血清學(xué)反應(yīng)試驗課件

1、血清學(xué)反應(yīng)試驗1 血清學(xué)試驗血清學(xué)試驗 血清學(xué)反應(yīng)試驗2 血清學(xué)試驗 血清學(xué)鑒定： 用已知抗體鑒定未知的細(xì)菌或標(biāo)本中的抗原 血清學(xué)診斷： 用已知抗原檢測血清中的特異性抗體 血清學(xué)反應(yīng)試驗3 抗原（antigen） 是一類能刺激人或動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏是一類能刺激人或動物機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏 淋巴細(xì)胞（免疫原性），并能與這些產(chǎn)物在淋巴細(xì)胞（免疫原性），并能與這些產(chǎn)物在 體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)（反應(yīng)原體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)（反應(yīng)原 性）。性）。 血清學(xué)反應(yīng)試驗4 （一）抗原的性質(zhì)（一）抗原的性質(zhì) 1.1.異物性異物性 異種間的物質(zhì)異種間的物質(zhì) 同種異體間的物質(zhì)同種異體間的物質(zhì) 眼睛

2、水晶體蛋白質(zhì)、精眼睛水晶體蛋白質(zhì)、精 細(xì)胞及甲狀腺球蛋白等細(xì)胞及甲狀腺球蛋白等 自體內(nèi)隔絕物質(zhì)：自體內(nèi)隔絕物質(zhì)： 抗原的性質(zhì) 血清學(xué)反應(yīng)試驗5 抗原的性質(zhì) 3.3.立體化學(xué)結(jié)構(gòu)：一般分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象愈復(fù)雜立體化學(xué)結(jié)構(gòu)：一般分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象愈復(fù)雜 的物質(zhì)，免疫原性愈強(qiáng)。的物質(zhì)，免疫原性愈強(qiáng)。 4.4.抗原決定族抗原決定族antigenic determinant(antigenic determinant(抗原分子表抗原分子表 面上的具有一定化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團(tuán)面上的具有一定化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的特殊化學(xué)基團(tuán)) ) 決定其特異性決定其特異性 2.2.分子量足夠大：一般分子量足夠大：一般10

3、104 4道爾頓道爾頓 血清學(xué)反應(yīng)試驗6 抗原決定族 血清學(xué)反應(yīng)試驗7 人工抗原人工抗原 天然抗原天然抗原 合成抗原合成抗原 異種抗原異種抗原 同種異體抗原同種異體抗原 自身抗原自身抗原 核酸抗原核酸抗原 蛋白質(zhì)抗原蛋白質(zhì)抗原 脂抗原脂抗原 多糖抗原多糖抗原 抗原種類抗原種類 抗原的種類抗原的種類 半抗原（只有反應(yīng)原性而無免疫原性）半抗原（只有反應(yīng)原性而無免疫原性） 完全抗原完全抗原 血清學(xué)反應(yīng)試驗8 微生物抗原成分微生物抗原成分-細(xì)菌抗原成分細(xì)菌抗原成分 菌體抗原菌體抗原: :革蘭氏陰性菌的菌體抗原稱革蘭氏陰性菌的菌體抗原稱O O抗原抗原-脂脂 多糖蛋白質(zhì)的復(fù)合物多糖蛋白質(zhì)的復(fù)合物 微生物抗

4、原微生物抗原 鞭毛抗原稱為鞭毛抗原稱為H H抗原抗原 表面抗原表面抗原: :不同細(xì)菌的表抗原名稱不同不同細(xì)菌的表抗原名稱不同. .大腸桿菌的大腸桿菌的 表面抗原稱為封套抗原或表面抗原稱為封套抗原或K K抗原抗原, ,肺炎雙球菌的叫莢膜肺炎雙球菌的叫莢膜 抗原抗原, ,傷寒沙門氏菌的表面抗原稱為傷寒沙門氏菌的表面抗原稱為ViVi抗原抗原 血清學(xué)反應(yīng)試驗9 細(xì)菌抗原細(xì)菌抗原 細(xì)菌的各種抗原 血清學(xué)反應(yīng)試驗10 微生物抗原微生物抗原 顆粒抗原顆?？乖?組分抗原組分抗原 可溶性抗原可溶性抗原 微生物抗原成分微生物抗原成分-病毒抗原成分病毒抗原成分 血清學(xué)反應(yīng)試驗11 抗體 是由抗原刺激人體或動物體的是

5、由抗原刺激人體或動物體的B B細(xì)胞細(xì)胞, ,由由B B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成細(xì)胞轉(zhuǎn)化成 漿 細(xì) 胞 所 產(chǎn) 生 的 具 有 特 異 性 的 免 疫 球 蛋 白漿 細(xì) 胞 所 產(chǎn) 生 的 具 有 特 異 性 的 免 疫 球 蛋 白 (immunoglobulin,(immunoglobulin,縮寫為縮寫為Ig)Ig) 抗體抗體(antigen) 血清學(xué)反應(yīng)試驗12 抗體種類 IgIg：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量 的的80%80%）和組織液中。）和組織液中。 抗體的結(jié)構(gòu)和種類抗體的結(jié)構(gòu)和種類 IgAIgA：二體：二體 IgDIgD： IgEIgE： IgMIgM：五體

