醫(yī)學(xué)真菌生物膜研究進(jìn)展

1、biofilms: a new perspective on fungal infection第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚科 廖萬清 它是研究病原真菌和條件致病真菌對它是研究病原真菌和條件致病真菌對人類致病機(jī)制、診斷、治療和預(yù)防的一門重要學(xué)人類致病機(jī)制、診斷、治療和預(yù)防的一門重要學(xué)科，屬交叉、邊緣學(xué)科?？?，屬交叉、邊緣學(xué)科。 特征：多細(xì)特征：多細(xì)胞，有菌絲和孢子，胞，有菌絲和孢子，基本形態(tài)是菌絲基本形態(tài)是菌絲 特征：在感染特征：在感染組織內(nèi)寄生或在組織內(nèi)寄生或在37高高營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)時是酵營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)時是酵母相，在體外腐生和母相，在體外腐生和27培養(yǎng)時呈菌絲相培養(yǎng)時呈菌絲相皮膚癬菌皮膚癬菌 真菌

2、毒素中毒癥：黃曲霉毒素, 鐮刀菌毒 素。 變態(tài)反應(yīng)性疾?。憾嘈涡约t斑，外源性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎。 淺部真菌病: 皮膚及附屬器官感染。 深部真菌病: 局限性及系統(tǒng)性。 各種原因?qū)е抡婢腥净颊咴黾屿o脈插管抗生素的濫用糖尿病、aids病人群的增長免疫抑制劑的廣泛使用體內(nèi)人工植入物的推廣免疫缺陷、免疫力低下等易感人群不斷增多美國流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),1980至1982年與1992至1993年相比,念珠菌病發(fā)病率由2.6/100萬/年上升至72.8/100萬/年;隱球菌病由4.0/100萬增至65.5/100萬/年;曲霉病由8.4/100萬/年增至12.4/100萬/年。北京協(xié)和醫(yī)院1953至1993年間尸

3、檢結(jié)果顯示，后20年深部真菌感染率由1.5%增至5.6%。上述原因?qū)е聶C(jī)會致病真菌感染的病例大幅增加，有許多感染反復(fù)難愈。其中有相當(dāng)多的病例已經(jīng)證實(shí)與真菌的生物膜形成有關(guān)。生物膜(biofilm) 定義：是一種附著于活組織或無活力的組織表面、由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)(extracellular maxtrix,ecm)包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，由ecm以及被其粘連的菌細(xì)胞構(gòu)成。它是相對于游離狀態(tài)菌細(xì)胞而言的另一種微生物的存在方式。它可以保護(hù)菌細(xì)胞，明顯降低隱球菌等致病真菌對抗真菌藥物的敏感性，甚至耐藥。近年來已發(fā)現(xiàn)包括主要的人類致病真菌在內(nèi)的多種真菌可以形成生物膜。念珠菌可以形成生物膜且念

4、珠菌形成的生物膜有對抗宿主防御機(jī)制的作用，并使得念珠菌對臨床常規(guī)抗真菌藥物明顯耐藥。walsh等則最早報(bào)道了一個隱球菌生物膜形成的病例，該病人在心室心房分流術(shù)后心導(dǎo)管表面生長的微生物薄膜經(jīng)培養(yǎng)確定為新生隱球菌，薄膜超微結(jié)構(gòu)符合生物膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，首次證實(shí)新生隱球菌也可以產(chǎn)生生物膜。reynolds 發(fā)現(xiàn)釀酒酵母生物膜的存在。 菌體與支撐物表面的粘附。形成微菌落。微菌落融合并釋放基質(zhì)形成生物膜的基底層?；|(zhì)大量釋放；同時伴隨菌絲和或假菌絲的形成,結(jié)構(gòu)逐漸復(fù)雜。細(xì)菌或真菌細(xì)胞從生物膜釋放出來，形成新的生物膜早 期中 期成熟期生物膜的形成過程生物膜的形成過程(c)成熟期白念珠菌生物膜(生長于聚甲基丙烯

