細胞生物學實驗教案

1、目錄第一部分：普通光學顯微鏡原理與使用 .1附實驗 普通生物顯微鏡的使用及動植物細胞觀察 .6第二部分：特殊顯微鏡原理與使用 .8附：BX51熒光顯微鏡的使用 .17第三部分顯微標本制作技術.20附實驗 人血涂片的制作 29附實驗 石蠟切片技術31附實驗 冷凍切片技術 34第四部分 數(shù)碼顯微攝影技術 36第五部分 細胞器的分離39第六部分 電子顯微鏡原理與使用41第七部分 超薄切片技術47附實驗 電子顯微鏡樣品制備與觀察 56第八部分 掃描電子顯微鏡原理結(jié)構(gòu)及樣品制備技術 6065第一部分：普通光學顯微鏡原理與使用主要內(nèi)容1. 顯微鏡的發(fā)展2. 顯微鏡的光學原理3. 顯微鏡的幾個基本概念4.

2、顯微鏡的結(jié)構(gòu)5. 顯微鏡的使用6. 顯微鏡的維護要知道的幾個重要的分辨率l 人眼：0.2mm/250mml 光學顯微鏡：0.2uml 電子顯微鏡：0.2nm1 顯微鏡的發(fā)明1.1 人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個物體。也就是說，當兩個物體相距不到0.1mm的時候，人眼就會把它們看成是一個物體了。這個極限便稱為人眼的分辨本領。人眼視錐細胞直徑為4微米，對應的視角約為30秒，這個角度就是視角的極限。一般要能清晰的分辨兩個點，視角須在1分以上。高1米的物體距眼睛3400米時，視角為1分。 1.2 放大鏡：約在四百年前眼鏡

3、片工匠們開始磨制放大鏡。當時的放大鏡的放大倍數(shù)只有35x 1.3 顯微鏡： 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。 16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡 19世紀70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。 1850年出現(xiàn)了偏光顯微術； 1893年出現(xiàn)了干涉顯微術； 1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術， 2 顯微鏡的光學原理2.1折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線傳播，當通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律(1) 當物體位于透

4、鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小的倒立實象； (2) 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象； (3) 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象； (4) 當物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象； (5) 當物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠的位置形成放大的直立虛象。2.3顯微鏡的成像原理 顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。 物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于

5、物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像AB。 AB靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。 3 顯微鏡的幾個基本概念3.1 光源：能發(fā)射光波的物體。 可見光頻率范圍：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中對應的波長范圍：390nm 760nm 相應光色：紫、藍、青、綠、黃、橙、紅3.2 分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin a/2 D：分辨率

6、 :光波的波長 N:介質(zhì)折射率 :物鏡孔徑角3.3 孔徑角：由標本上一點發(fā)出的進入物鏡最邊緣光線L和進入物鏡中心光線OA之間的夾角a稱為孔徑角。3.4 數(shù)值孔徑：令NA = nsin a/2, 叫物鏡的數(shù)值孔徑。 數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關系，l越短，NA越大，分辨率越高。3.5 放大率 在顯微鏡下所看到的物像和實際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物鏡、鏡筒長度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應為數(shù)值孔徑的5001000倍。3.6 像差3.7 焦點深度 在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清

7、。這段距離位于顯微鏡焦點的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點深度。3.8 視場數(shù) 目鏡中觀察到的物像的一定范圍叫視野。 顯微鏡的總放大率小的時候所能看到的標本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。 在同一總放大率的條件下視野也可有大小差別。這種差別決定于目鏡的某些性能。首先目鏡的視場光欄的直徑是最主要的條件。視場光欄的直徑叫目鏡的視場數(shù)值3.9 工作距離 工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。 數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。提高顯微鏡分辨率的方法：（1）增大物

8、鏡的數(shù)值孔徑在物鏡和蓋玻片之間充以n 較大的油，如香柏油n =1.52,不僅使n 增大，而且孔徑角a 也增大。（2）用短波長的光照射如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。4 顯微鏡的結(jié)構(gòu) 4.1 物鏡 物鏡(objective)是光學顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領的最關鍵部件。 (1)消色差物鏡(achromat) 色差校正使可見光中紅光和藍光聚焦于一點，而黃綠光則聚焦于另一點。能夠消除光譜中紅光和藍光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時可達到消色差物鏡所要求的光學性能。 (2)復消色差物鏡(apochromat) 是性能最高的物鏡。能消除可視光中黃、紅、藍即包括幾乎所有譜線在成像過程中所造成的

