都應(yīng)當(dāng)被視為具有傳染性，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)戴手套謹慎操作。1.2梅毒標本采集梅毒的實驗室診斷主要有病原體檢測和血清學(xué)檢測方法，各期梅毒的檢測方法及部位見下表。臨床表現(xiàn)取材部位檢查方法一期梅毒潰瘍、淋巴結(jié)、血液暗視野檢查、血清學(xué)檢查二期梅毒皮損、淋巴結(jié)、血液暗視野檢查、血清學(xué)檢查潛伏梅毒血液血清學(xué)檢查三期梅毒血液

2、、腦脊液血清學(xué)檢查神經(jīng)梅毒血液、腦脊液血清學(xué)檢查.1血清標本根據(jù)需要，用一次性真空采血針與促凝采血管抽取靜脈血2-5 ml，室溫靜置1-2小時（或37靜置30分鐘），待血液凝固、血塊收縮后，3000r/min離心10-15分鐘，分離新鮮血清，備用。也可采用保存于2-8或-20的血清。溶血、脂血或污染的標本可影響試驗結(jié)果。.2血漿標本根據(jù)需要，用一次性真空采血針與抗凝采血管抽取靜脈血2-5 ml，輕輕顛倒混勻8-10次，3000r/min離心10-15分鐘，分離血漿，備用。血庫血漿以及edta抗凝血漿同樣可以用于梅毒血清學(xué)實驗（一般僅用于rpr實驗，），但易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)（需用血清復(fù)試），如用其

3、他抗凝劑應(yīng)首先評價后再用。.3末梢全血消毒局部皮膚（成人和1歲以上兒童可選擇手指或耳垂，1歲以下兒童采用足跟部）。一次性采血針刺破皮膚，用無菌棉簽擦掉第一滴血。收集滴出的血液，立即用于檢測。位組織液.1用于病原學(xué)檢查用無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀/刮勺輕刮、擠壓皮損部位，取滲出液與預(yù)先滴加在載玻片上的生理鹽水混合后加蓋玻片立即用于暗視野顯微鏡檢測，或取滲出液直接涂片，用于鍍銀染色試驗。.2用于核酸檢測用無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損表面的污物，鈍刀/刮勺輕刮、擠壓皮損部位，刮取滲出液，加入有dna保存液（1ml/管）的標本管中，備用。無菌操作下穿刺腹股溝淋巴結(jié)，注入0.3

4、ml無菌生理鹽水并反復(fù)抽吸2-3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片后立即進行暗視野鏡檢或備用。操作由專業(yè)人員進行，一般用腰椎穿刺術(shù)獲得。患者側(cè)臥于硬板床，兩手抱膝緊貼腹部，頭向前胸屈曲，使軀干呈弓形，以髂后上棘連線與后正中線的交點為穿刺點，相當(dāng)于第3-4腰椎棘突間隙，消毒處理后，用2%利多卡因自皮膚到椎間韌帶作局部麻醉。術(shù)者用左手固定穿刺皮膚，右手持穿刺針以垂直背部方向緩緩刺入，針尖稍斜向頭部，成人進針深度約4-6cm，兒童約2-4cm。當(dāng)針頭穿過韌帶與硬腦膜時，有阻力突然消失落空感，此時可將針芯慢慢抽出，即可見腦脊液流出，至于合適的容器中，備用。1.3標本接收的標準品與運送單，檢查

5、樣品管有無破損和溢漏。如發(fā)現(xiàn)溢漏應(yīng)立即將尚存留的樣品移出，對樣品管和盛器消毒并做記錄。品的狀況，記錄有無嚴重溶血、微生物污染、脂血以及黃疸等情況。如果樣品污染或者認為樣品不能被接受，應(yīng)將樣品安全廢棄。并將樣品情況立即通知運送機構(gòu)。要求的標本，可以拒絕接受。2、梅毒的實驗室檢查2.1梅毒螺旋體暗視野顯微鏡檢查梅毒螺旋體侵入人體后，在皮膚黏膜下增殖，并很快沿著淋巴管到達附近淋巴結(jié)，經(jīng)過2-4周的潛伏期，在侵入部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，稱為硬下疳，數(shù)天到1周后，淋巴結(jié)腫大。二期梅毒是梅毒螺旋體由局部經(jīng)淋巴結(jié)進入血液，在人體內(nèi)大量播散后而出現(xiàn)的全身表現(xiàn)，一般發(fā)生在感染后的7-10周或硬下疳出現(xiàn)后6-24周，主

