第二章 DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制和修復(fù)

1、第二章 DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制和修復(fù)第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 一、染色體概述一、染色體概述 染色體在不同的細胞周期有不同的形態(tài)表現(xiàn)。在細胞大部分時間的分裂間期表現(xiàn)為染色質(zhì) (chromatin)。染色質(zhì)是細胞核內(nèi)可以被堿性染料著色的一類非定形物質(zhì)。它以雙鏈DNA為骨架，與組蛋白(hilston)、非組蛋白(non-histon)以及少量的各種RNA等共同組成絲狀結(jié)構(gòu)。在染色質(zhì)中，DNA和組蛋白的組成非常穩(wěn)定，非組蛋白和RNA隨細胞生理狀態(tài)不同而有變化。在細胞分裂期，染色質(zhì)纖絲經(jīng)多級螺旋化形成一種有固定形態(tài)的復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)的染色體。 染色體只在細胞分裂期，人們才能在光學(xué)顯微鏡下觀察到這些結(jié)構(gòu)。它們

2、存在于細胞核，呈棒狀的可染色結(jié)構(gòu)，故稱為染色體。細胞分裂時，每條染色體都復(fù)制生成一條與母鏈完全一樣的鏈，形成同源染色體對。 作為遺傳物質(zhì)，染色體具有以下特征：分子結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；能夠自我復(fù)制，使親代、子代之間保持連續(xù)性；能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成； 能夠產(chǎn)生可遺傳的變異。 第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 二、原核生物的染色體 1細菌染色體形態(tài)結(jié)構(gòu) 大腸桿菌染色體長為1 333m，而要裝入長約2m寬1m的細胞中，為此DNA必定以折疊或螺旋狀態(tài)存在。有實驗證明：在DNA分子進行折疊或螺旋過程中還依賴于RNA分子的作用。如300m的環(huán)狀DNA（圖2-1A），通過RNA分子的連接作用將DNA片段結(jié)合起來形成環(huán)（l

3、oop），從而導(dǎo)致DNA長度縮小成為25m（圖2-1B），在活體大腸桿菌染色體上約有50多個這樣的環(huán)。接著每個環(huán)內(nèi)DNA進一步螺旋，使DNA長度進一步縮短為1.5m，而形成更高級結(jié)構(gòu)的染色體（圖2-1C）。因此，細菌的染色體不是一條裸露的DNA鏈，而是以高度的組裝形式存在，同時這種組裝不僅為了適應(yīng)細菌細胞的狹小空間，而且還要有利于染色體功能的實現(xiàn)，便于染色體復(fù)制和基因表達。第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 圖2-1 大腸桿菌（E. coli）染色體的基本結(jié)構(gòu) 第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 2原核生物DNA基因組的組織結(jié)構(gòu)特點 （1）結(jié)構(gòu)簡練 原核DNA分子的絕大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部

4、分不轉(zhuǎn)錄，這與真核DNA的冗余現(xiàn)象不同。 （2）基因種類和數(shù)量較少 原核細胞中染色體一般只有一條雙鏈DNA分子，且大都帶有單拷貝基因，且多以重疊基因的形式存在，只有很少數(shù)基因（如rRNA基因）是以多拷貝形式存在的；整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調(diào)控序列所組成；幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對應(yīng)狀態(tài)。 （3）以操縱子為轉(zhuǎn)錄單元 原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往叢集在基因組的一個或幾個特定部位，形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，它們可被一起轉(zhuǎn)錄為含多個mRNA的分子，叫多順反子mRNA。X174及G4基因組中就含有數(shù)個多順反子。功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條

5、多順反子mRNA鏈，然后再翻譯成各種蛋白質(zhì)。第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 三、真核生物染色體的組成三、真核生物染色體的組成 1染色體蛋白質(zhì) （1）組蛋白 組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，富含帶正電荷的Arg和Lys等堿性氨基酸，等電點一般在pH l0.0以上，屬堿性蛋白質(zhì)，可以和酸性的DNA非特異性緊密結(jié)合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，通常用0.25mol/L HCL或H2SO4從染色質(zhì)中分離得到。真核生物染色體的組蛋白有5種，即H1、H3、H2A 、H2B和 H4。組蛋白中，H3，H4，H2A，H2B，其N端氨基酸都是堿性氨基酸，堿性N端借靜電引力與DNA起作用，組蛋白之間借此相互聚