9、色差。 (3)平象物鏡 它們所成的影象基本上是平的，象場彎曲很小，不會發(fā)生視野中心與邊緣不能同時準焦的現(xiàn)象，因此對目視觀察及顯微攝影都極為方便。平象物鏡由于將彎曲的影象展平，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大點。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanach、planapo、plan等字樣。 (4)相差物鏡 相差物鏡(Phasencontrast objective)的一個透鏡片上噴涂著一層環(huán)狀金屬膜板叫相位板。相位板是相差顯微鏡的關鍵部件。它和相差顯微鏡的聚光鏡上的的環(huán)狀光欄相配合使用。有關位相板涂料的性質(zhì)和作用原理在以后詳述。 外殼上刻有Ph標記 4.2 目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大的

10、實象再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實質(zhì)上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。顯微鏡下觀察到的標本大?。簶吮镜囊晥鲋睆?= 目鏡視場數(shù) / 物鏡倍率例: 10X目鏡視場數(shù)為22 物鏡為40X 視場直徑 = 22 40 = 0.55 mm4.3 聚光鏡 聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。 聚光鏡光欄 所謂

11、光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認為光欄。 聚光鏡光欄作用 （1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調(diào)整圖象的分辨率和反差。 （2）輔助調(diào)整亮度。5 光學顯微鏡的使用（1） 實驗時要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應距桌沿 67 cm左右。（2） 打開光源開關，調(diào)節(jié)光強到合適大小。（3） 轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。（4） 將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。（5） 先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過目鏡觀

12、察，并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看清物像。如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄。（6） 瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。（7） 屈光度調(diào)節(jié)（8） 高倍物鏡觀察：把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調(diào)焦手輪進行調(diào)節(jié)。（9） 根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強弱）。（10） 觀察完畢，應先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，

13、并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。6 光學顯微鏡的維護 （1） 顯微鏡要輕拿輕放。（2） 嚴禁將表面有水的載片放到顯微鏡上。（3） 從低倍轉(zhuǎn)入高倍應能看到圖象，否則需轉(zhuǎn)入低倍另行調(diào)節(jié)、查找原因。（4） 每次使用完畢后將將光源亮度調(diào)至最低。（5） 臨時不用顯微鏡只需將光源亮度調(diào)至最低而無需關閉。忌頻繁開關顯微鏡電源。（6） 鏡頭臟污只能用專用工具經(jīng)專門程序清洗。（7） 使用完畢等燈箱冷卻后罩上防塵罩或放入箱內(nèi)，并存于干燥無塵處。注意（1） 塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。（2） 嚴禁用干擦鏡紙擦拭鏡頭。（3） 物鏡嚴禁拆卸并防止振動。（4） 打開電源前應思考題（1） 在使用高倍鏡時

14、，如果把標本片放反了，將會出觀什么問題？為什么？（2） 在低倍鏡調(diào)節(jié)焦距時。當視野中出現(xiàn)了能隨標本片移動而移動的顆?；虬呒y。是否只要調(diào)節(jié)推進器將標本對準物鏡中央，就一定能觀察到標本的物像?為什么? 高倍鏡呢？（3） 你如何分析判斷視野中所見到的污物點是在目鏡上? （4） 用顯微鏡觀察標本,為什么定要從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的順序進行? （5） 在低倍鏡下已看到物像。在轉(zhuǎn)換高倍鏡時卻直接轉(zhuǎn)換不過來，試分析可能有哪些原因? 附實驗 普通生物顯微鏡的使用及動植物細胞觀察一、實驗目的 1 掌握普通生物顯微鏡的使用與維護方法； 2 了解各種動植物細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、特點。二、實驗原理三、實驗材料 各種動植

15、物玻片標本四、實驗方法 1 將顯微鏡從顯微鏡柜中輕輕拿出，右手拿鏡臂，左手托住底座。把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應距桌沿 67 cm左右。 2 先檢查顯微鏡的電源開關是否關閉，亮度調(diào)整電位器是否調(diào)至最小。 3 將電源插頭插入插座，打開光源開關，調(diào)節(jié)光強到合適大小。 4 轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。 5 將所要觀察的玻片標本放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。6 先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片標本。需要注意，不能使物鏡觸及玻片標本，然后，通過目鏡觀察，并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看

16、清物像。 7 如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄使要觀察的部位位于視野中心。 8 瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。 9 屈光度調(diào)節(jié) 10 高倍物鏡觀察：把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調(diào)焦手輪進行調(diào)節(jié)。11 根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強弱）。12 繼續(xù)觀察：低倍物鏡轉(zhuǎn)入光路，換標本。13 觀察完畢，應先將物鏡鏡