6、：五體 血清學(xué)反應(yīng)試驗13 IgG結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 血清學(xué)反應(yīng)試驗14 IgA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) IgIg：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的13%13%） 和外分泌液中和外分泌液中 血清學(xué)反應(yīng)試驗15 IgM 等結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu) IgIg：血液中：血液中 IgIg：血清中，：血清中，1%1% IgIg：血清中，：血清中，0.002%0.002% 血清學(xué)反應(yīng)試驗16 抗體的產(chǎn)生部位 淋巴器官淋巴器官 一級淋巴器官一級淋巴器官 二級淋巴器官二級淋巴器官 胸腺胸腺 骨髓骨髓 ( (鳥鳥) )法氏囊法氏囊 淋巴結(jié)（約淋巴結(jié)（約500-600個）個） 脾臟脾臟 血清學(xué)反應(yīng)試驗17 抗體在人

7、體中產(chǎn)生部位抗體在人體中產(chǎn)生部位 thymus Bone marrow spleen Lymph node 抗體的存在部抗體的存在部 位位:血清、乳汁、血清、乳汁、 體液體液 血清學(xué)反應(yīng)試驗18 抗抗 體體 作作 用用 血清學(xué)反應(yīng)試驗19 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 （ADCC） 血清學(xué)反應(yīng)試驗20 抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibodyreactionantigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)）是指抗原與相應(yīng) 抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。可發(fā)生于體內(nèi)（抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（invivoinvivo），）

8、， 也可發(fā)生于體外也可發(fā)生于體外(invitro)(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、 中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類 型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補(bǔ)體、固相載體等）不同，型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補(bǔ)體、固相載體等）不同， 可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各 種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體 的檢測中多采用血清

9、作試驗，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血的檢測中多采用血清作試驗，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血 清反應(yīng)（清反應(yīng)（erologicreactionerologicreaction）。）。 血清學(xué)反應(yīng)試驗21 抗原抗體反應(yīng)條件抗原抗體反應(yīng)條件 抗原抗體抗原抗體反應(yīng)條件反應(yīng)條件 抗原抗原 抗體抗體 3. 3. 環(huán)境因素：環(huán)境因素： （1 1）電介質(zhì)：）電介質(zhì)：0.85%NaCI0.85%NaCI； （2 2）溫度：）溫度：3737或或5656 （3 3）pHpH值：值：7.07.0 （4 4）振蕩：）振蕩：適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振蕩適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振蕩 （5 5）反應(yīng)時間反應(yīng)時間 血清學(xué)反應(yīng)試驗22 抗原抗體反應(yīng)一般規(guī)律

10、 特異性和交叉性特異性和交叉性 若兩種抗原之間含有若兩種抗原之間含有部分共同抗原部分共同抗原時，則發(fā)生交叉反時，則發(fā)生交叉反 應(yīng)。應(yīng)。親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度也越高 。 反應(yīng)的可逆性反應(yīng)的可逆性 抗原與抗體的結(jié)合為抗原與抗體的結(jié)合為分子表面的結(jié)合，分子表面的結(jié)合，結(jié)合的適宜溫結(jié)合的適宜溫 度為度為040、pH在在4.09.0范圍內(nèi)。如溫度超過范圍內(nèi)。如溫度超過 60或或pH降到降到3.0以下，或加入解離劑臺硫氰化鉀、以下，或加入解離劑臺硫氰化鉀、 尿素等，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，解離后的尿素等，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，解離后的 抗原或抗體性質(zhì)不改變?？乖蚩贵w性質(zhì)不改變。 血清

11、學(xué)反應(yīng)試驗23 抗原抗體反應(yīng)一般規(guī)律 最適比和帶現(xiàn)象最適比和帶現(xiàn)象 只有抗原與抗體呈適當(dāng)比例時，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合只有抗原與抗體呈適當(dāng)比例時，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合 反應(yīng)。反應(yīng)。 當(dāng)抗原過多或抗體過多，則抗原抗體的結(jié)合不能形成當(dāng)抗原過多或抗體過多，則抗原抗體的結(jié)合不能形成 大的復(fù)合物，因而抑制可見反應(yīng)的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象稱大的復(fù)合物，因而抑制可見反應(yīng)的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象稱 為帶現(xiàn)象。為帶現(xiàn)象。 抗體過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱前帶現(xiàn)象，而抗原過多出抗體過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱前帶現(xiàn)象，而抗原過多出 現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱后帶現(xiàn)象?，F(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱后帶現(xiàn)象。 為了克服帶現(xiàn)象，在進(jìn)行血清學(xué)試驗時，需將抗原或為了克服帶現(xiàn)象，在進(jìn)行血