6、合，C端是疏水端；而H1則相反，C端是堿性氨基酸，N端是疏水端，而且H1具有45種分子類型，所以在遺傳上H1保守性最少。 組蛋白可進行各種修飾。由于組蛋白N端賴氨酸的乙酰化，改變了賴氨酸所負載的電荷，從而影響了與DNA的結(jié)合，有利于轉(zhuǎn)錄的進行，而組蛋白的磷酸化主要在組蛋白N端絲氨酸殘基上進行。現(xiàn)一般認為組蛋白磷酸化可減弱組蛋白與核酸的結(jié)合，從而降低組蛋白對DNA模板活力的抑制，從而利于轉(zhuǎn)錄進行。而甲基化組蛋白。第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 （2）非組蛋白 與染色體組蛋白不同與染色體組蛋白不同，非組蛋白是指染色體上與特異DNA序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱序列特異性DNA結(jié)合蛋白(sequences

7、pecificDNAbinding proteins)。一般來說，非組蛋白所含酸性氨基酸的量超過堿性氨基酸的量，所以帶負電荷。非組蛋白和組蛋白不同，它具有種屬和組織特異性，而且在活動的染色質(zhì)中比不活動的染色質(zhì)中含量要高。非組蛋白在整個細胞周期中都進行合成，而不像組蛋白僅在S期和DNA復(fù)制同步進行。 非組蛋白的功能：能幫助DNA分子折疊，以形成不同的結(jié)構(gòu)域，從而有利于DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄；協(xié)助啟動DNA復(fù)制；特異性地控制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因表達。非組蛋白和組蛋白一樣可以被磷酸化，這被認為是基因表達和調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。 第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 2染色質(zhì)和核小體 （1）核小體結(jié)構(gòu)的主要實驗證據(jù)

8、用溫和的方法破壞細胞核，將染色質(zhì)鋪展在電鏡銅網(wǎng)上，通過電鏡觀察，未經(jīng)處理的染色質(zhì)自然結(jié)構(gòu)為30nm的纖絲，經(jīng)鹽溶液處理后解聚的染色質(zhì)呈現(xiàn)一系列核小體相互連接的串珠狀結(jié)構(gòu)，念珠的直徑為10nm；用微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化染色質(zhì)，經(jīng)過蔗糖梯度離心及瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，如果完全酶解，切下的片段都是200bp的單體；如果部分酶解，則得到的片段是以200bp為單位的單體、二體(400bp)、三體(600bp)等等。蔗糖梯度離心得到的不同組分，在波長260nm的吸收峰的大小和電鏡下所見到的單體、二體、三體的核小體完全一致；應(yīng)用X射線衍射、中子散射及電鏡三維重建技術(shù)，

9、研究染色質(zhì)結(jié)晶顆粒，發(fā)現(xiàn)顆粒是直徑為11nm、高6.0nm的扁圓柱體，具有二分對稱性(dyad symmetry)，核心組蛋白的構(gòu)成是兩個H3分子和兩個H4分子先形成四聚體，然后再與兩個由H2A和H2B構(gòu)成的異二聚體(heterodimer)結(jié)合成八聚體。第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體 （2）核小體結(jié)構(gòu)要點 每個核小體單位包括200bp左右的DNA、一個組蛋白八聚體以及一個分子的組蛋白H1；組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的核心結(jié)構(gòu)，分子量100kD，由H2A、H2B、H3和H4各兩個分子所組成；DNA分子以左手方向盤繞八聚體兩圈，每圈83bp，共166bp。用微球菌核酸酶水解，可得到不含組蛋白H1的146

10、bp的DNA片段(1.75圈)。一個分子的組蛋白H1與DNA結(jié)合，鎖住核小體DNA的進出口，從而穩(wěn)定了核小體的結(jié)構(gòu)；兩個相鄰核小體之間以連接DNA(1inkerDNA)相連，長度為080bp不等（圖2-2）。 第一節(jié)第一節(jié) 染色體染色體AB圖2-2 核小體單體的存在及核心顆粒的形成A：為核小體結(jié)構(gòu)示意圖；B：為核小體單元的產(chǎn)生第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 一、一、DNA的組成的組成 1堿基 核酸中的堿基分兩類：嘧啶堿和嘌呤堿。嘧啶堿是母體化合物嘧啶的衍生物。核酸中常見的嘧啶堿有三類：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。其中胞嘧啶為DNA和RNA兩類核酸所共有。胸腺嘧啶只存在于DNA中，但是tRNA中也有少