17、頭（或高倍鏡頭）從通光孔處移開，并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。五、實驗要求 1 練習將兩眼視野重合； 2 保持兩眼同時睜開； 3 注意屈光度調(diào)整； 4 注意聚光鏡與聚光鏡光欄的調(diào)整。第二部分：特殊生物顯微鏡的原理與使用主要內(nèi)容l 暗視野顯微鏡：微粒外觀（細菌記數(shù)等）l 相差顯微鏡：活細胞標本（細胞培養(yǎng)、膜片鉗等）l 偏光顯微鏡：雙折射物質(zhì)（晶體檢測）l 微分干涉顯微鏡（DIC）：活細胞等（細胞培養(yǎng)，顯微操作等）l 熒光顯微鏡：物質(zhì)鑒定（抗體、抗原、熒光原位雜交等）l 激光共焦掃描顯微鏡：1 暗視野顯微鏡l 根據(jù)丁達爾效應原理設計的一種在黑色背景條件下觀察被檢物體的顯微鏡l 觀

18、察到明場看不到的極其微小的物體l 最高分辨率可達0.004微米1.1 原理 丁達爾現(xiàn)象：在日常生活中，室內(nèi)飛揚的微粒灰塵是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵便粒?？梢娏?，這就是微粒發(fā)光。 暗視野顯微鏡就是利用微粒發(fā)光原理設計的。1.2 結(jié)構(gòu)特點 使用中央遮光板或暗視野聚光器（常用的是拋物面聚光器），使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個視野是黑暗的。1.3成像特點及優(yōu)缺點 在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像，并非物體本身，所以只能看到物體的存在

19、和運動，不能辨清物體的細微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時，并大于12波長，則各級衍射光線同時進入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。 一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀察活細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒的運動等。1.4 應用：微小粒子、細菌形態(tài)、細菌記數(shù)，透明標本觀察等。1.5 暗場顯微鏡的要求（1）要求載玻片和蓋玻片必須無疵痕和灰塵（2）物鏡前透鏡必須清潔無塵（3）載玻片和蓋玻片厚度必須絕對符合要求1.6暗場觀察方式調(diào)節(jié)(1)換上暗場聚光鏡（干燥系或油浸系）并在聚光鏡透鏡上表面滴上鏡頭

20、油。向上緩慢調(diào)升聚光鏡，使鏡頭油與載玻片底面相接觸后。(2)將視場光闌適當縮小，用10X物鏡找到被檢物體，同時在視場中看到視場光圈的輪廓象。上下緩慢調(diào)整聚光鏡，使視場光圈像清晰可見。(3)視場光圈如不在視野中央，可利用聚光鏡外側(cè)兩個調(diào)節(jié)螺絲進行調(diào)整，再將其開大到相應位置。2 相差顯微鏡2.1 原理l 光波有振幅（亮度）、波長（顏色）及相位(指在某一時間上光的波動所能達到的位置)的不同。l 當光通過物體時，如波長和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀察到染色標本的道理。而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本，因細胞各部微細結(jié)構(gòu)的折射率和厚度略有不同，光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變

21、化，僅相位有變化(相應發(fā)生的差異即相位差)，而這種微小的變化，人眼是無法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀察到。l 相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相位差變成振幅差(明暗差)，同時它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀察活細胞或未染色標本。2.2結(jié)構(gòu)特點 l 相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相位板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個合軸調(diào)節(jié)用的望遠鏡。l 環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。l 相位板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線的吸收膜

22、和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。l 調(diào)軸望遠鏡是用來進行合鈾調(diào)節(jié)的。相差顯微鏡在使用時，聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上，必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合（共軛重合），才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。2.3使用方法（1）相差裝置的調(diào)換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長范圍小的單色光線進行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。再從轉(zhuǎn)換

23、器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 （2）調(diào)焦 打開光源，旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤，將“0”對準標示孔，使普通聚光器部分進入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進行對光和調(diào)焦。 旋轉(zhuǎn)環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40X時應用40X標示孔的光闌。（3）合鈾調(diào)整 拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡向內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動望遠鏡內(nèi)筒使其上升，當對準焦點就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)，此時可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與暗環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合。 （4）觀察 換回目鏡，按

24、常規(guī)要領進行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌。2.4用途 用于觀察組織培養(yǎng)中活細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)?；罴毎麩o色透明，一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結(jié)構(gòu)，組織培養(yǎng)研究常用的是倒置相差顯微鏡。3 偏光顯微鏡l 依據(jù)波動光學原理觀察和精密測定標本細節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡l 分辨率可達0.04微米l 將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢,以鑒別某一物質(zhì)具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)3.1、偏振光與自然光3.1.1橫波的偏振性光矢量的振動方向總與光的傳播方向垂直，在垂直于光傳播方向的平面內(nèi),可有不同的振動方向。3.1.2線偏振光-光