12、清學(xué)試驗時，需將抗原或 抗體作適當(dāng)稀釋?？贵w作適當(dāng)稀釋。 血清學(xué)反應(yīng)試驗24 抗原抗體反應(yīng)一般規(guī)律 反應(yīng)的二階段性反應(yīng)的二階段性 結(jié)合階段結(jié)合階段-反應(yīng)發(fā)生快，幾秒鐘至幾分鐘反應(yīng)發(fā)生快，幾秒鐘至幾分鐘 。 反應(yīng)階段反應(yīng)階段-較慢，需幾分鐘、幾十分鐘或更長時較慢，需幾分鐘、幾十分鐘或更長時 間間 。 血清學(xué)反應(yīng)試驗25 凝集反應(yīng) 顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅血球等）或顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅血球等）或吸附在乳膠、吸附在乳膠、 白陶土、離子交換樹脂和紅細(xì)胞的抗原白陶土、離子交換樹脂和紅細(xì)胞的抗原與其特異性與其特異性 抗體結(jié)合后，在有電介質(zhì)存在時，凝聚成肉眼可見抗體結(jié)合后，在有電介質(zhì)存在時，凝聚成肉眼可見

13、的凝集小塊。的凝集小塊。 凝集原凝集原凝集素凝集素 直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng) 玻片法玻片法 試管法試管法 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗26 血清凝集試驗 血清學(xué)反應(yīng)試驗27 間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）吸附于與免疫無關(guān)的小將可溶性抗原（或抗體）吸附于與免疫無關(guān)的小 顆粒（載體）表面，加入相應(yīng)的抗體（或抗原），顆粒（載體）表面，加入相應(yīng)的抗體（或抗原）， 在適宜條件下，發(fā)生凝集反應(yīng)。在適宜條件下，發(fā)生凝集反應(yīng)。 載體：動物的紅血球；聚苯乙烯乳膠；矽酸鋁；載體：動物的紅血球；聚苯乙烯乳膠；矽酸鋁； 活性炭等?；钚蕴康取?抗原抗體反應(yīng)類型抗原

14、抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗28 間接血凝試驗間接血凝試驗 間接血凝試驗間接血凝試驗 吸附抗原的紅細(xì)胞就稱為致敏紅細(xì)胞。致敏紅細(xì)胞吸附抗原的紅細(xì)胞就稱為致敏紅細(xì)胞。致敏紅細(xì)胞 與相應(yīng)抗體結(jié)合后，能出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。與相應(yīng)抗體結(jié)合后，能出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 用已知抗原吸附于紅細(xì)胞上檢測未知抗體稱為正向用已知抗原吸附于紅細(xì)胞上檢測未知抗體稱為正向 間接血凝試驗，用已知抗體吸附于紅細(xì)胞上鑒定未間接血凝試驗，用已知抗體吸附于紅細(xì)胞上鑒定未 知抗原稱為反向間接血凝試驗。知抗原稱為反向間接血凝試驗。 常用的紅細(xì)胞有綿羊、家兔、雞及人的常用的紅細(xì)胞有綿羊、家兔、雞及人的O O型紅

15、細(xì)胞。型紅細(xì)胞。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗29 間接血凝抑制試驗間接血凝抑制試驗 間接血凝抑制試驗間接血凝抑制試驗 抗體與游離抗原結(jié)合后就不能凝集抗原致敏的紅抗體與游離抗原結(jié)合后就不能凝集抗原致敏的紅 細(xì)胞，從而使紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象受到抑制，這一試細(xì)胞，從而使紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象受到抑制，這一試 驗被稱為間接血凝抑制試驗驗被稱為間接血凝抑制試驗 。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗30 乳膠凝集試驗乳膠凝集試驗 乳膠凝集試驗乳膠凝集試驗 以乳膠顆粒作為載體的間接凝集試驗，稱為以乳膠顆粒作為載體的間接凝集試驗，稱為

16、 乳膠凝集試驗。該試驗既可檢測相應(yīng)的抗體也可乳膠凝集試驗。該試驗既可檢測相應(yīng)的抗體也可 鑒定未知的抗原，而且方法簡便、快速，在臨床鑒定未知的抗原，而且方法簡便、快速，在臨床 診斷中廣泛應(yīng)用于偽狂犬病、流行性乙型腦炎、診斷中廣泛應(yīng)用于偽狂犬病、流行性乙型腦炎、 鉤端螺旋體病、豬細(xì)小病毒病、豬傳染性萎縮性鉤端螺旋體病、豬細(xì)小病毒病、豬傳染性萎縮性 鼻炎、禽衣原體病、山羊傳染性胸膜肺炎、囊蟲鼻炎、禽衣原體病、山羊傳染性胸膜肺炎、囊蟲 病等的診斷。病等的診斷。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗31 協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗 協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗 葡萄球菌葡

