通過主客體相互作用構建微流控生物芯片

1、蘇州大學本科生畢業(yè)論文本 科 畢 業(yè) 設 計（論 文）學院(部)材料與化學化工學部題 目通過主客體相互作用構建可再生微流控芯片年 級大四專業(yè)功能材料班 級功能材料學號1409404052姓 名林曉方指導老師劉小莉職稱副教授論文提交日期2018年5月目錄第一章 緒論41.1基于抗污聚合物的生物活性表面41.2基于抗污聚合物的生物活性表面的制備51.2.1抗污聚合物層的制備51.2.2抗污聚合物生物功能化61.3主客體修飾構建生物活性表面71.3.1主客體相互作用71.3.2主客體在表界面上應用81.3.2.1生物傳感器81.3.2.2生物活性表面91.4微流控生物芯片101.4.1微流控技術10

2、1.4.2微流控生物芯片的應用111.4.2.1即時檢測（POTC）111.4.2.2細胞檢測111.5課題的提出121.5.1研究目的及意義121.5.2研究內(nèi)容及實驗方案13第二章 主客體修飾構建微流控生物芯片142.1引言142.2實驗部分152.2.1材料與試劑152.2.2實驗儀器162.2.3實驗方法172.2.3.1OEG-Ada的合成172.2.3.2表面帶有光引發(fā)劑的 PDMS 膜的制備（I-PDMS）172.2.3.3I-PDMS圓片表面可見光引發(fā)接枝OEGMA和OEGMA-Ada172.2.3.4OA-PDMS表面性質(zhì)表征182.2.3.5Ada含量不同的OA-PDMS圓

3、片的制備182.2.3.6CD-Rhodamine結合Ada含量不同的OA-PDMS圓片182.2.3.7OA-PDMS微流道的制備192.2.3.8生物素七取代的-環(huán)糊精包合的OA-PDMS微流道制備192.2.3.9Avidin-FITC吸附測試192.2.3.10表面再生和再應用性能測試192.3結果與分析202.3.1OEGMA-Ada的合成與表征202.3.2OA-PDMS圓片的表征202.3.3不同Ada含量的OA-PDMS圓片上CD-Rhodamine結合量的表征222.3.4 Avidin-FITC吸附和再生性能表征23第三章 結論與展望253.1結論253.2展望25參考文獻

4、27致謝28通過主客體相互作用構建可再生微流控生物芯片摘要：近幾年，微流控技術因其具有的樣品試劑或樣品消耗量少，分析速度快，準確性高等特點受到廣泛關注，并廣泛應用于生物檢測、PCR、細胞研究等領域。微流控芯片的生物功能實現(xiàn)往往需要對表面進行化學修飾，但是傳統(tǒng)的通過共價修飾實現(xiàn)孔道表面生物功能化的方法有著不可逆和損害表面性能的缺陷。而主客體相互作用作為一種動態(tài)的非共價結合方式，可以方便的實現(xiàn)主體分子和客體分子間的可逆結合。通過將主客體相互作用應用于微流控表面修飾，我們期望構建可以靈活實現(xiàn)表面生物功能再生利用的孔道，并進一步應用于廣泛的微流分析領域。在本文中，我們通過光引發(fā)的方式對孔道表面修飾了抗

5、污聚合物刷并引入客體分子Ada，并利用主客體相互作用在孔道表面結合了CD(biotin)7。我們借此研究了孔道表面的蛋白吸附能力，再生性能以及Ada含量對-CD結合量的影響。本研究可分為以下幾部分：（1） 通過簡單共混的方法制備了表面有光引發(fā)劑的PDMS薄膜（I-PDMS），用可見光引發(fā)表面接枝聚合在I-PDMS表面修飾了poly(OEGMA-co-OEG-Ada)無規(guī)共聚物刷，運用WCA、FITR驗證了聚合物刷的成功接枝。（2） 研究了表面接枝的聚合物層中Ada含量與-CD結合量的關系。通過控制Ada投料比來控制Ada含量，研究不同修飾表面結合CD-Rhodamine的效果。熒光顯微鏡測試結

6、果表明，Ada含量過高時，CD-Rhodamine的結合效果反而會出現(xiàn)下降，這可能是由于Ada位阻效應的影響。（3） 利用上述修飾方法進行了微孔道修飾，并利用主客體相互作用結合CD-(biotin)7，進而研究了微孔道對Avidin蛋白的吸附性能和再生能力。實驗結果表明孔道具有蛋白吸附能力，且通過洗脫劑SDS可實現(xiàn)表面再生。關鍵詞：生物活性表面；主客體相互作用；-環(huán)糊精；微流控；可再生 作者：林曉方指導老師：劉小莉 教授Fabrication of regenerable microfluidic chips via host-guest interactionsAbstract:In rec

7、ent years, microfluidic technology has attracted wide attention because of its advantages of less sample consumption, fast analysis speed and high accuracy. So, it has been widely used in bioassay, PCR and cell research. The biofunctionalization of microfluidic chips often requires chemical modifica

8、tion of the surface, but the traditional method of biofunctionalization of the surface by covalent modification has the defects of irreversibility and damage to the surface. As a dynamic non-covalent binding mode, the host-guest interaction can easily realize the reversible binding between the host

9、and guest molecules. By applying the host-guest interaction to the microfluidic surface modification, we hope to construct a channel that can be regenerated, and to further apply it to a wide range of microfluidic analysis fields. In this paper, we modified surface with antifouling polymer brush and