25、矢量只在某一固定的方向上振動。3.1.3自然光 普通光源發(fā)出的光,在垂直于傳播方向的平面上,所有可能方向的光矢量E 的振幅都相等。3.2 起偏和檢偏 起偏：使自然光（或非線偏振光）變成線偏振光的過程。檢偏：檢查入射光的偏振性的過程。雙折射現(xiàn)象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光的現(xiàn)象。尼科耳棱鏡。 在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。尋常光線(o光):遵守折射定律。對于晶體一切方向都具有相同的折射率，且在入射面內(nèi)傳播。非常光線(e光):不遵守折射定律。它的折射率隨方向而變化，并且不一定在入射面內(nèi)傳播 。o光和e

26、光都是線偏振光,且振動方向相互垂直二向色性：某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）對光振動有強烈的選擇性吸收能力，這種性質(zhì)稱為二向色性。如電氣石晶體對自然光的某一振動方向上的光振動幾乎完全吸收，而垂直于該方向的光振動只稍微減弱后通過。旋光現(xiàn)象：線偏振光通過某些透明介質(zhì)后，它的光振動方向?qū)⒗@著光的傳播方向旋轉(zhuǎn)某一角度j 的現(xiàn)象，稱為旋光現(xiàn)象。這種介質(zhì)稱為旋光物質(zhì)。如石英、糖、酒石酸鉀鈉等。3.3用途用于研究組織晶體物質(zhì)及纖維等的光學性質(zhì).4 微分干涉相差顯微鏡（DIC）l 無色透明活體標本的細微結(jié)構(gòu)l 圖象呈浮雕狀的立體感l(wèi) 觀察效果更加逼真4.1 原理 通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強度

27、相等的光束，光束載極近的兩點（小于顯微鏡的分辨率）上通過被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺。4.2 特點可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達到理想的效果。5 熒光顯微鏡5.1 原理l 熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學成分等的研究。 l 熒光顯微鏡的基

28、本構(gòu)造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。l 什么是熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。l 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光l 熒光的種類：自發(fā)熒光（固有熒光）二次熒光l 熒光的性質(zhì)： 吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光波長激發(fā)波長（損失熱能） 熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率5.2 熒光顯微鏡的種類： 透射式（現(xiàn)在的熒光顯微鏡主要是落射式） 落射式5.3熒光顯微鏡主要部件落射式吸

29、收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈l 汞燈光源激發(fā)分色吸收l 激發(fā)濾色鏡l 分色鏡l 吸收濾色鏡l 熒光光源: 一般采用超高壓汞燈(50W一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。l 每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光

30、色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。5.4 使用方法 打開燈源，鹵素燈和超高壓汞燈，高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點，且在預熱期間勿關閉。選擇濾色片組合放置標本，尋找觀察點，調(diào)焦。關閉鹵素燈，此時可觀察到樣品發(fā)出的熒光。觀察結(jié)束關閉高壓汞燈。高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經(jīng)10分鐘后才能再啟動，否則會不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。5.5 用途 觀察標本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或以熒光素染色或標記的細胞和結(jié)構(gòu)。 （1） 標本中的熒光物質(zhì)在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生各種顏色的熒光，借以研究該熒光物質(zhì)在細胞和組織內(nèi)的分布。組織中的自發(fā)性熒光物質(zhì)如神經(jīng)細胞和心肌細胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光，肝貯脂細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)

31、的維生素A呈綠色熒光，某些神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光，組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。（2） 細胞內(nèi)的某些成分可與熒光素結(jié)合而顯熒光，如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合，進行細胞內(nèi)DNA含量測定。 （3） 熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究，即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體（一抗或二抗），用該標記抗體直接或間接地與細胞內(nèi)的相應抗原結(jié)合，以檢測該抗原的存在與分布。5.6附：熒光顯微鏡的應用實例 用熒光顯微鏡觀察口腔上皮細胞的線粒體和細胞核熒光探針： Hoechst33342是一種親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞

32、，與DNA特異性結(jié)合，它主要結(jié)合在富含AT區(qū)域的DNA小溝部分。結(jié)合DNA后熒光大大增強，最大激發(fā)光波長約為350nm, 最大發(fā)射光波長約為461nm?？捎糜诨罴毎^察，不需要對細胞作固定及透化處理。 羅丹明123是一種親脂性陽離子熒光探針，也能穿過活細胞的膜。能特異的標記上線粒體。它的最大激發(fā)光波長約507nm，最大吸收光波長約為529nm?？捎盟{光激發(fā)，被標記的線粒體發(fā)出綠色熒光。儀器、材料和試劑儀器：熒光顯微鏡，37溫箱，微量移液器材料：口腔粘膜上皮細胞，載玻片，蓋片，牙簽，濾紙條試劑：PBS(pH 7.4) Ho.33342 （10g/mL，溶于PBS) 羅丹明123 （10g/mL，