17、萄球菌A蛋白是大多數(shù)金黃色葡萄球菌的蛋白是大多數(shù)金黃色葡萄球菌的 特異性表面抗原，能與多種哺乳動物血清中的特異性表面抗原，能與多種哺乳動物血清中的 IgG分子的分子的Fc片段相結(jié)合，結(jié)合后的片段相結(jié)合，結(jié)合后的IgG仍保持其仍保持其 抗體活性。當(dāng)這種覆蓋著特異性抗體的葡萄球菌抗體活性。當(dāng)這種覆蓋著特異性抗體的葡萄球菌 與相應(yīng)抗原結(jié)合時，可以相互連接引起協(xié)同凝集與相應(yīng)抗原結(jié)合時，可以相互連接引起協(xié)同凝集 反應(yīng)，在玻板上數(shù)分鐘內(nèi)即可判定結(jié)果反應(yīng)，在玻板上數(shù)分鐘內(nèi)即可判定結(jié)果(加圖圖加圖圖 八八)。目前已廣泛應(yīng)用于快速鑒定細(xì)菌、霉形體和。目前已廣泛應(yīng)用于快速鑒定細(xì)菌、霉形體和 病毒等病毒等 抗原抗體

18、反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗32 碳粉凝集試驗碳粉凝集試驗 炭粉凝集試驗炭粉凝集試驗 以極細(xì)的活性炭粉作為載體的間接凝集試驗，以極細(xì)的活性炭粉作為載體的間接凝集試驗， 稱為炭粉凝集試驗。反應(yīng)在玻板上或塑料反應(yīng)盤稱為炭粉凝集試驗。反應(yīng)在玻板上或塑料反應(yīng)盤 進(jìn)行，數(shù)分鐘后即可判定結(jié)果。通常是用抗體致進(jìn)行，數(shù)分鐘后即可判定結(jié)果。通常是用抗體致 敏炭粉顆粒制成炭素血清，用以檢測抗原，如馬敏炭粉顆粒制成炭素血清，用以檢測抗原，如馬 流產(chǎn)沙門氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以檢測流產(chǎn)沙門氏菌；也可用抗原致敏炭粉，用以檢測 抗體，如腺病毒感染、沙門氏菌病、大腸桿菌病、抗體，

19、如腺病毒感染、沙門氏菌病、大腸桿菌病、 囊蟲病等的診斷。囊蟲病等的診斷。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗33 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) （precipitation reaction) 可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂可溶性抗原（如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂 解液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等）解液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等） 與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電介質(zhì)存在下，形成與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電介質(zhì)存在下，形成 肉眼可見的細(xì)微的白色沉淀。肉眼可見的細(xì)微的白色沉淀。 血清學(xué)反應(yīng)試驗34 抗原抗體

20、反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) （precipitation reaction) 可溶性可溶性抗原抗原+相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體 肉眼可見的沉淀肉眼可見的沉淀 血清學(xué)反應(yīng)試驗35 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 環(huán)狀沉淀反應(yīng)環(huán)狀沉淀反應(yīng) 絮狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng) 抗原 沉淀環(huán) 抗血清 抗原抗血清混 合 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 常用于毒素、類毒素常用于毒素、類毒素 和抗毒素的定量測定和抗毒素的定量測定 主要用于抗原的定性試驗，如炭疽主要用于抗原的定性試驗，如炭疽 病的診斷（病的診斷（Ascoli氏試驗）、鏈球氏試驗）、鏈球 菌的血清型鑒定和血跡鑒定等菌的血清型鑒定和血跡鑒定等

21、血清學(xué)反應(yīng)試驗36 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)-凝膠擴(kuò)散試驗?zāi)z擴(kuò)散試驗：1%瓊脂凝膠的孔徑 約85毫微米，可允許各種抗原抗體自由擴(kuò)散。由近及遠(yuǎn)形成 濃度梯度。 單向單擴(kuò)散單向單擴(kuò)散 單向雙擴(kuò)散單向雙擴(kuò)散 抗原 抗血清+瓊脂 抗原 瓊脂 抗血清+瓊脂 血清學(xué)反應(yīng)試驗37 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)-瓊脂擴(kuò)散試驗瓊脂擴(kuò)散試驗： 雙向單擴(kuò)散雙向單擴(kuò)散 雙向雙擴(kuò)散雙向雙擴(kuò)散 抗血清+瓊脂 抗原 沉淀線 孔徑3mm 抗原 待檢血清 標(biāo)準(zhǔn)陽性抗血清 血清學(xué)反應(yīng)試驗38 單向免疫擴(kuò)散 血清學(xué)反應(yīng)試驗39 A：Ag、Ab濃度及擴(kuò)散率近似；B ： Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ； C：