5、酸甲酯片上，熒光顯微鏡下)(a)早期(b)中期生物膜的結(jié)構(gòu)生物膜的結(jié)構(gòu)以白念珠菌生物膜為例。最初的最初的2h：白念珠菌細(xì)胞主要以芽生孢子的形態(tài)附著于支撐物表面。4h后：后：開始形成芽管，出現(xiàn)分散的微菌落，并逐漸融合。中期的開始階段中期的開始階段(1214 h)：主要是以細(xì)胞外基質(zhì)的出現(xiàn)為特點(diǎn)，細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋在真菌微菌落表面，隨時間推移不斷增多，直至將細(xì)胞完全包裹。成熟期：成熟期：形成在細(xì)胞外基質(zhì)包裹下的由孢子、菌絲和假菌絲組成的致密的網(wǎng)狀系統(tǒng)，呈有機(jī)的三維結(jié)構(gòu)。白念珠菌生物膜(生長于義齒樹脂表面，共聚焦掃描激光鏡下)：0 (a), 8 (b), 11 (c), 48 (d) 小時標(biāo)尺均為10m

6、白念珠菌生物膜(長于蓋玻片，24h，掃描電鏡下)注：掃描電鏡操作前的處理 去除了大部分基質(zhì)新生隱球菌的生物膜新生隱球菌的生物膜早早 期：期：酵母細(xì)胞和出芽孢子形成單層結(jié)構(gòu)；中中 期：期：逐漸形成菌落；成熟期：成熟期：產(chǎn)生大量莢膜多糖和細(xì)胞外物質(zhì)，將大量酵母細(xì)胞連成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 早期：早期：a、b 出芽、單層生長中期：中期：c、d 微菌落形成成熟期：成熟期：e、f 莢膜多糖釋放、細(xì)胞外基質(zhì)形成并包裹數(shù)層酵母細(xì)胞c. neoformans b3501生物膜(生長于聚苯乙烯96孔板，光鏡下)成熟的c. neoformans b3501生物膜(生長于蓋玻片，電鏡下)可見多糖物質(zhì)將酵母細(xì)胞連接在一起(

7、箭頭所示)。生物膜的形成受到多種因素影響：附著組織類型、血清成分等，在體外培養(yǎng)則還受到培養(yǎng)基類型的影響。如下所述。血清及組織液的某些成分可促進(jìn)生物膜形成。在相同材質(zhì)的支撐物上，相較與體外生物膜，體內(nèi)生物膜的胞外基質(zhì)更厚，而且體內(nèi)生物膜完全成熟所需要的時間更短。近年來的研究表明，容量感應(yīng)分子在生物膜形成上的重大作用，它使得生物膜不再是浮游細(xì)胞的簡單聚集。白念珠菌的容量感應(yīng)分子有法尼醇(farnesol)和酪醇(tyrosol)。其中法尼醇與生物膜形成有關(guān)，另外它還可以抑制白念珠菌的菌絲化。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用法尼醇處理白念珠菌的黏附細(xì)胞群落可以抑制其生物膜的形成和生長，其作用依賴于濃度和法尼醇處理時的黏

8、附時間。在經(jīng)法尼醇處理的白念珠菌所形成的生物膜中，有274個基因的表達(dá)發(fā)生改變，包括菌絲形成相關(guān)基因、細(xì)胞壁維持相關(guān)基因、細(xì)胞表面疏水性相關(guān)基因以及離子運(yùn)輸相關(guān)基因等。法尼醇是否通過抑制菌絲化來抑制生物膜的形成目前尚不清楚。目前僅有少量證據(jù)：敲除組氨酸激酶基因可以使受法尼醇抑制的白念珠菌同時恢復(fù)菌絲生長和生物膜形成。隱球菌生物膜是由大量多糖基質(zhì)以及分布其中的酵母細(xì)胞組成。隱球菌生物膜的形成依賴于莢膜多糖的釋放及其對支撐物的粘附能力。攜帶alpha放射源的抗莢膜多糖抗體(igg1)可以穿透隱球菌生物膜并使生物膜代謝活性下降50%，而非特異性單抗則無這一效果。pbmcs的存在可以促進(jìn)白念珠菌生物膜