10、 introduced the guest molecule Ada via visible light-induced grafting polymerization, then we combined CD-(biotin)7 on the surface by host-guest interaction. Then, the effects of protein adsorption, regeneration and the influence of Ada content on -CD binding capacity were studied.Firstly, we synthe

11、sized an initiator integrated PDMS (I-PDMS) by a simple thermo curing procedure. Then, the I-PDMS surface was modified by poly(OEGMA-co-OEG-Ada) copolymer brush via visible light-induced grafting polymerization (OA-PDMS). The polymers grafted surfaces were characterized by static water contact angle

12、 (WCA) and Fourier transform infrared reflectance spectroscopy (FTIR).Secondly, we studied the influence of Ada content on the conjugation of -CD .The surfaces with different Ada content were acquired by modulating Ada feed ratio. Then, we incorporated CD-(Rhodamine) into the surface and the incorpo

13、ration was evaluated using fluorescence microscopy. The data of fluorescence microscopy showed that the binding effect of CD-Rhodamine would decrease when the content of Ada was too high, which may result from the effect of Ada steric hindrance.Thirdly, we applied above chemical modification method

14、in microchip and integrated CD-(biotin)7 into the surface. Then, the adsorption of avidin protein and regeneration of microfluidic channels were studied. We find that the modified channel has the ability to adsorb avidin protein and could be regenerated by sodium dodecyl sulfate (SDS).Key words: bio

15、active surface; host-guest interaction; microfluidic chipsWrittened by: Xiaofang LinSupervised by: Xiaoli Liu(Prof.) 第一章 緒論1.1基于抗污聚合物的生物活性表面生物活性表面是在將生物活性分子如糖類、蛋白質(zhì)、核酸等引入材料表面，從而賦予或增強表面生物功能。生物活性表面在醫(yī)學檢測和醫(yī)用材料方面有廣泛的應用。例如Muriel.behra等1制備了能高效分離細菌的MaPoS粒子。他們首先用CaCO3模板制成多孔性PEG凝膠，然后通過苯甲酮光引發(fā)接枝上丙烯酸單體，再接上-NH3+和甘露

16、糖，前者可通過靜電力與檸檬酸修飾的納米氧化物粒子結合，賦予MaPos粒子磁性，后者可結合細菌上的蛋白，可用于臨床診斷和藥物釋放。又如陳紅課題組等2運用LBL技術在硅表面沉積交替沉積上P(AA-co-Ada)/PAH薄膜，再通過主客體相互作用結合上CD-QAS。這種表面有很好的抗菌性能，能殺死99%的黏附細菌，并能通過SDS清除表面黏附的死細菌，實現(xiàn)表面功能的再生。但是，由于生物材料置于復雜的生物介質(zhì)中，往往會發(fā)生非特異性吸附，這稱為污染。這對生物材料的性能有重大的影響，如在植入體材料（骨夾板）上，非特異性蛋白的吸附會導致異體排斥作用，在生物傳感器上，非特異性蛋白的吸附會產(chǎn)生高背景信號和假陽性信

17、號，從而影響檢測的準確性。因此需要制備排斥非特異性蛋白吸附同時有高而可控的特異性蛋白吸附的生物活性表面，即在抗污聚合物層的基礎上引入生物活性分子3?？刮劬酆衔锟煞謨尚噪x子聚合物和親水性聚合物。兩性離子聚合物又可分為聚甜菜堿類和聚兩性電解質(zhì)，兩者區(qū)別在于正負電荷是否在同一單體單元上，而兩者都在納米尺寸上有均勻分布的正負電荷，因此都具有良好的抗污性能。親水性聚合物中應用最普遍的是PEG類聚合物，這是由于PEG能排斥多種蛋白質(zhì)的非特異性吸附。同時，把PEG接在聚合物側鏈上制成高密度的聚合物刷（POEGMA）能提高表面抵抗非特異性蛋白吸附的能力。抗污的原因可歸于表面水合作用和鏈柔性。蛋白吸附到材料表面

18、時，需要排斥表面因氫鍵和溶劑化作用而吸附的水，這會產(chǎn)生滲透排斥力和體積排斥作用。同時，因蛋白吸附在表面時會壓縮聚合物鏈，產(chǎn)生回彈力，兩者共同導致了表面排斥蛋白非特異性吸附。因此可以調(diào)節(jié)聚合物的密度，分子量和化學性質(zhì)，從而影響表面水合作用和鏈柔性，進而控制抗污性能。具有抗污性能的生物活性表面，不僅能排斥非特異蛋白的吸附，同時能提供親水性間隔臂，從而降低配體和受體結合的位阻，進而提高生物活性表面的性能。如今構建生物活性表面的方法主要是在抗污聚合物層上引入生物活性分子，但由于抗污聚合物層往往是化學惰性的，且共價修飾會影響抗污性能和生物活性分子的活性，所以仍需開發(fā)更好的構建生物活性表面的方法。 1.2

19、基于抗污聚合物的生物活性表面的制備1.2.1抗污聚合物層的制備制備抗污聚合物層修飾表面的方法主要有物理方法和化學接枝方法。物理方法主要有物理吸附和表面涂層，原理是通過已知結構的聚合物和材料表面較強的非共價相互作用如氫鍵，靜電力和疏水相互作用把聚合物層束縛在材料表面，實現(xiàn)表面改性，具有代表性的有Langmuir-Blodgett（LB）膜法，旋涂法，噴涂法。這種方法簡單方便且修飾表面均一性好，但由于聚合物層與表面依靠非共價力結合，導致接枝層不穩(wěn)定。化學接枝法包括“grafting to”和“grafting from”,兩種方法，制得表面性質(zhì)各有特點?！癎rafting to”是先制備具有端基活