22、Ag、Ab濃度近似，擴(kuò)散率Ag Ab ；D： 擴(kuò)散率近似，濃度Ag Ab ；E： 濃度Ag Ab，擴(kuò)散率Ag Ab ；F：濃度Ag Ab，擴(kuò)散率Ag Ab 沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴(kuò)散率及濃度的關(guān)系 雙向瓊脂擴(kuò)散 血清學(xué)反應(yīng)試驗40 (1) 沉淀線吻合：待檢抗原與沉淀線吻合：待檢抗原與 標(biāo)準(zhǔn)抗原完全相同。標(biāo)準(zhǔn)抗原完全相同。 (2) 沉淀線相切：待檢抗原中沉淀線相切：待檢抗原中 含有與標(biāo)準(zhǔn)抗原相同的抗原，含有與標(biāo)準(zhǔn)抗原相同的抗原， 還含有另外的抗原與抗血清相還含有另外的抗原與抗血清相 對應(yīng)。對應(yīng)。 (3) 沉淀線相交：待檢抗原有沉淀線相交：待檢抗原有 與抗血清對應(yīng)的抗原，但和標(biāo)與抗血清對應(yīng)的抗

23、原，但和標(biāo) 準(zhǔn)抗原不同。準(zhǔn)抗原不同。 (4) 沉淀線部分吻合：待測抗沉淀線部分吻合：待測抗 原和標(biāo)準(zhǔn)抗原性質(zhì)相同，但含原和標(biāo)準(zhǔn)抗原性質(zhì)相同，但含 量較低。量較低。 A1：待檢抗原；A2：標(biāo)準(zhǔn)抗原 雙響瓊脂擴(kuò)散 血清學(xué)反應(yīng)試驗41 抗體效價滴定 用梅花型孔，中間放抗原，用梅花型孔，中間放抗原， 周圍孔放下不同稀釋度的周圍孔放下不同稀釋度的 相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線 的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的最高稀釋倍數(shù)為該抗體 的效價。的效價。 血清學(xué)反應(yīng)試驗42 對流免疫電泳對流免疫電泳 在pH為8.6的瓊脂凝膠板上打孔，兩孔為一組，孔徑3mm，抗原、 抗體孔間距為45mm。將抗原加入負(fù)極端

24、孔內(nèi)，抗體加入正極 端孔內(nèi)，用24mA/cm電流電泳1h左右，觀察結(jié)果，在兩孔之 間出現(xiàn)沉淀帶的為陽性反應(yīng) 。 血清學(xué)反應(yīng)試驗43 在在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白因等電點高，只的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白因等電點高，只 帶有微弱的負(fù)電荷，而且分子又較大，因此電泳力小，帶有微弱的負(fù)電荷，而且分子又較大，因此電泳力小， 小于電滲力，泳向負(fù)極；而一般抗原蛋白質(zhì)常帶較強(qiáng)小于電滲力，泳向負(fù)極；而一般抗原蛋白質(zhì)常帶較強(qiáng) 的負(fù)電荷，分子較小，電泳力大，大于電滲力，泳向的負(fù)電荷，分子較小，電泳力大，大于電滲力，泳向 正極，電泳時抗原放負(fù)極側(cè)，抗體放正極側(cè)，抗原抗正極，電泳時抗原放負(fù)極側(cè)，抗體放正極側(cè)，抗原

25、抗 體相對泳動，一定時間后抗原和抗體將在兩孔之間相體相對泳動，一定時間后抗原和抗體將在兩孔之間相 遇，在比例適當(dāng)處形成肉眼可見的沉淀線。遇，在比例適當(dāng)處形成肉眼可見的沉淀線。 對流免疫電泳原理對流免疫電泳原理 血清學(xué)反應(yīng)試驗44 對流免疫電泳結(jié)果判定 1為陽性 2為弱陽性 3/4為強(qiáng)陽性 血清學(xué)反應(yīng)試驗45 對流電泳方法評價對流電泳方法評價 簡便、快速、敏感度較雙向瓊脂擴(kuò)散試驗高簡便、快速、敏感度較雙向瓊脂擴(kuò)散試驗高 810倍，但分辨力低于雙向瓊脂擴(kuò)散試驗。倍，但分辨力低于雙向瓊脂擴(kuò)散試驗。 血清學(xué)反應(yīng)試驗46 火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis, RIE)

26、 血清學(xué)反應(yīng)試驗47 火箭免疫電泳火箭免疫電泳 火箭免疫電泳是單向單擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的一種血清 學(xué)試驗。是讓抗原在電場的作用下，在含有抗體的瓊脂中 定向泳動，二者比例合適時形成類似火箭樣的沉淀峰。沉 淀峰的高度與抗原的濃度成正比 。 血清學(xué)反應(yīng)試驗48 火箭免疫操作步驟火箭免疫操作步驟 1. 制備抗體瓊脂糖凝膠板制備抗體瓊脂糖凝膠板 將已融化的將已融化的1.2%巴比妥緩沖瓊脂糖冷巴比妥緩沖瓊脂糖冷 卻至卻至55左右，加入適量抗血清，混勻后立即澆板，置室溫凝固。左右，加入適量抗血清，混勻后立即澆板，置室溫凝固。 2. 打孔打孔 在瓊脂凝膠板一側(cè)打孔，孔徑在瓊脂凝膠板一側(cè)打孔，孔徑3mm，孔距

