電融合法制備骨肉瘤融合細(xì)胞瘤苗的特性分析

1、電融合法制備骨肉瘤融合細(xì)胞瘤苗的特性分析 08-05-09 14:42:00 作者：郝新保，范清宇編輯：studa20【摘要】 目的 本研究旨在制備骨肉瘤融合細(xì)胞瘤苗并檢測(cè)其體外生物學(xué)特性。方法 應(yīng)用電融合技術(shù)制備UMR106細(xì)胞與大鼠巨噬細(xì)胞的融合細(xì)胞，經(jīng)過(guò)磁性分選后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合細(xì)胞的DNA含量和表面抗原的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)融合細(xì)胞的克隆形成能力，并體外測(cè)定其誘導(dǎo)CTL的殺傷活性。結(jié)果 電融合與磁性分選技術(shù)相結(jié)合可獲得95%的融合細(xì)胞純度。流式細(xì)胞儀測(cè)定表明，融合細(xì)胞可表達(dá)較高的MHC、類(lèi)抗原。其軟瓊脂克隆形成能力明顯降低（UMR106,29.27.2,融合細(xì)胞，17.65.1,P0

2、.05）,而誘導(dǎo)CTL細(xì)胞殺傷的能力則顯著提高（1001時(shí)UMR106 13.43.2，融合細(xì)胞 42.97.5,P0.05）。結(jié)論 骨肉瘤融合細(xì)胞可穩(wěn)定生長(zhǎng)，在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可用于動(dòng)物模型以檢測(cè)其所誘導(dǎo)的抗骨肉瘤效果。 【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤瘤苗細(xì)胞融合Characterization of Osteosarcoma Vaccine Cells Prepared by Electrical Cell FusionAbstract：Objective Prepare the osteosarcoma vaccine by cell fusion and detect it

3、sbiological properties.Methods The osteosarcoma vaccine was obtained by fusing UMR106 and rat macrophages with electorporator.The DNA and surface antigen expression of fusion cells purified by magnetic cell sorting unit were assayed with flowcytometry.The colony assay of the cells and the analysis o

4、f CTL activity induced by fusion cells in vivo were also performed.Results The higher cell fusion efficiency can be obtained with electroporator and about 95% purity of fusion cells achieved by magnetic cells sorting unit. The fused osteosarcoma cells expressed more MCH、 and formed less colony on so

5、ft arga.Those cell intensively induced the CTL activity against wild UMR106 cells as well.Conclusion The proliferation of fused osteosarcoma cells was stable and the high level CTL activity was induced by them.The cells can be used as vaccine in osteosarcoma treatment evaluation on animal models.Key

6、 words：Osteosarcoma; Tumor vaccine; Cell fusion0 引言 復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移是威脅骨肉瘤患者生命的主要矛盾1,為此，有必要探討主動(dòng)性免疫治療在骨肉瘤患者中應(yīng)用的可能性。由于尚未發(fā)現(xiàn)明確的骨肉瘤特異性抗原，因此將經(jīng)過(guò)修飾的骨肉瘤細(xì)胞作為腫瘤疫苗應(yīng)用于骨肉瘤的治療途徑值得探討2。 本研究應(yīng)用電融合技術(shù)制備骨肉瘤與抗原提呈細(xì)胞（主要是巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞研究另文報(bào)告）的融合細(xì)胞，并對(duì)其相關(guān)的免疫學(xué)特性加以研究，為其作為腫瘤疫苗應(yīng)用于骨肉瘤患者的治療提供理論指導(dǎo)。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 大鼠骨肉瘤細(xì)胞系UMR106購(gòu)自美國(guó)ATCC（American

7、 Tissue Culture Collection）;大鼠MHC、單抗，大鼠巨噬細(xì)胞CD68單抗，羊抗小鼠IgGFITC均為英國(guó)SEROTEC公司出品；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Invitrogen公司生產(chǎn)，3HTdR為上海原子能研究所產(chǎn)品。SD大鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性個(gè)體5只，平均體重136克。ECM2001型細(xì)胞融合儀購(gòu)自美國(guó)BTX公司；MACS磁分選儀和試劑盒由德國(guó)Miltenyi Biotec GmbH生產(chǎn)。1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞和融合細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.3 巨噬細(xì)胞分離 拉頸處死成年SD大