11、量存在；尿嘧啶只存在于RNA中。植物DNA中含有一定量的5甲基胞嘧啶。在一些大腸桿菌噬菌體DNA中，5羥甲基胞嘧啶代替了胞嘧啶。嘌呤堿有兩類：腺嘌呤及鳥嘌呤。嘌呤堿是由母體化合物嘌呤衍生而來的。除了5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的稀有堿基。稀有堿基種類極多，大多數(shù)都是甲基化的堿基。tRNA中含有較多的稀有堿基，可高達10。目前已知稀有堿基和核苷達近百種。圖2-3A是存在于DNA和RNA分子中的5種含氮堿基的結(jié)構(gòu)式。 第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 2核苷 核苷是一種糖苷，由戊糖和堿基縮合而成。糖與堿基之間以糖苷鍵相連接。糖的第一位碳原于（C1）與嘧啶堿的第一位氮原子(N1)或與嘌呤堿的第

12、九位氮原子（N9）相連接。所以，糖與堿基間的連鍵是NC鍵，一般稱之為N糖苷鍵；核苷中的D核糖及D2脫氧核糖均為呋喃型環(huán)狀結(jié)構(gòu)。糖環(huán)中的C1是不對稱碳原子，所以有及兩種構(gòu)型。但核酸分子中的糖苷鍵均為糖苷鍵。應(yīng)用X射線衍射法已證明，核苷中的堿基與糖環(huán)平面互相垂直。 根據(jù)核苷中所含戊糖（圖2-3B）的不同，將核苷分成兩大類：核糖核苷和脫氧核糖核苷。對核苷進行命名時，必須先冠以堿基的名稱，例如腺嘌呤核苷、腺嘌呤脫氧核苷等。 RNA中含有某些修飾和異構(gòu)化的核苷。核糖也能被修飾，主要是甲基化修飾。tRNA和rRNA中還含少量假尿嘧啶核苷，在它的結(jié)構(gòu)中，核糖不是與尿嘧啶的第一位氮（N1），而是與第五位碳（C

13、5）相連接。細胞內(nèi)有特異的異構(gòu)化酶催化尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ず塑?。第二?jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 3核苷酸 核苷的磷酸酯叫做核苷酸，分為(核糖)核苷酸(ribo)nucleotide和脫氧(核糖)核苷酸deoxy(ribo)nucleotide兩大類，分別構(gòu)成DNA和RNA的基本結(jié)構(gòu)單位。所有的核苷酸都可在其5位置連接一個以上的磷酸基團；從戊糖開始的第一、二、三個磷酸殘基依次稱為、。和及和之間的鍵是高能鍵，為許多細胞活動提供能量來源。核苷三磷酸縮寫為NTP，核苷二磷酸縮寫為NDP。5核苷三磷酸是核酸合成的前體。 細胞內(nèi)還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，它們都具有重要的生理功能。因此，對于核酸和

14、蛋白質(zhì)系統(tǒng)，核苷酸相當(dāng)于氨基酸，堿基相當(dāng)于氨基酸的功能基。下面列舉幾種核苷酸的結(jié)構(gòu)式（圖2-3C）。 核糖核苷的糖環(huán)上有3個自由羥基，能形成3種不同的核苷酸。(圖2-3C)脫氧核苷的糖環(huán)上只有2個自由羥基，所以只能形成兩種核苷酸。生物體內(nèi)游離存在核苷酸多是5-核苷酸。用堿水解RNA時，可得到2-與3-核糖核苷酸的混合物。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 圖2-3 堿基、戊糖和核苷酸的結(jié)構(gòu)A：堿基；B：戊糖；C：核苷酸第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 二、二、DNADNA的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu) DNA由數(shù)量龐大的4種脫氧核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵連接而成，DNA的一級結(jié)構(gòu)就是這些脫氧核苷酸在分子中的排列順序（

15、序列）。就是DNA分子內(nèi)堿基的排列順序。它以密碼子的方式蘊藏著遺傳信息，以堿基序列的方式蘊藏著對遺傳信息的調(diào)控。DNA分子中堿基序列似乎是不規(guī)則的，實際上是高度有序的。任何一段DNA序列都可以反映出功能特異性和它的個體的、種族的特征。一級結(jié)構(gòu)決定了DNA的二級結(jié)構(gòu)、折疊成的空間結(jié)構(gòu)。這些高級結(jié)構(gòu)又決定和影響著一級結(jié)構(gòu)的信息功能，即基因的啟動和關(guān)閉。因此，研究DNA的一級結(jié)構(gòu)對闡明遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能以及它的表達、調(diào)控都是極其重要的。 DNA幾乎是所有生物遺傳信息的攜帶者。它是信息分子，攜帶以下兩類不同的遺傳信息。一類是負責(zé)編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的信息。在這一類信息中，DNA的一級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)一級結(jié)