27、，孔距2mm。置瓊脂。置瓊脂 板于電泳槽內(nèi)，搭橋后用微量注射器準(zhǔn)確加樣板于電泳槽內(nèi)，搭橋后用微量注射器準(zhǔn)確加樣10l。 3. 電泳電泳 樣品孔放負(fù)極側(cè)，電壓樣品孔放負(fù)極側(cè)，電壓810V/cm或電流或電流35mA/cm，電，電 泳泳6h。 4. 觀察沉淀峰觀察沉淀峰 電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測量從孔電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測量從孔 中心到峰尖的高度。中心到峰尖的高度。 5. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 以峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)以峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)對數(shù)坐標(biāo))， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待檢樣品內(nèi)抗原濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待檢樣品內(nèi)抗原濃度 血清學(xué)反應(yīng)試驗49

28、火箭免疫結(jié)果火箭免疫結(jié)果 若抗原與抗體比例合適，則孔前出現(xiàn)頂端完全閉合的若抗原與抗體比例合適，則孔前出現(xiàn)頂端完全閉合的 火箭狀沉淀峰；抗原大量過剩時或不形成沉淀峰，或火箭狀沉淀峰；抗原大量過剩時或不形成沉淀峰，或 沉淀峰不閉合；抗原中等過剩時沉淀峰呈圓形；當(dāng)二沉淀峰不閉合；抗原中等過剩時沉淀峰呈圓形；當(dāng)二 者比例不適當(dāng)時，常不能形成火箭狀沉淀峰。者比例不適當(dāng)時，常不能形成火箭狀沉淀峰。 血清學(xué)反應(yīng)試驗50 火箭免疫電泳方法評價火箭免疫電泳方法評價 火箭電泳是一種操作簡便、省時、結(jié)果重復(fù)性好的火箭電泳是一種操作簡便、省時、結(jié)果重復(fù)性好的 定量檢測方法。其敏感度可測定量檢測方法。其敏感度可測0.3

29、mg/L抗原含量，抗原含量， 若低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。如加入少若低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。如加入少 量量125I標(biāo)記的抗原在含抗體的瓊脂板上電泳，形成標(biāo)記的抗原在含抗體的瓊脂板上電泳，形成 的不可見火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用的不可見火箭峰，經(jīng)洗滌干燥后，用X線膠片感光，線膠片感光， 經(jīng)顯影和定影，可呈現(xiàn)同位素顯影，這就是放射自經(jīng)顯影和定影，可呈現(xiàn)同位素顯影，這就是放射自 顯影技術(shù)，可用于微量抗原含量測定，如測定血清顯影技術(shù)，可用于微量抗原含量測定，如測定血清 AFP或或IgE含量，可測至含量，可測至g/L水平。水平。 血清學(xué)反應(yīng)試驗51 免疫電泳免疫電泳(immunoelec

30、trophoresis, IEP) 是將區(qū)帶電泳和雙向瓊脂擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化是將區(qū)帶電泳和雙向瓊脂擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化 學(xué)分析技術(shù)。學(xué)分析技術(shù)。 血清學(xué)反應(yīng)試驗52 免 疫 電 泳 示 意 圖 血清學(xué)反應(yīng)試驗53 免疫電泳操作步驟免疫電泳操作步驟 1. 取潔凈載玻片，澆注融化的瓊脂凝膠，凝固后打孔挖槽。取潔凈載玻片，澆注融化的瓊脂凝膠，凝固后打孔挖槽。 2. 用微量加樣器加待檢標(biāo)本或正常血清對照于孔內(nèi)。用微量加樣器加待檢標(biāo)本或正常血清對照于孔內(nèi)。 3. 電泳條件以電壓電泳條件以電壓46V/cm或電流或電流23mA/cm為宜，電泳為宜，電泳 1.52h。 4. 電泳完畢后，用毛細(xì)滴管在槽內(nèi)

31、加入含相應(yīng)抗原，孵育，電泳完畢后，用毛細(xì)滴管在槽內(nèi)加入含相應(yīng)抗原，孵育， 使抗原抗體雙相擴(kuò)散，形成沉淀線。使抗原抗體雙相擴(kuò)散，形成沉淀線。 5. 觀察沉淀線的數(shù)目、形狀和位置。經(jīng)漂洗、干燥、染色、觀察沉淀線的數(shù)目、形狀和位置。經(jīng)漂洗、干燥、染色、 脫色等步驟制作染色標(biāo)本，可長期保存。例如血漿蛋白免脫色等步驟制作染色標(biāo)本，可長期保存。例如血漿蛋白免 疫電泳。疫電泳。 血清學(xué)反應(yīng)試驗54 免疫電泳方法評價免疫電泳方法評價 免疫電泳分辨率高，可分出人血清中免疫電泳分辨率高，可分出人血清中2030種抗原種抗原 成分，可鑒定混合抗原中各組分。成分，可鑒定混合抗原中各組分。 血清學(xué)反應(yīng)試驗55 補(bǔ)體結(jié)合反