33、溶于PBS)實驗 步驟（1）在2張載玻片上分別滴加一滴PBS溶液。（2）用牙簽刮取口腔上皮細胞，分別涂于2張載玻片上（牙簽在液滴中攪勻）。（3）在涂細胞處分別滴加10g/mL的Hoechst.33342或10g/mL的羅丹明123一滴。（4）蓋片室溫暗處孵育1020分鐘。（5）熒光觀察。6 激光掃描共焦顯微鏡技術6.1工作原理：激光掃描顯微鏡是建立在光學顯微鏡及各種掃描顯微鏡基礎上的一種新型的掃描成象系統(tǒng)。利用聚焦的激光束在樣品表面掃描，同時利用光電檢測器件接收樣品反射光（或透射光），樣品結(jié)構(gòu)的變化使反射光（或透射光）強度改變，因而使光電檢測器的輸出電流改變，經(jīng)信號處理，同步顯示在計算機屏幕上

34、。 6.2激光掃描共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別（1）抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像。（2） 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片。（3） 增加側(cè)向分辨率。（4）由于點對點掃描去除了雜散光的影響。（5）對切片厚度無特殊要求 樣品的最大厚度: 取決于物鏡的NA、物鏡的工作距離、激光的穿透力、樣品的透明度、Z軸的最大移動范圍(166mm、Z-wide)。 樣品的最小光切厚度: 取決于物鏡的NA、針孔大小、 Z軸的最小移動步距（40nm）、 Z軸的分辨率（0.35 mm）。 6.3激光掃描共焦顯微鏡的設計特點:（1）點照明，激光光源。（2）具有照明小孔和探測小孔。（3）照明小孔和探測小孔共軛(共

35、焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面。（4）具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像。（5）無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”。（6）真正的三維重組。（7）具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標記物 。6.4激光共聚焦顯微鏡的基本功能三大功能：采集圖象、熒光信號定性和定位、定量測定熒光強度。6.4.1采集和處理圖象 分熒光圖象和光鏡圖象，只有熒光圖象才是真正的共焦圖象。 激光掃描共聚焦顯微鏡的成像特點： （1）保持樣品的完整性（光切片）。 （2）采集多重（波長）熒光分解及合成圖象。 （3）采集的熒光圖象比普通熒光顯微鏡的質(zhì)量好。 （4）可只選擇感興趣的區(qū)域和深度進行掃描。 （5）獲

36、取三維重建圖象。 （6）獲取透射光及反射光圖象。6.4.2 熒光分子的定性和定位 激光掃描共聚焦顯微鏡所觀察到的樣品的熒光可分為三類：樣品內(nèi)源性已知熒光；通過外加已知熒光標記物獲得熒光；樣品內(nèi)源性或外源性的未知熒光。 定性：鑒別并分離出各待測物質(zhì)的特異的熒光信號使之成像。 定位：確定這些熒光信號在樣品中的位置，分為： （1）單熒光定位 樣品染色單一，過程簡單，干擾少，可在藍綠紅任一波長范圍內(nèi)選用單熒光探針(圖示蛋白分布在細胞膜的熒光圖象)（2）多重熒光標記共定位（3）熒光和透射光共定位 6.4.3定量測定 主要項目包括： （1）圖象中任意區(qū)域的熒光強度。 （2）熒光強度隨時間、空間及波長的變化

37、曲線和數(shù)據(jù)。 （3）圖象內(nèi)的幾何參數(shù)，包括面積、厚度、空間距離、體積等。 分：動態(tài)測量和靜態(tài)測量 7 作業(yè)l 制作低倍鏡和高倍鏡觀察用的中央遮光板。l 為什么說倒置、相差顯微鏡是觀察培養(yǎng)活細胞的最有效顯微鏡? l 熒光顯微鏡的兩種濾光片各起什么作用? 附：BX51熒光顯微鏡的使用使用人員須知1.BX51熒光顯微鏡是日元貸款項目購買的大型儀器，使用者需經(jīng)管理人員同意后方可使用，并按照要求認真填寫大型儀器使用記錄。2.開始使用前先填寫使用記錄中的開始時間，并簽名（務必先填寫）。需用熒光觀察的，同時記錄熒光電源上的時間累計起始數(shù)值。3.熒光光源使用請先閱讀熒光觀察部分。4.保證載玻片清潔，上下不能含