16、構(gòu)之間基本上存在共線性關(guān)系。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 另一類一級結(jié)構(gòu)信息與基因的表達有關(guān)，負責(zé)基因活性的選擇性表達和調(diào)控。這一部分DNA的一級結(jié)構(gòu)參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA的復(fù)制、細胞的分化等功能，決定細胞周期的不同時期和個體發(fā)育的不同階段、不同器官、不同組織以及不同外界環(huán)境下，基因是開啟還是關(guān)閉，開啟量是多少等等。這一類DNA一級結(jié)構(gòu)有兩種情況：它本身負責(zé)編碼某些調(diào)控蛋白，這些蛋白質(zhì)負責(zé)調(diào)控相應(yīng)的基因；一些DNA一級結(jié)構(gòu)區(qū)段負責(zé)基因表達的調(diào)控位點，即決定基因開啟或關(guān)閉的元件。一般由調(diào)控蛋白與調(diào)控元件相互作用來有效地控制基因。后者成為調(diào)控蛋白作用的靶位點。DNA分子中有各種特異性元件，

17、如與復(fù)制有關(guān)的各種位點都有它們特異性的一級結(jié)構(gòu)。DNA分子總的A+T與G+C含量相等，但在某些區(qū)域A+T的含量大大增高。由于AT堿基對有2個氫鍵，而GC之間有3個氫鍵，在很多有重要調(diào)節(jié)功能的DNA區(qū)域都富含有AT，如啟動子區(qū)域等，有利于雙鏈的解開，某些蛋白質(zhì)與解鏈部位的相互結(jié)合。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 三、三、DNADNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) DNA的二級結(jié)構(gòu)指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 1雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的依據(jù) X射線衍射數(shù)據(jù)說明DNA含有兩條或兩條以上具有螺旋結(jié)構(gòu)的多核苷酸鏈，而且沿纖維長軸有0.34nm和3.4nm兩個重要的周期性變化。choqoe等應(yīng)用層柝法對多種

18、生物。DNA的堿基組成進行了分析，發(fā)現(xiàn)中的腺嘌呤數(shù)目與胸腺嘧啶的數(shù)目相等，胞嘧啶(包括5甲基胞嘧啶)的數(shù)目和鳥嘌呤的數(shù)目相等。后來又有人證明腺嘌呤和胸腺嘧啶間可以生成兩個氫鍵；而胞嘧啶和鳥嘌呤之間可以允許生成3個氫鍵。用電位漓定法證明DNA的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的可解離基團則不能漓定，說明它們是由氫鍵連接起來的。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 由此得出DNA雙螺旋模型的要點： 主鏈：DNA主鏈由脫氧核糖和磷酸相互間隔連接而成，從3，5磷酸二酯鍵的方向來看，雙螺旋中2條多聚脫氧核苷酸鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?條主鏈處于螺旋的外側(cè)，堿基處于螺旋的內(nèi)側(cè)，且主鏈?zhǔn)怯H水性的。2條主鏈形成右手螺旋，有共同的螺

19、旋軸，螺旋的直徑是2nm。 堿基配對特征：由于受幾何形狀限制，只有A和T配對，G和C配對，其形狀才能正適合雙螺旋的大小，安置在雙螺旋內(nèi)，不會使螺旋有任何畸變或喪失對稱性。這兩種堿基對還有另一個特征，就是處于一個平面具有二次旋轉(zhuǎn)對稱性，即一個堿基對旋轉(zhuǎn)180并不影響雙螺旋對稱性。這意味著AT、TA、GC和CG四種堿基對形式都允許處在這種幾何形狀中，即雙螺旋結(jié)構(gòu)只限定配對方式，并不限定堿基的排列順序。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 堿基：堿基環(huán)是一個共軛環(huán)，堿基對構(gòu)成的平面與螺旋軸近似垂直，螺旋軸穿過堿基平面，相鄰堿基對沿螺旋轉(zhuǎn)36角，上升0.34nm。因此，每10對堿基繞軸旋轉(zhuǎn)一圈組成一節(jié)螺旋，螺距

20、3.4nm。 大溝和小溝：沿螺旋軸方向觀察，可以看到配對的堿基并沒有充滿螺旋的空間。由于堿基對與糖環(huán)的連接都是在堿基對的同側(cè)，故這種不對稱的連接導(dǎo)致雙螺旋表面形成2個凹下去的溝，一個寬一個窄，分別稱為大溝和小溝。糖一磷酸骨架構(gòu)成大溝和小溝的兩壁，堿基對邊就是溝底，而螺旋軸通過堿基對中央。因此，大、小兩溝的深度差不多，亦即從螺旋圓柱面至堿基對邊之間的橫向距離大致相等。雙螺旋表面的溝對DNA與蛋白質(zhì)的相互識別和結(jié)合都是很重要的。因為只有在溝內(nèi)才能接觸到堿基的順序，而在雙螺旋的表面則是脫氧核糖和磷酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)，似乎并無信息可言。當(dāng)然，大溝和小溝之間存在著明顯的差別。大溝的空間可容納其它分子“閱讀”溝