32、應(yīng) 補(bǔ)體特點：補(bǔ)體特點： 補(bǔ)體可與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能單獨與補(bǔ)體可與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能單獨與 抗原或抗體結(jié)合。在有特異抗體存在時可以溶解細(xì)抗原或抗體結(jié)合。在有特異抗體存在時可以溶解細(xì) 胞（溶菌或溶血）。胞（溶菌或溶血）。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型-補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) 有補(bǔ)體參加的抗原抗體反應(yīng)。有補(bǔ)體參加的抗原抗體反應(yīng)。 血清學(xué)反應(yīng)試驗56 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) 抗原抗原 + + 抗體抗體抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物 補(bǔ)體補(bǔ)體 羊紅細(xì)胞羊紅細(xì)胞 + +溶血素溶血素羊紅細(xì)胞溶血素復(fù)合物羊紅細(xì)胞溶血素復(fù)合物 （不溶血）（不溶血） 抗原抗原 + + 抗體抗體 不

33、結(jié)合不結(jié)合 羊紅細(xì)胞羊紅細(xì)胞 + +溶血素溶血素羊紅細(xì)胞溶血素復(fù)合物羊紅細(xì)胞溶血素復(fù)合物 （溶血）（溶血） 補(bǔ)體補(bǔ)體 指示系統(tǒng)： 反應(yīng)系統(tǒng)： 血清學(xué)反應(yīng)試驗57 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗58 標(biāo)記抗原抗體反應(yīng) 可用放射性同位素、熒光素或酶等標(biāo)記抗可用放射性同位素、熒光素或酶等標(biāo)記抗 原或抗體。原或抗體。 抗原抗體反應(yīng)類型抗原抗體反應(yīng)類型 -標(biāo)記抗原抗體反應(yīng)標(biāo)記抗原抗體反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)試驗59 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 是用熒光色素對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，再與相應(yīng)是用熒光色素對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，再與相應(yīng) 抗原或抗體結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光以抗原或抗體結(jié)合，然后在熒光顯微鏡下觀察熒光以

34、 分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。分析示蹤相應(yīng)的抗原或抗體的方法。 常用的熒光色素有異硫氰酸熒光素（常用的熒光色素有異硫氰酸熒光素（FITC），）， 此外還有四乙基羅丹明（此外還有四乙基羅丹明（RB200）、四甲基異硫氰）、四甲基異硫氰 酸羅丹明（酸羅丹明（TMRITC）和三氯三嗪基氨基熒光素）和三氯三嗪基氨基熒光素 （DTAF）等）等 。 血清學(xué)反應(yīng)試驗60 免免 疫疫 熒熒 光光 法法 血清學(xué)反應(yīng)試驗61 熒光標(biāo)記法熒光標(biāo)記法 抗原 抗體 抗原 抗抗體 抗體 直接免疫熒光法直接免疫熒光法 間接免疫熒光法間接免疫熒光法 血清學(xué)反應(yīng)試驗62 酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技術(shù)）酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技

35、術(shù)） 是利用抗原抗體的特異性結(jié)合和酶的高效特異的催化是利用抗原抗體的特異性結(jié)合和酶的高效特異的催化 作用顯色而建立起來的免疫檢測技術(shù)。作用顯色而建立起來的免疫檢測技術(shù)。 常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（常用的標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶（HRP），其作用），其作用 底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，常用的供氫體底物為過氧化氫，催化時需要供氫體，常用的供氫體 有有3，3-二氨基聯(lián)苯胺（二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和鄰苯二胺（）和鄰苯二胺（OPD），）， 前者反應(yīng)后形成不溶性的棕色物質(zhì)，適用于免疫酶組前者反應(yīng)后形成不溶性的棕色物質(zhì)，適用于免疫酶組 化法；后者反應(yīng)后形成可溶性的橙色產(chǎn)物，敏感性高，化法；后者反應(yīng)后

36、形成可溶性的橙色產(chǎn)物，敏感性高， 易被酸終止反應(yīng)，呈現(xiàn)的顏色可數(shù)小時不變，是易被酸終止反應(yīng)，呈現(xiàn)的顏色可數(shù)小時不變，是 ELISA中常用的供氫體。中常用的供氫體。 血清學(xué)反應(yīng)試驗63 酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技術(shù)）酶標(biāo)記抗體技術(shù)（免疫酶技術(shù)） 直接法直接法 用用酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體直接處理含待檢抗原的標(biāo)本，洗滌后浸于含直接處理含待檢抗原的標(biāo)本，洗滌后浸于含 有過氧化氫和有過氧化氫和DAB的顯色反應(yīng)液中作用，然后在普通光學(xué)顯的顯色反應(yīng)液中作用，然后在普通光學(xué)顯 微鏡下觀察顏色反應(yīng)，抗原所在部位呈棕黃色。微鏡下觀察顏色反應(yīng)，抗原所在部位呈棕黃色。 間接法間接法 含待檢抗原的標(biāo)本先用未標(biāo)記的抗血清處理