20、性官能團的已知結構聚合物，然后通過聚合物端基活性官能團與材料表面活性官能團之間的化學反應將聚合物接枝到材料表面上4，具有代表性的方法有巰基和金反應，以及硅氧烷-硅羥基反應。這種方法能很好的控制聚合物層的化學組成，分子量以及分子量分布，還可在表面接枝不同種類的聚合物。但是，由于已接枝的聚合物的長鏈會屏蔽基材表面活性位點，導致聚合物端基活性官能團無法與基材表面活性官能團反應，進而無法獲得高接枝密度的聚合物層，同時也限制了聚合物層的厚度?！癎rafting from”是將引發(fā)劑預先固定在材料表面，然后在一定條件下引發(fā)聚合反應。由于鏈增長是通過聚合物層上端的鏈自由基和小分子單體反應實現(xiàn)的，單體無需克服

21、位阻穿過聚合物層，因此聚合速率快。同時，表面接枝密度高而均勻，聚合物鏈間較強相互作用使抗污聚合物層規(guī)整排列，提高了穩(wěn)定性。其中表面引發(fā)活性自由基聚合由于休眠種的形成降低了自由的濃度使得分子量易于控制和分子量分布窄，常用的方法有可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合（RAFT），單電子轉(zhuǎn)移活性自由基聚合（SET-LRP），原子轉(zhuǎn)移活性自由基聚合（ATRP）。其中，SI-ATRP因其適應單體多，雜質(zhì)和氧氣耐受力強，引發(fā)劑易得而最廣泛使用。如石秀娟5等通過SET-LRP的方法構建了PNIPAAm-co-Ada的接枝的溫敏性表面，研究了單體濃度、催化劑濃度、聚合時間對接枝層厚度的影響，并探究了Ada含量對表面潤

22、濕性和臨界轉(zhuǎn)變溫度（LCST）的影響以及結合-CD后表面潤濕性與溫敏性的變化與Ada含量的關系。她們6還進一步在這種表面上結合上了CD-Mannose和CD-Biotin，并發(fā)現(xiàn)這種表面可通過溫度控制蛋白的吸附量,而LCST又與Ada含量相關，表面還具有很好的特異性和再生性，這可用于微流控生物檢測和生物分子的分離。引發(fā)聚合反應的途徑有引發(fā)劑引發(fā)，熱引發(fā)，光引發(fā)，輻射引發(fā)等。光引發(fā)聚合具有活化能低，反應溫度低的優(yōu)點，這適用于耐熱性較差的生物材料，同時低溫可減少副反應，提高反應產(chǎn)率。而且，可通過光的開關來控制自由基的產(chǎn)生和消失，使聚合物結構有很好的可控性。光引發(fā)又分為紫外光引發(fā)和可見光引發(fā)，可見光

23、引發(fā)避免了對人體和環(huán)境的不良影響。如熊新紅等7提出了一種表面可見光引發(fā)接枝聚合物層的方法（圖1-1），并成功用于不同類型的乙烯基單體接枝。具體方法首先通過簡單混合和固化制得表面有烷基溴的PDMS基材。接著在可見光照射下十羰基二錳（Mn2(CO)10）裂解為Mn（CO）5并奪取PDMS-Br表面烷基溴的溴原子形成 R自由基，原位引發(fā)單體聚合形成聚合物層。這種方法的優(yōu)點是引發(fā)條件溫和（室溫下可見光引發(fā)的）、可用于廣泛的乙烯基單體接枝且聚合過程簡便、快速、高效。圖1-1 可見光引發(fā)PDMS表面接枝聚合改性路線1.2.2抗污聚合物生物功能化抗污聚合物上引入生物活性分子的方法可分為共價修飾和非共價修飾兩

24、種。其中共價修飾又可分為直接共聚和共價后修飾，后者包括側鏈后修飾，嵌段共聚物上段后修飾以及鏈末端后修飾。側鏈后修飾是側鏈上的功能基團如羥基，羧基，環(huán)氧基等被偶聯(lián)劑激活后與生物分子上的基團反應，隨后進行鈍化處理。嵌段共聚物上段后修飾特點是保留了底層聚合物層的抗污性能，同時使生物活性分子集中在表面，這很好的保留了抗污性能，并提高了特異性吸附能力，增進了生物活性表面的性能。鏈末端后修飾因末端基團數(shù)量少且分布不均勻，易移動和被聚合物鏈所包埋，而較少使用。共價后修飾雖應用廣泛但存在如下缺陷：（1）激活過程可能會使聚合物的性質(zhì)如水合性質(zhì)，鏈柔性發(fā)生變化。（2）同時，鈍化過程由于動力學和位阻等限制而無法完全

25、進行，這影響了聚合物層的抗污性能。（3）修飾過程復雜，通常要包括很多步。表面直接共聚含配體（RGD,賴氨酸，甘露糖等）的單體有效的避免了復雜的激活和鈍化過程。但這又增加了合成的復雜性，同時使聚合方法的選擇，聚合物分子量及其分布的控制更加困難。與共價修飾相比，非共價修飾條件溫和，具有可逆性和取向性。特別是主客體后修飾具有可逆性，可控性，簡便，相容性好等特點。如渠陽翠等8通過LBL技術在金表面上交替沉積上PAA-co-Ada/PAH薄膜，再由主客體相互作用結合上了CD-Mannose。這種表面能很好的特異性捕獲E. coil，同時在SDS或高濃度的Mannose溶液中能很好的釋放捕獲的細菌，這在微