9、的形成。而且它們并不象吞噬游離真菌細(xì)胞一樣吞噬生物膜內(nèi)的真菌細(xì)胞。只有活化的pbmcs才影響生物膜形成，這一作用由pbmcs釋放的可溶性因子介導(dǎo)，具體成分尚不清楚。adh可以抑制念珠菌生物膜。但在許多細(xì)菌(如金葡菌)生物膜中，adh的作用剛好相反。細(xì)菌生物膜中adh表達(dá)增加，活性增高，產(chǎn)生的乙醇增多。因此，細(xì)菌生物膜有可能通過adh表達(dá)的調(diào)節(jié)抑制真菌生物膜的形成和發(fā)展。這可以做為細(xì)菌和真菌之間的一種競爭手段。以白念珠菌為例，還有許多基因有在生物膜的形成和發(fā)展中起作用。缺乏的基因缺乏的基因后果后果pmt生物膜形成障礙mds3、nup85、suv3、tec1、cph1和efg1生物膜形成缺陷ace

10、2細(xì)胞粘附、生物膜結(jié)構(gòu)缺陷、細(xì)胞總量減少凝集素樣(als)基因生物膜結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重缺陷 形成生物膜后，真菌對氟康唑、伊曲康唑、咪康唑、酮康唑、兩性霉素b、氟胞密啶等臨床常用抗真菌藥物和洗必泰等消毒劑的敏感性大大下降。特點(diǎn)：1. 耐受的藥物濃度超出游離細(xì)胞mic的30-2000倍。2. 耐藥性在生物膜形成的早期就出現(xiàn)。3. 隨生物膜的成熟而增強(qiáng)。 生物膜耐藥的機(jī)制尚不明了，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為生物膜耐藥是由多種因素決定的。在生物膜里，細(xì)胞的生長速度已經(jīng)被認(rèn)為是影響藥物敏感性的一個重要調(diào)節(jié)因素。事實(shí)上，所有的抗生素對快速生長的細(xì)胞更有殺傷力。由于營養(yǎng)獲得的限制，生物膜細(xì)胞處于緩慢生長狀態(tài)，導(dǎo)致真菌的代謝降低，

11、尤其是在生物膜的基層，因此表現(xiàn)出細(xì)胞對抗菌藥物不敏感。但這顯然不能完全解釋生物膜抵抗超出正常mic數(shù)十甚至上千倍濃度的耐藥性。 生物膜確實(shí)有減緩藥物滲透的作用。但在用念珠菌各菌種生物膜所做的實(shí)驗(yàn)中，加入藥物3-6h后生物膜邊緣的藥物濃度已達(dá)到或超過mic卻不能殺死生物膜細(xì)胞。包含白念珠菌和表皮葡萄球菌的混合生物膜中，藥物滲透更緩慢。但是即使是這樣，在生物膜邊緣的藥物濃度也常常超過mic。因此藥物滲透不足并不是念珠菌生物膜主要的耐藥機(jī)制。 在游離條件下，白念珠菌抵抗唑類藥物的主要機(jī)制之一是由abc運(yùn)載體*和主要輔助因子#介導(dǎo)的藥物流出泵，即cdr1、cdr2和mdr1。研究表明，在生物膜中兩類流

12、出泵基因均過表達(dá)。* atp-binding cassette transporters， cdr基因編碼# major facilitator, mf，mdr基因編碼缺乏流出泵的菌株所形成的早期生物膜對氟康唑的敏感性大幅增加。但在生物膜逐漸成熟后，缺乏藥物流出泵的菌株同樣耐藥。因此，藥物流出泵只在生物膜形成早期起作用。用羅丹明(rh123)流出檢測分析流出泵的功能也證實(shí)了這一點(diǎn)，即在早期階段，生物膜與游離細(xì)胞的rh123保留量有較大差別，而在后期(12h、48h)則無。 有學(xué)者主張生物膜內(nèi)存在著耐藥的亞群，其生物學(xué)特性與普通菌細(xì)胞不同，由于耐藥亞群的存在使得藥物無法完全清除生物膜。證據(jù)：早期