38、水或其他液體。5.嚴格按照操作規(guī)程進行操作。6.使用完畢后將物品整理好，補充使用記錄，冷卻10min后蓋好防塵罩。7.違反規(guī)定者，初次停用1周，第二次停用1個月，第三次違反不得再使用本儀器。透射光明場觀察步驟（各部分位置見附圖）1.檢查光強調(diào)節(jié)鈕是否在最小位置2.打開電源開關3.選擇光路目鏡鏡座部分（只進行觀察拉桿全部推入，觀察和照相拉桿放至中央，只進行照相全部拉出）分光鏡組件部分轉(zhuǎn)到5（BF）檢偏器（拉出光路） 聚光鏡部分（多功能轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)至BF，起偏器拉出光路）4.將4X物鏡轉(zhuǎn)入光路（注意：只能通過圖中8進行轉(zhuǎn)換，勿接觸鏡頭）5.放樣品于載物臺上6.調(diào)焦7.調(diào)節(jié)光強8.轉(zhuǎn)入10X物鏡9.調(diào)焦1

39、0.調(diào)節(jié)瞳間距11.調(diào)節(jié)屈光度（短時間使用可不調(diào)）12.調(diào)節(jié)孔徑光闌（參考數(shù)值4X物鏡0.1，10X物鏡0.3，20X物鏡0.5，40X物鏡0.6）13.轉(zhuǎn)入所需物鏡（必須在10X物鏡看清標本情況下方可轉(zhuǎn)入更高倍物鏡）14.調(diào)焦（若看不到標本請轉(zhuǎn)入10X物鏡重新進行，禁止在高倍看不到標本情況下盲目調(diào)焦）15.調(diào)節(jié)光強16.開始觀察附圖：熒光顯微鏡各部分位置圖諾馬斯基微分干涉襯（DIC）觀察步驟 DIC用于未染色標本觀察，圖像有較強的立體感1.檢查光強調(diào)節(jié)鈕是否在最小位置2.打開電源開關3.選擇光路目鏡鏡座部分（只進行觀察拉桿全部推入，觀察和照相拉桿放至中央，只進行照相全部拉出）分光鏡組件部分轉(zhuǎn)

40、到5（BF）檢偏器（推入光路） 聚光鏡部分（多功能轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)至與物鏡放大倍數(shù)相應位置，起偏器推入光路）4.將4X物鏡轉(zhuǎn)入光路（注意：只能通過圖中8進行轉(zhuǎn)換，勿接觸鏡頭）5.放樣品于載物臺上6.調(diào)焦7.調(diào)節(jié)光強8.轉(zhuǎn)入10X物鏡9.調(diào)焦10.調(diào)節(jié)瞳間距11.調(diào)節(jié)屈光度12.調(diào)節(jié)孔徑光闌（參考數(shù)值4X物鏡0.1，10X物鏡0.3，20X物鏡0.5，40X物鏡0.6）13.轉(zhuǎn)入所需物鏡（必須在10X物鏡看清標本情況下方可轉(zhuǎn)入更高倍物鏡）14.將多功能聚光器轉(zhuǎn)到與所用物鏡倍數(shù)相適應位置15.調(diào)焦（若看不到標本請轉(zhuǎn)入10X物鏡重新進行，禁止在高倍看不到標本情況下盲目調(diào)焦）16.調(diào)節(jié)光強17.稍稍轉(zhuǎn)動檢偏器旋

41、鈕，使圖像效果最佳（一般無需調(diào)節(jié)）18.開始觀察反射熒光觀察步驟注：熒光所用光源為高壓汞燈，一只汞燈價格約2500元，壽命約200-300小時，且不能頻繁開關，最好集中觀察。1.打開熒光電源組件主開關（注意：熒光電源打開后約5-10min達到穩(wěn)定；一旦啟動，15min內(nèi)不能關閉；關閉后要再次啟動，至少等汞燈完全冷卻，約需10min）2.按照透射光明場觀察步驟找到要觀察的部位3.關閉顯微鏡部分電源開關（不是熒光電源開關）4.打開光閘5.選擇激發(fā)模塊（根據(jù)所需激發(fā)光波長選擇與之匹配的激發(fā)模塊1-4）6.調(diào)節(jié)熒光光路視場光闌（要求不高時可不調(diào)節(jié)）7.調(diào)節(jié)熒光光路孔徑光闌（要求不高時可不調(diào)節(jié)）8.選擇