26、生物檢測上有重大應用。1.3主客體修飾構建生物活性表面1.3.1主客體相互作用主客體相互作用是一種超分子非共價相互作用力。主體具有和客體形狀相匹配的內(nèi)腔，且能和客體通過互補的相互作用力（氫鍵，范德華力，疏水相互作用）緊密的結合在一起。同時，主體外部基團的溶劑化作用強，這增強了主客體復合物的穩(wěn)定性。主體包括杯芳烴類（calixarenes），冠狀醚類（crown ethers），環(huán)糊精類（cyclodextrins，CDs），葫蘆脲類（cucurbitnurils，CBs）等（圖1-2）。其中CB，CD因其結合力較強和生物相容性好而廣泛應用于生物材料領域。特別是CD的大環(huán)可與客體相結合，而小環(huán)上

27、有豐富的羥基，可以通過點擊化學修飾上不同的生物活性分子實現(xiàn)不同的生物功能而不影響客體的結合，同時配體的密度較高將產(chǎn)生多價效應，從而提升了表面的性能。圖1-2環(huán)糊精，葫蘆脲和杯芳烴的化學結構示意圖1.3.2主客體在表界面上應用1.3.2.1生物傳感器生物傳感器是一種對生物物質(zhì)敏感并能把其濃度轉(zhuǎn)化為電信號進行檢測的儀器。其可分為分子識別和信號轉(zhuǎn)化兩部分，需要將能特異性識別或催化待測物質(zhì)的生物分子固定在傳感器上。通過主客體相互作用引入生物活性分子具有可逆性，因此通過主客體修飾的方法構建生物傳感器可賦予生物芯片可再生性?？稍偕镄酒腥缦聝?yōu)勢：（1）避免更換芯片帶來的人力，物力的損耗，以及引入的人為

28、干擾；（2）保證了檢測過程的連續(xù)性；（3）消除了芯片差異帶來的干擾；（4）使采用有復雜表面結構的高性能芯片成為可能。如胡昌明等9結合LBL技術和主客體相互作用制備能檢測特定蛋白的生物活性表面。他們先在氨基化的硅表面通過聚電解質(zhì)層層自組裝沉積了一層包含客體基團的聚合物薄膜，然后通過主客體相互作用引入七取代生物素修飾的-環(huán)糊精（圖1-3）。該表面表現(xiàn)出對生物素的高選擇性和高特異性，以及很好的再生性能。圖1-3通過LBL技術沉積PAA-co-Ada/PAH多層聚電解質(zhì)薄膜，然后通過主客體相互作用引入生物素修飾的-環(huán)糊精的過程。1.3.2.2生物活性表面 通過主客體相互作用構建生物活性表面有如下優(yōu)點：

29、（1）簡單方便，通過主客體的結合就可賦予表面生物功能，無需復雜的合成和純化過程。（2）條件溫和，在室溫和水溶液環(huán)境下就能完成自組裝，避免使用有毒的有機溶劑，同時主客體的生物相容性好。（3）可逆性，主客體作用是非共價作用力，能在洗脫劑作用下實現(xiàn)分離，可用于構建可再生生物活性表面。（4）刺激響應性，在外界刺激下，超分子結構會發(fā)生轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)主客體的分離和結合，可用于構建適應性好的生物活性表面和模擬復雜的生物體環(huán)境。（5）正交性，可通過結合不同生物分子修飾主體引入不同生物功能，而彼此不影響，可用于構建多功能生物活性表面。（6）可控性，可以控制配體的密度，數(shù)量和位置。（7）適用范圍廣，可適用于形狀，大小

30、，性質(zhì)不同的基材。如曹立敏10等用LBL技術在氨基化基材上沉積含客體基團的多層聚電解質(zhì)薄膜，然后引入不同生物分子修飾的-環(huán)糊精，從而引入不同生物功能。他們通過引入生物素/甘露糖修飾-環(huán)糊精，實現(xiàn)了生物識別功能，通過引入賴氨酸修飾-環(huán)糊精，實現(xiàn)抗凝血功能，通過引入季銨鹽修飾-環(huán)糊精，實現(xiàn)了抗菌功能（圖1-4）。他們發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)LBL膜厚度，能控制-CD的結合量，調(diào)節(jié)-CD/CD-X的比例，能控制CD-X的密度，通過同時引入不同生物分子修飾的-CD，可制備多功能生物活性表面。圖1-4（a）在0.1 mg/ml的相應溶液中浸泡2 h后，不同樣品表面Avidin-FITC,BSA-FITC, Con

31、A-FITC的吸附量。（b）測量表面對405 nm電磁波吸收隨時間的變化來表征不同樣品在血漿中表面血栓的形成情況。（c）左圖：在37 的E.coli懸浮液中浸泡2 h，用活/死細胞染色劑染色后，不同樣品表面熒光強度圖。綠色代表活細胞，黃色或紅色代表死細胞。右圖：不同樣品的細胞致死率（d）表面結合了CD-Q和CD-L后，活/死細胞染色實驗和血栓溶解實驗的結果。1.4微流控生物芯片1.4.1微流控技術微流控技術（microchip）是利用基于微電加工技術（Micro Electro Mechanical System，MEMS）為基礎的微全分析系統(tǒng)（Iniaturized Total Analys