13、白念珠菌生物膜中的真菌細(xì)胞存在著兩種亞群，它們對洗必泰的敏感性不同，擁有菌絲或假菌絲的細(xì)胞比酵母細(xì)胞更敏感。這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究、證實(shí)。有人發(fā)現(xiàn)植入物(鈦)上的白念珠菌生物膜對兩性霉素b的耐藥性與植入物的表面粗糙程度相關(guān)。過于粗糙或過于光滑都會降低生物膜的耐藥性。其機(jī)理尚不明。 有絲分裂原激活蛋白(mitogen-activated protein, map)激酶 mkc1p活性低的白念珠菌株可以正常產(chǎn)生生物膜，游離細(xì)胞對氟康唑的敏感性也不變，但生物膜對氟康唑的敏感性卻較之野生株有極大的提高。即：mkc1僅增加生物膜的耐藥性，對游離細(xì)胞無影響。這是目前已知唯一有生物膜特異性的耐藥基因。有證據(jù)

14、表明，新生隱球菌生物膜可有效抵抗巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧化性抗微生物分子。另外，體外研究表明，白念珠菌生物膜內(nèi)存在的人pbmcs(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)不僅不吞噬念珠菌細(xì)胞，反而對其生物膜的生長有促進(jìn)作用。這些現(xiàn)象都提示生物膜對宿主的免疫有抵抗作用，生物膜的形成可能是隱球菌形成長期感染的原因之一。1阻止生物膜形成阻止生物膜形成2調(diào)整用藥策略調(diào)整用藥策略3尋找新的靶點(diǎn)尋找新的靶點(diǎn)抗莢膜多糖抗體可以抑制生物膜提示體液免疫可能在抑制有莢膜的微生物生物膜形成方面有一定作用；相關(guān)疫苗和微生物多糖的抗體可能用于防止起搏器等植入物的生物膜形成。已有研究證明植入物表面的粗糙程度對真菌生物膜耐藥性有影響，對植入物材料

15、的研究和改良也有可能在將來減少真菌生物膜形成。1. 聯(lián)合用藥聯(lián)合用藥無論是抗真菌藥聯(lián)合使用或是抗真菌藥物與抗細(xì)菌藥物聯(lián)用均可有效對抗生物膜的耐藥性。我們曾通過對20株新生隱球菌臨床分離株進(jìn)行m27-a藥敏檢測,證實(shí)伊曲康唑與兩性霉素b聯(lián)合用藥可明顯低真菌mic值(見表)。且多數(shù)受試菌株表現(xiàn)為協(xié)同作用或相加作用未觀察到拮抗作用。 伊曲康唑及兩性霉素伊曲康唑及兩性霉素b對對20株新生隱球菌株新生隱球菌mic值平均數(shù)值平均數(shù) （g/ml） 單用 聯(lián)合使用 伊曲康唑 0.2730 0.1195 兩性霉素b 0.6830 0.2102聯(lián)合抗細(xì)菌藥大幅提高兩性霉素b的抗念珠菌生物膜效力與對照組相比的生物膜

16、中活細(xì)胞比例(%)c.kruseic.krusei注：所有菌株均為臨床分離株。2. 新型抗真菌藥物的應(yīng)用新型抗真菌藥物的應(yīng)用新一代的抗真菌藥物如棘白菌素類(卡泊芬凈、米卡芬凈、安多芬凈)以及兩性霉素b脂質(zhì)體均對真菌生物膜有效。棘白菌素主要抑制真菌細(xì)胞壁1,3-d葡萄糖苷的生物合成。已有研究證實(shí)其具備殺滅白念珠菌、新生隱球菌等真菌生物膜的能力。某些化合物可抑制pmt1p的酶活性，可以阻斷生物膜形成的早期階段，因此可能用于阻止白念珠菌的定植和生物膜依賴的耐藥。pmt酶蛋白以雙聚體形式存在，結(jié)合方式涉及一個共同的保守的蛋白質(zhì)區(qū)域，它對pmt復(fù)合物的形成和/或穩(wěn)定性都是必需的。這一pmt蛋白相互結(jié)合的位點(diǎn)為我們提供了一個攻擊真