42、所需ND濾光片（若熒光過強或熒光易衰減可選擇使用，見附錄1）9.轉(zhuǎn)入所需物鏡（必須在10X物鏡看清標本情況下方可轉(zhuǎn)入更高倍物鏡）10.調(diào)焦（若看不到標本請轉(zhuǎn)入10X物鏡重新進行，禁止在高倍看不到標本情況下盲目調(diào)焦）11.開始觀察第三部分 顯微標本制作技術一、實驗原理 顯微標本的制作技術是組織學，胚胎學，生理學及細胞學等學科研究觀察細胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的一種主要方法。大多數(shù)的生物材料，在自然狀態(tài)下是不適合顯微觀察的，也無法看到其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因為材料較厚，光線不易透過，以致不易看清其結(jié)構(gòu)，另外細胞內(nèi)的各個結(jié)構(gòu)，由于其折射率相差很小，即使光線可透過，也難以辯明。但在經(jīng)過固定，脫水，透明，包埋

43、等手續(xù)后就可把材料切成較薄的片子，再用不同的染色方法就可以顯示不同細胞組織的形態(tài)及其中某些化學成份含量的變化，就可以在顯微鏡下清楚的看到其中不同的區(qū)域組分狀態(tài)，切片也便于保存，所以是教學和科研中常用的方法。二、實驗方法 生物顯微制片有許多不同的方法，一般可分為非切片法與切片法兩大類： 非切片法有涂片、鋪片、壓片、磨片、整裝片等。 切片法又包括石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。 顯微制片技術雖是生物學中很基本的操作技術，但由于生物材料的個體差異，化學試劑的多樣性，因此操作技術相當細致而復雜，方法也很多，每一步驟的失誤都可導致整體的失敗，因此需要耐心細致，不斷總結(jié)經(jīng)驗，才能得到較好的結(jié)果。

44、1非切片法 即不用切片機，不經(jīng)切片手續(xù)而制成切片的方法，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，有不同的處理方法，該類方法操作簡單快捷，其中鋪片法，封藏法可使原有組織結(jié)構(gòu)不被破壞，涂片法，壓片法彌補了用包埋，切片法所不可能觀察清楚的不足，因此是顯微標本制備的中常用的手段。 1.1 涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細胞，再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標本。1.2 鋪片法 主要用于動、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。 如: 洋蔥表皮細胞的鋪片制備。1.3 壓片法 一些較幼嫩，柔軟的材料可

45、將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進行觀察，如植物根尖觀察染色體，花粉粒觀察發(fā)育階段等。1.4 離析法 該方法是利用化學試劑使組織的細胞間質(zhì)溶解，使細胞能分散成單個個體。經(jīng)染色，脫水，透明即可觀察其個體形態(tài)，適用于肌肉，葉片，莖等部位。1.5 磨片(Ground section) 用于很堅硬的組織，如骨和牙。2 、切片法 切片法是必須依靠手或切片機將組織切成薄片來進行觀察的方法，為了能清晰地觀察到動、植物的組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)，必須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分

46、為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟，將其制成永久標本。 下邊以石蠟切片為例，介紹顯微標本的制備方法。2.1 取材 根據(jù)不同的實驗目的，選擇相應的材料，材料要求新鮮、準確、完整，材料要避免擠壓、挫傷、干枯。 所采集材料應立即放入固定劑，并編號，注明采集時間、地點、名稱、組織部位，所取組織塊要大小適當，即要能說明問題，又要考慮固定劑的穿透能力。 一般組織學取材稍大，細胞學取材稍小，植物組織取材稍小，動物組織取材要稍大。2.1.1動物的麻醉和殺死 從活的動物體上采取材料不象采集植物材料那么容易，因為在不施加麻醉的情況下，有的動物會收縮

47、(如蚯蚓、水蛭)，有的會騷動(如蛙、鼠)，使我們無法下手。但制片所需的材料又要求越新鮮越好，尤其是細胞學方面的研究對材料的新鮮程度要求更嚴。因此，要割取生活著的動物組織，在一般情況下，就要對動物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉藥品，必須以不影響細胞結(jié)構(gòu)為原則。 若是一般的組織學制片，要求不太嚴格的話則可將動物先殺死然后速取其組織進行固定。蛙、蟾蜍、鼠等較小的動物，可用斷頭法殺死，即用普通剪刀剪斷頸部。較大的動物，如大竺鼠、免、貓等可用木槌猛擊頭后部，使其昏倒，或用50m1的注射器從耳靜脈向心臟注入空氣，使動物發(fā)生急性空氣栓塞痙攣而死。 上述動物若需麻醉后取材，則可用脫脂棉球蘸