32、is System，uTAS）的概念，把生物，化學，醫(yī)學分析過程的物質(zhì)制備，反應，分離，檢測等操作單元集成到一塊幾厘米的芯片上，自動完成全部實驗和分析過程的技術，是當前uTAS最活躍和前沿的領域，其應用大多與生物相關11。在微流控芯片中，可控流體通過微通道形成網(wǎng)絡得以貫穿整個系統(tǒng)。微流控生物芯片包括基因芯片（Gene chip）、蛋白質(zhì)芯片（protein chip）、細胞芯片（cell chip）和芯片實驗室（Lab-On-a-Chip，LOC），它們具有高靈敏度、分析時間短、同時分析項目多，樣品或試劑用量少，便攜式，靈活性等優(yōu)點。1.4.2微流控生物芯片的應用1.4.2.1即時檢測（POT

33、C）即時檢測對疾病的初步篩選和家庭健康評估方面具有重要應用。即時檢測技術按其原理可分為三類：（1）依靠傳統(tǒng)的分析方法，把試紙浸泡在分析試劑中，干燥后固定在基板上成為診斷試劑條；（2）分析儀器微型化，使其成為便攜式設備；（3）利用生物感應技術，制成生物檢測器。即時檢測技術具有樣品消耗量小，分析速度快，準確性高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但其靈敏度和復雜的操作卻限制了它的應用。比較成熟的應用有血糖儀，原理是血液中的葡萄糖與試紙上固定的試劑發(fā)生顯色反應，然后用眼定性觀察或儀器半定量測量。心肌標志物測讀儀，原理是通過紙層析技術分離分析物，然后通過固定在層析面上的抗體捕獲目標分析物12。1.4.2.2細胞檢測微流

34、控細胞芯片集成了細胞培養(yǎng)，分選，溶解和檢測功能，其技術主要包括細胞操縱，細胞培養(yǎng)和組分分析幾個部分。微流控細胞芯片具有如下優(yōu)點：（1）孔道大小與細胞相近，可實現(xiàn)單細胞乃至細胞器的分析；（2）微尺寸的孔道，多維網(wǎng)絡結構，相對封閉環(huán)境可最大限度的模擬體內(nèi)環(huán)境；（3）把細胞分析的眾多模塊集成到微小的芯片上，有利于連續(xù)分析。如Sunitha Nagrath等13通過微流控細胞芯片成功從血液中分離出濃度極低的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）。這種方法具有高選擇性和特異性，無需預處理，分離得到的CTC產(chǎn)量大，純度高的特點，有望用于早期癌癥檢測和治療效果評估（圖1-5）。圖片1-5通過微流控芯片從全血中分離CTCs：

35、（a）CTC分離所用的設備，樣品通過攪拌器混合并由空氣泵壓入芯片中；（b）在硅表面刻有微柱制成得CTC芯片；（c）全血流經(jīng)微流控芯片的示意圖；（d）從血液中捕獲的NCI-H1650癌細胞的掃描顯微鏡圖像，插圖是癌細胞的放大圖。1.5課題的提出1.5.1研究目的及意義生物活性表面在醫(yī)學檢測和生物醫(yī)用材料方面有重大應用如植入體材料，生物傳感器，生物檢測器等。但生物活性表面處于復雜的生物介質(zhì)中時，往往會發(fā)生非特異性吸附（污染），這會損害表面的性能，因此要求表面具有抗污性能。傳統(tǒng)的方法是在抗污聚合物層上共價修飾上生物活性分子，這具有不可逆的缺陷，且會損害表面的抗污性能和生物活性。而主客體修飾作為一種非

36、共價修飾，具有可逆，作用條件溫和的特點，且能很好的通過調(diào)節(jié)主體上修飾的配體種類，密度和數(shù)量來控制表面性能。如今微流控生物芯片因其樣品和試劑消耗少，分析速度快，準確性高得到廣泛的關注。將兩種技術結合起來制成可再生微流控生物芯片在生物檢測方面有重大應用。1.5.2研究內(nèi)容及實驗方案本實驗中，我們采用共混固化的方法制備了表面有烷基溴的PDMS薄膜。然后，在PDMS基底上通過可見光表面接枝聚合的方法使OEG和OEG-Ada無規(guī)共聚，形成了包含客體的抗污聚合物薄膜，通過FITR,WCA表征表面改性前后性質(zhì)的變化證明了接枝成功。我們還探究了Ada含量對-CD結合量的影響，通過調(diào)節(jié)Ada的投料比來獲得具有不

37、同Ada含量的聚合物薄膜，并結合上CD-Rhodamine，通過熒光密度來比較-CD的結合量。最后，把這種修飾方法用于微流控芯片中，進一步結合了CD(biotin)7，并成功實現(xiàn)了與親和配體Avidin的識別?？椎辣砻婷黠@的熒光證明了蛋白黏附成功，并通過SDS實現(xiàn)了對孔道的再生應用。通過三次的循環(huán)實驗，實驗結果保持穩(wěn)定，證明我們的孔道在再生過程中沒有影響其性能。第二章 主客體修飾構建微流控生物芯片2.1引言固定生物活性分子而獲得或增強特定生物功能的生物活性表面在植入體材料和微生物檢測器方面有重大應用。如占文俊等14構建一種光控細菌的捕獲/釋放的表面，這可用于微生物分離和檢測方面。他們把azo-