21、內(nèi)的堿基順序信息，并可使其氮、氧原子與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈形成氫鍵而結(jié)合。而小溝沒有足夠大的空間與蛋白質(zhì)分子識別和結(jié)合，但是在B-DNA的小溝內(nèi)可觀察到水合結(jié)構(gòu)。（圖2-4）是DNA雙螺旋模型第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 圖2-4 DNA雙螺旋模型 第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 2DNA雙螺旋的種類 （1）右手螺旋的多重構(gòu)象表2-1不同螺旋形式DNA分子主要參數(shù)比較 第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) （2）左手螺旋 在DNA單鏈中存在嘌呤與嘧啶交替排列的順序CGCGCG或CACACA時，則會出現(xiàn)左手雙螺旋結(jié)構(gòu)。在主鏈中各個磷酸根呈鋸齒狀排列，猶如“之”字形一樣，因此叫做Z型構(gòu)象(采用Zigzag第一個字母

22、)。Z型結(jié)構(gòu)是所有DNA結(jié)構(gòu)每圈螺旋堿基對最多的，因而有最少扭曲結(jié)構(gòu)。比如，真核細胞中常出現(xiàn)胞嘧啶第5位碳原于的甲基化，形成局部疏水區(qū)，這一區(qū)域伸入BDNA的大溝中，使BDNA不穩(wěn)定而轉(zhuǎn)變?yōu)閆DNA。 抗體可以區(qū)分Z型DNA和B型DNA。這些抗體與果蠅染色體的特殊區(qū)域以及其它生物體的細胞核結(jié)合。在果蠅中，結(jié)合的區(qū)域比染色體有更為展開的結(jié)構(gòu),說明ZDNA的存在是一種自然現(xiàn)象。 可以看出，DNA構(gòu)象的多變性，或者說DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，是在不同條件和具有特殊序列結(jié)構(gòu)時才呈現(xiàn)出來的，說明DNA是一個可變的動態(tài)分子，以多變的構(gòu)象實現(xiàn)內(nèi)涵豐富的生物學(xué)功能。第二節(jié) DNA的組成和結(jié)構(gòu) 四、DNA的高級結(jié)

23、構(gòu) DNA的高級結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負超螺旋兩大類，它們在特殊情況下可以相互轉(zhuǎn)變，如：DNA分子的這種變化可以用一個數(shù)學(xué)公式來表示：L = T + W其中，其中為連接數(shù)，是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)(twisting number)，W為超螺旋數(shù)(writhing number)，它們是變量。第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 一、DNA的半保留復(fù)制機理 二、DNA復(fù)制的起點、方向和速度 DNA在復(fù)制時，首先在一定位置解開雙鏈，這個復(fù)制起點呈

24、現(xiàn)叉子的形式，稱為復(fù)制叉。一般把生物體能獨立進行復(fù)制的單位稱為復(fù)制子。實驗證明，復(fù)制在起始階段進行控制，一旦復(fù)制開始，就連續(xù)進行下去，直到整個復(fù)制子完成復(fù)制。每個復(fù)制子由一個復(fù)制起點控制。 原核生物的復(fù)制起始點通常在它染色體的一個特定位點，并且只有一個起始點，因此，原核生物的染色體只有一個復(fù)制子。真核生物染色體的多個位點可以起始復(fù)制，有多個復(fù)制起始點，因此是多復(fù)制子（表2-2）。且多個復(fù)制子不是同時起作用，而是在特定時間，只有一部分復(fù)制子（不超過15%）在進行復(fù)制過程。 關(guān)于DNA復(fù)制的方向和速度，最為普遍的就是雙向等速進行（圖2-5）。某些環(huán)狀DNA偶爾從一個復(fù)制起始點形成一個復(fù)制叉，單向復(fù)

25、制。而腺病毒則從兩個起始點相向進行復(fù)制。第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 表2-2 部分生物復(fù)制子的比較第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 圖2-5 放射性實驗證明DNA的復(fù)制是從固定的起始點雙向等速進行的第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 三、三、DNADNA復(fù)制的幾種主要方式復(fù)制的幾種主要方式 1線性DNA雙鏈的復(fù)制 復(fù)制叉生長方向有單一起點的單向(如腺病毒)及雙向(如噬菌體)，和多個起始點的雙向幾種，DNA雙向復(fù)制時復(fù)制叉處呈“眼”型。線性DNA復(fù)制中RNA引物被切除后，留下5端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過其末端的簡并