37、，洗滌后再用含待檢抗原的標(biāo)本先用未標(biāo)記的抗血清處理，洗滌后再用 相應(yīng)的相應(yīng)的酶標(biāo)記抗抗體酶標(biāo)記抗抗體處理，洗滌，然后浸于含有過氧化氫和處理，洗滌，然后浸于含有過氧化氫和 DAB的顯色反應(yīng)液中作用，普通光學(xué)顯微鏡下觀察顏色反應(yīng)，的顯色反應(yīng)液中作用，普通光學(xué)顯微鏡下觀察顏色反應(yīng)， 以指示是否有抗原以指示是否有抗原-抗體抗體-抗抗體復(fù)合物存在抗抗體復(fù)合物存在 。 血清學(xué)反應(yīng)試驗64 酶聯(lián)免疫吸附試驗（簡稱酶聯(lián)免疫吸附試驗（簡稱ELISA） 將抗原或抗體吸附于將抗原或抗體吸附于固相載體固相載體的表面，酶標(biāo)記物的表面，酶標(biāo)記物 與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，形成酶標(biāo)記抗原抗與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，形成酶標(biāo)

38、記抗原抗 體復(fù)合物，在遇到相應(yīng)底物時，結(jié)合物上的酶催體復(fù)合物，在遇到相應(yīng)底物時，結(jié)合物上的酶催 化底物產(chǎn)生水解、氧化或還原等反應(yīng)，從而生成化底物產(chǎn)生水解、氧化或還原等反應(yīng)，從而生成 可溶性或不溶性的有色物質(zhì)，可用肉眼或酶標(biāo)測可溶性或不溶性的有色物質(zhì)，可用肉眼或酶標(biāo)測 定儀判定結(jié)果。顏色的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原定儀判定結(jié)果。顏色的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原 量成正比，因此，可根據(jù)顏色的深淺來定量抗體量成正比，因此，可根據(jù)顏色的深淺來定量抗體 或抗原。或抗原。 血清學(xué)反應(yīng)試驗65 直接法直接法 將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附的將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附的 抗原，加入一定量的抗原

39、，加入一定量的酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體與樣品與樣品(含有抗含有抗 原原)提取液的混合液，競爭溫育后，在固相載體提取液的混合液，競爭溫育后，在固相載體 表面形成抗原表面形成抗原-抗體抗體-酶復(fù)合物。洗除多余部分，酶復(fù)合物。洗除多余部分， 加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降 解應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。通過酶標(biāo)檢測儀，測出酶解應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。通過酶標(biāo)檢測儀，測出酶 底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。 血清學(xué)反應(yīng)試驗66 間接法間接法 將已知抗原吸附在固相載體表面，洗除未吸附抗原，將已知抗原吸附在固相載體表面，

40、洗除未吸附抗原， 加入一定量抗體與待測樣品加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原含有抗原)提取液的混提取液的混 合液，競爭溫育后，在固相載體表面形成抗原合液，競爭溫育后，在固相載體表面形成抗原-抗體抗體 復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗酶標(biāo)記的抗 抗體抗體，與吸附在固體表面的抗原，與吸附在固體表面的抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，抗體復(fù)合物相結(jié)合， 再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物發(fā)生降解再加入酶的底物。在酶的催化作用下底物發(fā)生降解 反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過酶標(biāo)檢測儀測出酶底物反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過酶標(biāo)檢測儀測出酶底物 的降解量，從而推知被測樣品中的抗原

41、量。的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。 血清學(xué)反應(yīng)試驗67 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗 以纖維素薄膜為固相載體，在膜上進(jìn)行免疫酶反以纖維素薄膜為固相載體，在膜上進(jìn)行免疫酶反 應(yīng)。先將抗原或抗體吸附在纖維素膜的表面，通應(yīng)。先將抗原或抗體吸附在纖維素膜的表面，通 過相應(yīng)的抗體或抗原和酶標(biāo)記物的一系列反應(yīng)，過相應(yīng)的抗體或抗原和酶標(biāo)記物的一系列反應(yīng)， 形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，加入底物后，結(jié)合形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，加入底物后，結(jié)合 物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色 物質(zhì)，沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附部位，呈現(xiàn)出物質(zhì)，沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附部位，呈現(xiàn)出 肉眼可見的顏色斑點，試驗結(jié)果可通過顏色斑點肉眼可見的顏色斑點，試驗結(jié)果可通過顏色斑點 的出現(xiàn)與否和色澤深淺進(jìn)行