38、OEG-SH/OEG-SH混合自組裝到金表面，azo賦予表面光控性和-CD的結合位點，OEG引入抗污性能，巰基則是錨定基團，混合自組裝保證了具有足夠的自由度。在結合了CD-Mannose后表面能特異性捕獲Con A和帶Fim H的細菌，并在365 nm紫外光照射下通過azo的光致異構實現(xiàn)細菌的釋放，并且與Ada協(xié)同作用時釋放率更高。由于生物活性表面與復雜的生物介質(zhì)相接觸，往往會產(chǎn)生非特異性吸附（污染），這會損害表面性能。因此，生物活性表面需要有抗污能力，這要求在抗污聚合物層上引入生物活性分子。傳統(tǒng)的共價修飾的方法雖然穩(wěn)定性好，但共價修飾不可逆且會影響表面抗污性能和降低生物活性分子的活性。而非共

39、價修飾中的主客體后修飾具有很好的可逆性，可控性和條件溫和的優(yōu)點。特別是-環(huán)糊精和金剛烷這一對主客體，有著合適的結合常數(shù)。且-環(huán)糊精的小環(huán)上有豐富的羥基，這不僅能很好調(diào)控配體的種類，數(shù)目和位置，還會產(chǎn)生多價態(tài)效應，從而提高表面性能。如今，微流體技術因其樣品或試劑消耗量少，分析速度快，準確性高而獲得廣泛關注。把主客體后修飾用于構建微流控生物芯片，賦予芯片再生性和可調(diào)性，將極大推動生物傳感器的發(fā)展。如Hao Nan等15制備了一種光控蛋白吸附/釋放微流控芯片。他們首先通過簡單共混制備了GO/PDMS基板，再在表面接枝上溫敏性分子，在NIR照射下，GO粒子吸收光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，溫敏性分子在疏?親水之間

40、轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)蛋白的吸附/釋放，這在生物傳感器和生物分離方面有重大應用。本實驗中，我們首先通過簡單共混的方法把帶雙鍵端基的烷基溴固定在PDMS網(wǎng)絡上，利用催化劑Mn2(CO)10 在可見光輻照裂解生成Mn(CO)5，該自由基奪取I-PDMS表面溴原子形成表面活性自由基 R，進而引發(fā)一定比例的OEGMA和OEG-Ada單體聚合形成含客體基團表面接枝層,其中OEGMA提高了表面的抗污性能，而Ada提供了CD衍生物的結合位點。考慮到Ada位阻的影響，我們控制投料比獲得Ada含量不同的聚合物層，并結合上CD-Rhodamine，通過熒光密度比較找出Ada的最佳含量。之后我們把這種修飾方法用于微流控芯片，通

41、過主客體相互作用結合上CD（biotin）7，親合吸附上Avidin-FITC來檢測蛋白吸附能力，并用SDS洗脫來檢測表面再生能力。2.2實驗部分2.2.1材料與試劑實驗所用到的主要化學樣品，試劑見表2-1。實驗中用到的溶劑購買于國藥集團化學試劑公司，使用前按照標準方法進行純化處理。實驗中用水由Millipore純凈系統(tǒng)進行純化（電阻率18.2 Mcm），用到的氮氣是高純級別（99.999%）。生物素七取代 -環(huán)糊精（-CD- (biotin)7），簡稱 CD(biotin)7，OEGMA-Ada，根據(jù)文獻報道方法合成,結構式如圖2-1所示。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH =7.4）按文獻報道方法

42、配制。表2-1 主要化學試劑基本信息試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA）98%美國 Sigma-Aldrich公司十二烷基硫酸鈉（SDS）95%美國 Sigma-Aldrich公司Avidin-FITC2-4FITC美國 Sigma-Aldrich公司無水甲醇A.R.美國 Sigma-Aldrich公司十羰基二錳（Mn2(CO)10）98%美國 Sigma-Aldrich公司十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）A.R.國藥化試二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O）A.R.國藥化試氯化鈉（NaCl）A.R.國藥化試Sylgard184雙組分10:1美國道康寧公司a寡乙

43、二醇丙烯酸酯（OEGMA）通過Initiator Remover（Sigma公司）除去阻聚劑。 圖2-1CD-(biotin)7，OEGMA-Ada結構式。2.2.2實驗儀器實驗中所用到相關儀器見表2-2。表2-2主要實驗儀器儀器名稱型號生產(chǎn)廠家電子分析天平AL204美國Mettler Toledo公司超純水儀Milli-Q Biosel美國Millipore公司微量移液器P200 P1000美國Gilson公司數(shù)顯鼓風干燥器SB-3200D上海博訊實業(yè)有限公司恒溫培養(yǎng)箱DNP-9052BS-111上海新苗醫(yī)療器械制造公司超聲波清洗器KQ-100E昆山超聲儀器有限公司倒置熒光顯微鏡IX-71日

44、本Olympus公司傅里葉紅外光譜儀Nicolet 6700美國Thermo Fisher Scientific公司全自動接觸角儀SL 200C美國KINO公司超低溫冰箱MDF-U32V日本Sanyo公司2.2.3實驗方法2.2.3.1OEG-Ada的合成稱取寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA,3.6 g,0.01 mol），三乙胺（TEA,1.01 g,0.01mol）和無水二氯甲烷（DCM，40 ml）于100 ml的燒瓶中，用冰水浴冷卻至0 。將1-金剛烷酰氯溶解于10 ml二氯甲烷中，置于滴液漏斗中，在30分鐘內(nèi)逐滴滴加到混合液中。滴加完后，反應液在室溫下攪拌反應過夜。反應完畢后，將混合液轉(zhuǎn)