26、性, 使不同鏈的3端因互補而結(jié)合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。這個過程可重復(fù)進行直到生成原長20多倍的多聯(lián)體，并由噬菌體DNA編碼的核酸酶特異切割形成單位長度的DNA分子。290噬菌體和腺病毒基因組的末端含反向重復(fù)序列，復(fù)制時，5端首先與末端蛋白共價結(jié)合，開始互補鏈的合成。當(dāng)另一條鏈完全被置換后，兩端通過發(fā)卡結(jié)構(gòu)相連，形成一個大部分序列互補的單鏈環(huán)形DNA分子，復(fù)制從其內(nèi)部的起始位點開始按前導(dǎo)鏈方式雙向進行，經(jīng)過環(huán)形結(jié)構(gòu)到達分子的另一部分，經(jīng)雙鏈結(jié)構(gòu)交錯切割后生成完整的子鏈病毒。除了環(huán)形部分發(fā)生重排之外，所生成的新DNA分子帶有母鏈的全部遺傳信息。第三節(jié)第三節(jié) DN

27、ADNA的復(fù)制的復(fù)制 2環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制 （1）型復(fù)制 型（圖2-6）復(fù)制可以是雙向或單向的，大多為等速雙向，少數(shù)為不等速雙向復(fù)制。兩個共價封閉的互相盤繞的DNA雙鏈在拓撲異構(gòu)酶作用下從起始點（ori）開始形成DNA切口和封閉，DNA的一條或兩條主鏈骨架有暫時的切斷，是DNA超旋或解旋，有利于復(fù)制叉向前移動。前導(dǎo)鏈DNA開始復(fù)制前，復(fù)制原點的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。 （2）滾動環(huán)復(fù)制 它是很多病毒、細菌因子以及真核生 物中基因放大的基礎(chǔ)。如：X174，T4噬菌體等的DNA都以如圖2-7所示 第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 圖2-6 DNA復(fù)制的型結(jié)構(gòu)

28、第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 （3）D型復(fù)制 線粒體和葉綠體具有雙鏈環(huán)狀DNA，在電鏡中觀察到，線粒體DNA的復(fù)制叉曾呈現(xiàn)出D形。在復(fù)制開始時，雙鏈環(huán)狀DNA在特定ori位點出現(xiàn)一個復(fù)制泡(replicative bubble)，雙鏈解鏈。復(fù)制泡的親代分子中以（）鏈作為模板，合成一條新鏈，并且將親代分子的（+）鏈置換出來，新鏈與它的模板形成部分雙鏈。這樣，在線粒體DNA的復(fù)制過程中，出現(xiàn)一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡結(jié)構(gòu)，稱為置換環(huán)(displacement loop)或D環(huán)。（圖2-8）。第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 圖2-7 環(huán)狀DNA可以通過滾環(huán)式復(fù)制產(chǎn)生多單元DNA

29、第三節(jié)第三節(jié) DNADNA的復(fù)制的復(fù)制 圖2-8 D型復(fù)制的模型第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 一、原核生物DNA的復(fù)制特點 1DNA雙螺旋的解旋 DNA雙螺旋分子具有緊密纏繞的結(jié)構(gòu)，編碼堿基位于分子的內(nèi)部，因此在復(fù)制時，母本DNA的兩條鏈應(yīng)至少分開一部分，才能使DNA復(fù)制酶系統(tǒng)“閱讀”模板鏈的堿基順序。 使DNA雙螺旋解旋并使兩條鏈保持分開的狀態(tài)是個極其復(fù)雜的過程，現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使DNA雙鏈變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛。 2岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制 按照Watson-Crick假說，DNA的兩條鏈的方向相反，所以復(fù)制時，如新生DNA的一條鏈從5向3端

30、合成，則另一條鏈必須從3端向5端延伸?？墒?，迄今發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都只能催化DNA鏈從5端向3端延長。第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 圖2-9 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 3DNA復(fù)制的引發(fā)與終止 在細胞提取物中合成岡崎片段時，不僅需要dATP、dGTP、dCTP和dTTP四種前體，還需要一個與模板DNA的堿基順序互補的RNA短片段當(dāng)作引物。有許多實驗結(jié)果能證明RNA引物的存在。在多瘤病毒的體外系統(tǒng)中合成的岡崎片段是一個5端約10核苷酸長的，以3三磷酸為結(jié)尾的RNA。這是一個強有力的證據(jù)。第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 圖2-10