48、氯仿或乙醚、置于動物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大動物(狗、猴等)應用氨基甲酸乙酯作靜脈注射麻醉劑量一般為每kg動物體重用1 g。麻醉后的動物也需放血后進行取材固定。 昆蟲等小動物可投入充滿氯仿或乙醚蒸氣的大口瓶中，令其麻醉。若要殺死，可將其投入含氰化鉀的毒瓶中。 2.1.2動物組織塊的切割 割取動物組織塊時，需注意以下幾點： 第一，要考慮所取的材料應包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)或全部結(jié)構(gòu)，如消化管就應包括粘膜、粘膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)。若所取的器官太大，不易全部制片時，則可切取能代表該器官的部分材料，如狗的腎臟，可切取包括皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂的一部分為材料。 第二，應注意切割方向如在管狀器官(腸等)取材

49、時，一般是取其橫切面制片，但要觀察小腸的環(huán)行皺壁時，就應取其縱切面制片。 第三，組織塊必須切得小而薄。細胞學制片的組織塊不能超過2mm，一般組織塊的大小以0.5*0.5*0.2cm為宜，柔軟組織不易切小,可先取稍大的組織塊固定2 - 3h。等組織稍硬后再切成薄的小塊繼續(xù)固定。2.2固定 割取組織塊后，應立即進行固定。 固定是制片極為關鍵的一個步驟，制片質(zhì)量的優(yōu)劣。除與材料的新鮮程度有關外，還取決于最初的固定是否適當和完全。 2.2.1固定的意義 新鮮的組織被割取后,由于細胞內(nèi)酶的作用和細菌的繁殖，可引起組織的自溶和腐敗。因此，割取組織塊后，應立即采用一 種方法將組織盡可能保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且

50、有利于保存和適于制片的操作，這一步驟稱為固定。固定的目的和作用在于：防止組織自溶和腐?。皇辜毎麅?nèi)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪等各種成分沉淀保存下來從而保存細胞的各種組成成分使其保持與生活時相近似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；因沉淀及凝固的關系，使細胞內(nèi)不同的成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學上的差別使原來在生活情況下看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰易見，且有的固定劑還有助染作用(如醋酸、苦味酸)，從而使細胞各部易于染色；固定劑還兼有硬化作用，使柔軟組織硬化而不易變形，有利于操作。 2.2.2固定的方法 固定有物理方法和化學方法兩種。 物理方法固定有干燥、高熱和低溫騾冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；細菌涂片可用加熱法固定；許多組織化

51、學反應的制片是以低溫騾冷固定作冰凍切片的。 化學方法固定就是用化學試劑配制成固定液使之固定。 2.2.3固定液的選擇 固定液的種類很多。可分為兩大類：簡單固定液和混合固定液。 簡單固定液又稱單純固定液，就是用一種化學試劑作為固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等,它們只是對細胞的某種成分固定得較好；不能將細胞所有的成分都保存下來。如升汞固定蛋白質(zhì)、冰醋酸固定核蛋白、無水乙醇可固定糖原等，單純固定液是有局限性的。 混合固定液就是用幾種化學藥品，按一定的比例混合配制而成的，由于各種藥品的優(yōu)缺點互相彌補，因此可產(chǎn)生較好的效果。2.2.4常用的固定液福爾馬林醋酸酒精混合固定液（FAA液） 是植物制片技術中

52、較為良好的固定液和保存液。除單細胞和絲狀藻類外，均可用此液固定也通用于昆蟲和甲殼類的固定。 FAA液配方： 福爾馬林 5m1 冰醋酸 5m1 50或70酒精 90m1Bouin氏液 是常用的良好固定液，廣泛應用于一般動物組織、昆蟲組織、無脊椎動物的卵和幼蟲，以及胚胎學材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。 Bouin氏液配方： 苦味酸飽和水溶液 75份 福爾馬林 25份 冰醋酸 5份 此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動物組織固定1224h，小塊組織數(shù)小時即可。固定后直接入70酒精中洗去黃色，但留一點黃色對染色并無妨礙。植物材料的固定時間

53、為1248h。2.2.5固定的注意事項 (1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預先準備好的固定液中進行固定，切勿耽誤。 (2)材料大小以直徑不超過5mm為宜，材料與固定液的比例為 1:20。 (3)根據(jù)材料的性質(zhì)和制片的目的選擇固定液。 (4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物質(zhì)，則可用含有酒精的固定液固定。 (5)含有氣泡的材料投入團定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動幾次。也小用抽氣裝置進行抽氣。 (6)固定時，要防止材料變形。 (7)外有被膜，而內(nèi)部站構(gòu)又極易松散的器官，應將整個器官投入固定液22h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)則定。(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理鹽水洗凈