8、鼠，全身70%乙醇滅菌后在超凈臺(tái)中剪開(kāi)腹腔，用滴管加入10ml RPMI1640不完全培養(yǎng)基灌洗，小心吸出培養(yǎng)基1 000r/min,離心5min收集巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。1.4 細(xì)胞融合 應(yīng)用細(xì)胞融合儀按15融合巨噬細(xì)胞和UMR106細(xì)胞。使用3.2mm融合電極，AC為30 V 10s;DC為640 V 30s;2個(gè)脈沖。其他操作參見(jiàn)儀器說(shuō)明書(shū)。1.5 融合細(xì)胞的篩選和分離效果檢測(cè) 應(yīng)用MACS磁性分選儀和MS+分選柱，按CD68單抗分選試劑盒使用說(shuō)明操作，分離出CD68+細(xì)胞。分選出的細(xì)胞做連續(xù)傳代排除未融合的巨噬細(xì)胞，獲得相對(duì)較純的融合細(xì)胞（MUFs

9、）。 將上柱前的細(xì)胞、CD68結(jié)合細(xì)胞和未結(jié)合細(xì)胞各1105個(gè)，用PBS洗1次并懸浮在80l PBS中，加入20l FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,孵育10min后PBS洗2次，在400倍熒光顯微鏡共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞（四個(gè)視野），根據(jù)公式計(jì)算回收率和純度3。 回收率=100(N1P1)/(N0P0),其中N1為洗脫段的細(xì)胞數(shù)，P1為洗脫段陽(yáng)性細(xì)胞百分率，N0為上柱前細(xì)胞總數(shù)，P0為上柱前陽(yáng)性細(xì)胞百分率。1.6 DNA含量測(cè)定和染色體計(jì)數(shù) 1105個(gè)融合細(xì)胞懸浮在200l PBS中加EB染色10min,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA含量。培養(yǎng)的融合細(xì)胞生長(zhǎng)至80%滿(mǎn)時(shí)加秋水仙堿到終濃度為0.25g/ml處

10、理3h,胰酶消化后加0.075mol/L KCL低滲處理細(xì)胞25min,然后用甲醇/冰醋酸（31）固定2次，制片后染色拍照。1.7 細(xì)胞表面抗原的表達(dá) 1105融合細(xì)胞懸浮在80l PBS中，分別加入MHC、和CD68各20l ，4孵育10min,PBS洗2次，加入FITC標(biāo)記的二抗20l，4孵育10min,PBS洗2次，重懸在200l PBS中上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.8 克隆形成率和軟瓊脂克隆形成能力 按300/孔把融合細(xì)胞接種在24孔板中，10天后計(jì)數(shù)已形成的克隆數(shù)，大于30個(gè)細(xì)胞的集落算1個(gè)克隆。按公式計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。 將0.6%底層瓊脂加入24孔板中，每孔1ml，待其凝固后調(diào)整細(xì)胞濃度2103/ml，并在37與0.4%瓊脂混合，按每孔500個(gè)細(xì)胞的量加到底層瓊脂上，37培養(yǎng)2周后計(jì)數(shù)克隆數(shù)。1.9 體內(nèi)誘導(dǎo)殺傷性T淋巴細(xì)胞的能力 分別用融合細(xì)胞和UMR106細(xì)胞接種SD大鼠，2周后取脾。制備脾細(xì)胞懸液，加0.83%氯化銨去除紅細(xì)胞，然后用尼龍毛柱去除B淋巴細(xì)胞。與免疫大鼠時(shí)相對(duì)應(yīng)，在2106個(gè)T淋巴細(xì)胞中分別加入1105個(gè)經(jīng)3 000rad 60 Co滅活的融合細(xì)胞和UMR106細(xì)胞，孵育3天，作為效應(yīng)