31、大腸桿菌染色體DNA雙向復(fù)制示意圖 第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 4DNA聚合酶 DNA聚合酶不是復(fù)制大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有35核酸外切酶活性，這種活性和聚合酶活性緊密結(jié)合在一起，既可合成DNA鏈，又能降解DNA，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。另外，它還有53核酸外切酶的功能，可作用于雙鏈DNA，又可水解5末端或距5末端幾個核苷酸處的磷酸二酯鍵，因而該酶被認為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起著重要的作用。它也可用以除去岡崎片段5端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來。DNA聚合酶具有53方向聚合酶活性，但酶活性很低。若以每分鐘酶促核苷酸摻入DN

32、A的效率計算，只有DNA聚合酶的5，故也不是復(fù)制中主要的酶。其35核酸外切酶活性可起校正作用。目前認為DNA聚合酶的生理功能主要是起修復(fù)DNA的作用。DNA聚合酶包含有7種不同的亞單位和9個亞基，其生物活性形式為二聚體。它有53方向聚合酶活性，也有35核酸外切酶活性。它的活力較強，為DNA聚合酶的15倍，DNA聚合酶的300倍。它能在引物的3OH上以每分鐘約5萬個核苷酸的速率延長新生的DNA鏈，是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延長反應(yīng)的主導(dǎo)聚合酶。表2-3介紹了上述DNA聚合酶的性質(zhì)。第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 二、真核生物二、真核生物DNA

33、DNA的復(fù)制特點的復(fù)制特點 1真核細胞的每條染色體含有多個復(fù)制起始點。復(fù)制子的大小變化很大，約5-300kbp。復(fù)制可以在幾個復(fù)制起始點上同時進行，復(fù)制起始點不是一成不變的。在發(fā)育過程中，活化的細胞有更多的復(fù)制起始點。例如，果蠅在胚胎發(fā)育早期，其最大染色體上有6000個復(fù)制叉，大約每10 kbp就有一個。 2真核生物染色體在全部復(fù)制完成之前，各個復(fù)制起始點不能開始新一輪的復(fù)制。而原核生物中，復(fù)制起始點上可以連續(xù)開始新的復(fù)制事件，表現(xiàn)為一個復(fù)制子內(nèi)套疊有多個復(fù)制叉。 3真核生物DNA的復(fù)制子被稱為自主復(fù)制序列（ARS），長約150bp左右，含有幾個復(fù)制起始必須的保守區(qū)。并且其復(fù)制起始需起點識別復(fù)

34、合物（ORC）參與，并需ATP。真核生物復(fù)制叉的移動速度大約只有50bp/s，還不到大腸桿菌的1/20。因此，人類DNA中每隔3x1043x105就有一個復(fù)制起始位點。第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 4真核生物有多種DNA聚合酶，分別為在真核細胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶、和，真核細胞的DNA聚合酶和細菌DNA聚合酶基本性質(zhì)相同，均以dNTP為底物，需Mg2+激活，聚合時必須有模板鏈和具有3OH末端的引物鏈，鏈的延伸方向為53。但真核細胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推測一定有另外的酶在DNA復(fù)制中起校對作用。DNA聚合酶的功能主要是引物合成。DNA

35、聚合酶活性水平穩(wěn)定，可能主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。DNA聚合酶是主要負責(zé)DNA復(fù)制的酶，參與先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。而DNA聚合酶的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口補全。 5端粒的復(fù)制 線性染色體的末端DNA稱為端粒，端粒的功能主要是穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體之間的末端連接。復(fù)制由一種特殊的酶-端粒酶所催化。真核生物線性染色體在復(fù)制后，不能原核生物那樣填補5末端的空缺，從而會使5末端序列因此縮短。而端粒酶可以外加重復(fù)單位到5末端上，維持端粒一定的長度。 第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 三、三、DNADNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控 1大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控 染色體的

36、復(fù)制與細胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細胞分裂不直接偶聯(lián)。復(fù)制起始不依賴于細胞分裂，而復(fù)制的終止則能引發(fā)細胞分裂。在一定生長速度范圍內(nèi)，細胞與染色體的質(zhì)量之比相對恒定，這是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它們的相互作用所制約的。復(fù)制的功能單位，即復(fù)制子，由起始物位點和復(fù)制起點兩部分組成。起始物位點編碼復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，復(fù)制起點與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用并啟動復(fù)制。起始物位點突變使復(fù)制停止并導(dǎo)致細胞死亡。 2ColE1質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控 ColE1是一個6646bp的小質(zhì)粒，在宿主細胞內(nèi)拷貝數(shù)為2030。ColE1 DNA復(fù)制不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿主DNA聚合酶。質(zhì)粒DNA編碼兩個負調(diào)控因