45、移到分液漏斗中，依次用5%的檸檬酸（50 ml），飽和NaHCO3溶液清洗，向分離后得到的有機層中加無水MgSO4干燥。干燥結束后，溶液過濾除去無水MgSO4，旋蒸得到濃縮液，通過硅膠柱純化，洗脫液為二氯甲烷/甲醇（9:1），得到黃色油狀的OEGMA-Ada。2.2.3.2表面帶有光引發(fā)劑的 PDMS 膜的制備（I-PDMS）稱取組分A（PDMS預聚物）、組分B （交聯(lián)劑）以及組分C（光引發(fā)劑，10-十一烯-2溴異丁酸酯）于一次性塑料杯中（初始質(zhì)量比為10:1:0.13）16。用玻璃棒攪拌使其充分混合，用真空干燥箱抽氣排氣，除盡氣泡。最后，倒入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，在60 成膜箱中固化6

46、 h成膜。2.2.3.3I-PDMS圓片表面可見光引發(fā)接枝OEGMA和OEGMA-Ada 用打孔器制作6到8個直徑為6 mm 的I-PDMS圓片。將I-PDMS圓片分別用去離子水和無水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮氣吹干備用。將寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA，628 mg 1.8 mmol）、乙二醇丙烯酸酯-金剛烷單體（OEGMA-Ada，95.6 mg 0.2 mmol）（初始摩爾比為9:1）、2 mL無水甲醇和I-PDMS 圓片置于10 mL圓底燒瓶中。在避光條件下，加入少量十羰基二錳 （Mn2(CO)10）后鼓氮氣30 min除盡氧氣。然后在室溫下可見光照射引發(fā)表面接枝聚合15 mi

47、n，制得OA-PDMS圓片。最后，分別用去離子水和無水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮氣吹干備用。2.2.3.4OA-PDMS表面性質(zhì)表征用FTIR測定圓片表面接枝改性前后官能團的變化。測試前將PDMS,I-PDMS,OA-PDMS分別用去離子水和無水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮氣吹干備用。測試時，采用衰減全反射檢測器，選擇反射模式，設置分辨率為 4 cm-1 ，每一樣品掃描64次。接著用靜態(tài)水接觸角儀測定PDMS,I-PDMS,OA-PDMS圓片的靜態(tài)水接觸角變化。測試時，將樣品置于載物臺上，室溫下用微量注射器從材料上方將2 uL去離子水滴在樣品表面， 每種樣品平行測試6次以計算

48、平均值和標準平均偏差。 2.2.3.5Ada含量不同的OA-PDMS圓片的制備在總摩爾數(shù)為2 mmol保持不變的條件下，稱取摩爾比不同的OEG和OEG-Ada(質(zhì)量比分別為576 mg:191.2 mg（摩爾比8:2）、648 mg:95.6 mg（摩爾比9:1）、684 mg:47.8 mg（摩爾比95:5）、712.8 mg:9.56mg（摩爾比99:1）)于10 ml的圓底燒瓶中，分別加入2 ml的無水甲醇溶解，再加入4片I-PDMS圓片。在避光條件下，加入催化劑Mn2(CO)10,通氮氣30 min除O2。在室溫下可見光照射15min,制得Ada含量不同的OA-PDMS圓片（20 %O

49、A-PDMS ,10 %OA-PDMS,5 %OA-PDMS,1%OA-PDMS）。取出圓片，分別用去離子水和無水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮氣吹干備用。2.2.3.6CD-Rhodamine結合Ada含量不同的OA-PDMS圓片將上述制得的不同Ada含量的OA-PDMS圓片每種比例各取3個平行樣，置于96孔板中，在避光條件下，分別加入1 ml的濃度為1 mg/ml的CD-Rhodamine溶液，置于室溫下6h，使CD-Rhodamine結合到OA-PDMS圓片上。將圓片轉(zhuǎn)移至48孔板中，使用超純水振蕩清洗5 min，重復清洗3次，氮氣吹干備用。用熒光顯微鏡在圓片上任意區(qū)域拍10張照片

50、，再用Image-Pro Plus 6.0 軟件處理熒光照片。2.2.3.7OA-PDMS微流道的制備采用與制備OA-PDMS圓片相同的方法制備OA-PDMS下基底。將帶有直線型微孔道PDMS上基底和OA-PDMS下基底用大量去離子水和無水乙醇清洗，用氮氣吹干。微流芯片封接時首先將兩種基底放入等離子體清洗儀中，處理1 min，再將帶有孔道的上基底與修飾后下基底封接，放入60 的烘箱中加熱1 h使封接完全。2.2.3.8生物素七取代的-環(huán)糊精包合的OA-PDMS微流道制備用注射器將1 mg/ml CD（biotin）7溶液注射進微流孔道中，在室溫下結合6 h，使CD（biotin）7結合到表面上

51、。吸出CD（biotin）7水溶液，用去離子水反復清洗，除去沒有結合的CD（biotin）7后備用。2.2.3.9Avidin-FITC吸附測試在避光條件下，把Avidin-FITC溶解在PBS緩沖液中，配成濃度為0.1 mg/mL溶液。用注射器將該溶液注入上述微流道中，在 37 的恒溫培養(yǎng)箱中孵育2h。 然后使用PBS緩沖溶液反復清洗，除去物理吸附的Avidin-FITC。用熒光顯微鏡在微流道上任意區(qū)域拍10張照片，再用Image-Pro Plus 6.0 軟件處理熒光照片。2.2.3.10表面再生和再應用性能測試OEGMA-Ada/CD(biotin)7微流道吸附了 Avidin-FITC