6、要為皮膚黏膜損害，有扁平疣、黏膜斑和玫瑰斑疹等?；济范镜脑袐D可以通過胎盤使胎兒受染。研究證明，在妊娠期7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤。其梅毒患者硬下疳、淋巴結(jié)、皮膚黏膜損害以及孕婦羊水中均可檢查到梅毒螺旋體。將標本置于暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上，可使梅毒螺旋體折射出亮光，從而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。.1儀器耗材：暗視野顯微鏡無菌紗布不銹鋼刮刀滅菌棉拭子載玻片、蓋玻片注射器，注射針頭滅菌生理鹽水.2檢測流程將待檢標本制成生理鹽水涂片，加蓋玻片后立即備檢。在預(yù)先調(diào)整好的暗視野顯微鏡的聚光器上加數(shù)滴浸油，輕輕調(diào)低聚光器，使之在載物臺下方。將標本玻片置載物臺上，上升聚光

7、器，使浸油接觸載玻片底面，避免浸油內(nèi)有氣泡。鏡檢：先低倍后高倍，尋找有特征形態(tài)和運動方式的梅毒螺旋體。.1結(jié)果判讀：在暗視野顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)有纖細、白色、有折光的螺旋狀微生物，長6-20um,直徑小于0.2um，有6-14個螺旋，具有旋轉(zhuǎn)、蛇行及伸縮等特征性的運動方式，可判斷為梅毒螺旋體。.2結(jié)果報告：暗視野顯微鏡下若發(fā)現(xiàn)上述特征的梅毒螺旋體則報告陽性結(jié)果；未見到上述特征的梅毒螺旋體則報告陰性結(jié)果。義梅毒螺旋體暗視野顯微鏡檢測陽性在臨床上可確診梅毒，特別是對于有皮膚黏膜損害和淋巴結(jié)病變的一、二期梅毒的診斷具有重要價值，且具有快速，方便，易操作等特點。若未能發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體，不能排除梅毒診斷。陰

8、性結(jié)果原因可能為：標本中的微生物數(shù)量不足（單次的暗視野檢測其敏感性低于50%）、病人已接受治療、皮損已接近自然消退或取自非梅毒性皮損。無論暗視野顯微鏡檢查的結(jié)果如何，都應(yīng)進一步進行血清學(xué)檢測。項取材前，應(yīng)用無菌生理鹽水清潔皮膚表面，取材時應(yīng)注意無菌操作。應(yīng)取到組織滲出液，盡量避免出血，以提高檢出陽性率。取材后應(yīng)立即置暗視野顯微鏡下觀察，如擱置太久，梅毒螺旋體活動能力會下降，導(dǎo)致鏡下難以觀察到陽性結(jié)果。對口腔潰瘍標本，在暗視野顯微鏡下如觀察到梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運動方式，應(yīng)與其他螺旋體相區(qū)別。不加熱血清試驗（trust）梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主迅速對感染早期被損害的自身細胞以及梅毒螺旋體

9、細胞表面所釋放脂類物質(zhì)做出免疫應(yīng)答，在3-4周內(nèi)可產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（亦稱為反應(yīng)素）。這種抗體在體外可與心磷脂、卵磷脂和膽固醇等組成的抗原（0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.90%膽固醇）發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。心磷脂、卵磷脂和膽固醇都是醇溶性脂類，遇水形成膠體溶液。當(dāng)含有反應(yīng)素的梅毒血清與之混合時，即粘附在膠體顆粒的周圍。經(jīng)搖動、碰撞，形成抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)凝集顆粒，即為陽性反應(yīng)。甲苯胺紅不加熱血清試驗即在抗原中加入甲苯胺紅顆粒作為指示物，與待檢血清（漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的紅色絮狀物。血清不需滅活，肉眼可觀察結(jié)果。.1儀器耗材：trust試劑盒水平旋轉(zhuǎn)儀：要求旋轉(zhuǎn)環(huán)狀直徑為2cm，轉(zhuǎn)速為（1002）r/min，并帶有計時器和保濕蓋）無