37、子Rop蛋白和反義RNA(RNA1)，它們控制了起始DNA復(fù)制所必需的引物合成。 第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA的復(fù)制特點 3真核細胞DNA的復(fù)制調(diào)控 真核細胞的生活周期可分為4個時期：G1、S、G2和M期。G1是復(fù)制預(yù)備期，S為復(fù)制期，G2為有絲分裂準(zhǔn)備期，M為有絲分裂期。DNA復(fù)制只發(fā)生在S期。 真核細胞中DNA復(fù)制有3個水平的調(diào)控： （1）細胞生活周期水平調(diào)控 也稱為限制點調(diào)控，即決定細胞停留在G1期還是進入S期。許多外部因素和細胞因子參與限制點調(diào)控。促細胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可誘發(fā)細胞由G1期進入S期。一些細胞質(zhì)因子如四磷酸二腺苷和聚ADP核糖也可誘導(dǎo)DNA的復(fù)制。 （2）染

38、色體水平調(diào)控 決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在S期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制的機理還不清楚. （3）復(fù)制子水平調(diào)控 決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細胞生物到高等生物是高度保守的。此外，真核生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄話化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段，許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類似。酵母染色體復(fù)制只發(fā)生于S期,各個復(fù)制子按專一的時間順序活化，在S期的不同階段起始復(fù)制。第五節(jié)第五節(jié) DNADNA的損傷與修復(fù)的損傷與修復(fù) 一、一、DNADNA的損傷來源的損傷來源 1DNA分子的自發(fā)性損傷 （1）互變異構(gòu) DNA分子中的4種堿基自發(fā)地使氫原子改變位置，產(chǎn)生互變異構(gòu)

39、體，進一步使堿基配對的方式發(fā)生改變，這樣在復(fù)制后的子鏈上就可能出現(xiàn)錯誤。例如：腺嘌呤的互變異構(gòu)體A可以與C配對，胸腺嘧啶的互變異構(gòu)體T與G配對，當(dāng)DNA復(fù)制時，如果模板鏈上存在這些互變異構(gòu)體，在子鏈上就可能發(fā)生錯誤，形成損傷。 （2）脫氨試劑及自發(fā)脫嘌呤和脫嘧啶 包括羥胺，是一種體外誘變劑；亞硫酸鹽，主要改變DNA分子單鏈區(qū)的CU，亞硝酸鹽主要使CU，也使A和G脫去氨基，但特異性較差，可引起體內(nèi)外的廣泛誘變。 （3）活性氧引起的誘變 活性氧為氧分子電子數(shù)大于O2的O2。8oxoG(GA)是一種氧化堿基(7，8、二氫8氧代鳥嘌呤)，可與C、A配對，而DNA聚合酶、的校正活性不能校正其錯配，造成G

40、CTA的顛換，這種損傷可以積累。H202是細胞呼吸的副產(chǎn)物，非?；钴S，造成DNA氧化損傷時，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、胸苷乙二醇和羥甲基尿嘧啶等，此類損傷一般能被修復(fù)。第五節(jié)第五節(jié) DNADNA的損傷與修復(fù)的損傷與修復(fù) 2物理因素引起的DNA損傷 紫外線（UV）照射引起的DNA損傷主要是形成嘧啶二聚體，DNA分子最易于吸收的波長在260nm左右，當(dāng)受到大劑量的UV照射后，一條鏈上相鄰的兩個嘧啶核苷酸共價結(jié)合，形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。形成二聚體的反應(yīng)可逆較長的波長（280nm）有利于二聚體的形成，較短波長（240 nm）利于其解聚。二聚體的生成位置和頻率與側(cè)翼的堿基序列有一定關(guān)系。當(dāng)人的皮膚暴露在陽光下，每小時由于UV照射產(chǎn)生嘧啶二聚體的頻率為5x104細胞。由于UV穿透力有限，故對人的傷害主要是皮膚。紫外線照射影響微生物的存活。 電離輻射對DNA的損傷有直接效應(yīng)和間接效應(yīng)兩種途徑。前者指輻射對DNA分子直接聚積能量，引起理化性質(zhì)改變；后者指電離輻射對DNA存在的環(huán)境中其他成分(主要是水)沉積能量，引起DNA分子的變化。 第五節(jié)第五節(jié) DNADNA的損傷與修復(fù)的損傷與修復(fù) 3化學(xué)因素引起的DNA損傷 （1）烷化劑對DNA的損傷 烷化劑是一類親電子的化合物，極容易與生物體中的有機物大分子的親核位點起反應(yīng)。當(dāng)烷化劑