52、 之后，在避光條件下，用2 % SDS 反復清洗除去表面結合的CD(biotin)7，再用PBS和去離子水清洗除去SDS溶液。重復2.2.3.8得到再生后的CD(biotin)7孔道。重復2.2.3.9對再生后的孔道蛋白吸附能力進行測試，實驗結果使用熒光顯微鏡進行評估。重復進行三次實驗以測試再生性能的穩(wěn)定性。2.3結果與分析2.3.1OEGMA-Ada的合成與表征我們合成了OEG-Ada單體，其中OEG有很好的抗污性能，Ada則提供了CD衍生物的結合位點。核磁共振氫譜的原理是，在強磁場中原子核的自旋能級發(fā)生裂分，從而能吸收相應頻率的電磁波實現(xiàn)能級躍遷。而由于核外電子屏蔽效應的影響，會產(chǎn)生與化學

53、環(huán)境相應的化學位移。通過對化學位移的分析可獲得被測物的分子結構。核磁共振氫譜如圖：1H NMR (400 MHz, CDCl3) 6.05-6.14 (m,1H), 5.49-5.59 (m, 1H), 4.13-4.17 (m, 4H), 3.32-3.77(m, 32H), 2.05-2.25(m, 7H), 1.85-1.98 (m, 18H) ,1.58-1.78(m, 9H)。分析各處積分比例表明，OEG-Ada的成功合成。（圖2-3）圖2-3 OEG-Ada的核磁結果分析。2.3.2OA-PDMS圓片的表征由于OEGMA上有寡聚乙二醇支鏈，會導致表面的親水性提高。為了證明I-PDM

54、S表面接枝上OEGMA-Ada聚合物薄膜。我們將PDMS，I-PDMS, OA-PDMS小圓片，分別用去離子水和無水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮氣吹干，進行靜態(tài)水接觸角的測試（圖2-4）。結果顯示，PDMS的靜態(tài)水接觸角為111.53.4，I-PDMS的水接觸角為108.32.8，而OA-PDMS的水接觸角大幅度下降為73.96.0。結果表明，I-PDMS潤濕性變化不大，而OA-PDMS的親水性增強，說明是寡聚乙二醇支鏈引起表面親疏水性變化，進而表明聚合物成功修飾到表面。圖2-4 PDMS、I-PDMS和OA-PDMS靜態(tài)水接觸角測試結果對比。由于有機物中官能團能吸收紅外光而引起振動和

55、轉(zhuǎn)動能級的躍遷，通過分析紅外吸收光譜能鑒別有機物中官能團。表面成功修飾上聚合物，會引入新的官能團，因此為了證明聚合物成功修飾到表面，我們對PDMS,I-PDMS,和OA-PDMS表面進行紅外吸收光譜分析（圖2-5）。結果顯示，OA-PDMS在1700 cm-1 附近出現(xiàn)隸屬于酰胺基團的C=O 伸縮振動吸收峰，證明含有OEGMA的聚合物刷成功接枝在PDMS表面。圖2-5 PDMS、I-PDMS和OA-PDMS的紅外吸收光譜。2.3.3不同Ada含量的OA-PDMS圓片上CD-Rhodamine結合量的表征為了探究Ada含量對-CD結合量的影響，我們通過控制投料比獲得Ada含量不同的OA-PDMS

56、圓片，進一步結合上CD-Rhodamine，用熒光顯微鏡拍照并計算熒光密度（圖2-6）。實驗結果如圖：Ada含量不同的OA-PDMS圓片表面熒光強度不同，且10%OA-PDMS圓片表面熒光強度最大。證明Ada含量對-CD的結合量有影響，且在10 %時結合量最大，所以選擇Ada摩爾百分比為10 %進行后續(xù)實驗。這可能是由于在Ada含量較低時，Ada含量提高，-CD結合位點增多，結合量增大，而在Ada含量較高時，Ada排列緊密，產(chǎn)生較大位阻，阻礙了-CD的結合。圖2-6 （a）相應的熒光密度。（b）CD-Rhodamine在Ada含量分別為1%、5%、10%、20%的OA-PDMS表面結合后的熒光

57、照片。2.3.4 Avidin-FITC吸附和再生性能表征生物素（biotin）和親和素（Avidin）之間的結合力很強，一旦結合就很難分開。然而，用SDS解離CD(biotin)7和Ada之間的結合就能洗脫表面吸附的親和素，表面可重新結合修飾有不同生物活性分子的-CD，從而具有再生性能。為了證明修飾完成后的微流道對特異性蛋白質(zhì)的吸附能力，我們在OEGMA-Ada/CD(biotin)7微流道吸附了Avidin-FITC 之后，用熒光顯微鏡拍照（圖2-7）。結果顯示，微流道表面出現(xiàn)強烈的綠色熒光，表明對Avidin-FITC有很強的吸附能力。為了證明表面的再生能力，我們在避光條件下，對大量吸附了Avidin-FITC的微流道用SDS沖洗多次，在熒光顯微鏡下拍照。結果顯示，表面沒有出現(xiàn)綠色熒光，這表明吸附Avidin-FITC被洗掉