3細胞破碎分離

1、13 3 細細 胞胞 破破 碎碎（cell rupturecell rupture）2常見的細胞壁結(jié)構(gòu)細胞破碎技術(shù)本章的主要內(nèi)容本章的主要內(nèi)容3細胞破碎（細胞破碎（cell rupturecell rupture）技術(shù)是）技術(shù)是指利指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)使細胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。43.1 3.1 細胞壁結(jié)構(gòu)對破碎的影響細胞壁結(jié)構(gòu)對破碎的影響Z微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞微生物細胞和植物細胞外層均為細胞壁，細胞壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有壁里面是細胞膜，動物細胞沒有細胞壁，僅有

2、細胞膜。細胞膜。Z通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓通常細胞壁較堅韌，細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于沖擊而破碎，因此細胞破碎的阻力主要來自于細胞壁。細胞壁。Z不同細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細胞不同細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細胞壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就壁的機械強度不同，細胞破碎的難易程度也就不同不同。51. 1. 細菌細胞壁結(jié)構(gòu)細菌細胞壁結(jié)構(gòu)組成成分：組成成分：Z 肽聚糖肽聚糖（peptidoglycanpeptidoglycan）: :主要成分組，它是難溶性的主要成分組，它是難溶性的聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細

3、胞聚糖鏈；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細胞周圍；壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細胞周圍；Z 氨基酸：氨基酸：D,L-D,L-丙氨酸；丙氨酸；D-D-谷氨酸；谷氨酸；L-L-賴氨酸賴氨酸Z 磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合物；僅在革蘭氏陽性菌中存磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合物；僅在革蘭氏陽性菌中存在；在；Z 糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等Z 脂質(zhì)：不多，僅在于革蘭氏陰性菌中脂質(zhì)：不多，僅在于革蘭氏陰性菌中Z 破碎細菌的主要阻力：是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。破碎細菌的主要阻力：是來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。678 2. 酵母細胞壁的結(jié)構(gòu)酵母細胞壁的結(jié)構(gòu)u葡聚糖

4、葡聚糖：它構(gòu)成了細胞壁的：它構(gòu)成了細胞壁的骨架，使細胞具有一定的形骨架，使細胞具有一定的形狀；最里層。狀；最里層。u糖蛋白糖蛋白: :在葡聚糖上面在葡聚糖上面u甘露聚糖甘露聚糖：最外層。由：最外層。由1,6-1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在內(nèi)部有甘露聚糖內(nèi)部有甘露聚糖- -酶的復(fù)合酶的復(fù)合物。物。u破碎酵母細胞壁的阻力：破碎酵母細胞壁的阻力：主主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。程度和它的厚度。93. 3. 真菌的細胞壁真菌的細胞壁l真菌的細胞壁較厚，主要由真菌的細胞壁較厚，主要由多糖，蛋白質(zhì)多糖，蛋白質(zhì)和脂類和脂類組成。組成。l大多數(shù)真菌

5、的多糖壁是由大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成構(gòu)成，少數(shù)含，少數(shù)含纖維素纖維素。10l紅面包霉菌細胞壁結(jié)構(gòu)：紅面包霉菌細胞壁結(jié)構(gòu)：l最外層最外層(a)(a)是是-和和-葡聚糖的葡聚糖的混合物，混合物，l第第2 2層層(b)(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)l第第3 3層層(c)(c)主要是蛋白質(zhì)，主要是蛋白質(zhì)，l最內(nèi)層最內(nèi)層(d)(d)主要是幾丁質(zhì)。主要是幾丁質(zhì)。 真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖l真菌細胞壁的強度：主要決定于聚合物的網(wǎng)狀結(jié)真菌細胞壁的強度：主要決定于聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維構(gòu)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖

6、維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強度更高狀結(jié)構(gòu)，所以強度更高。11微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽性細菌陽性細菌革蘭氏革蘭氏陰性細菌陰性細菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30-40%

7、)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類脂類(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽性細菌陽性細菌革蘭氏革蘭氏陰性細菌陰性細菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-

8、4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類脂類(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)4. 4. 微生物不同細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物不同細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)125. 5. 植物細胞壁的結(jié)構(gòu)植物細胞壁的結(jié)構(gòu)l對于已生長結(jié)束的植物細胞壁可分為對于已生長結(jié)束的植物細胞壁可分為初生壁和次生初生壁和次生壁兩部分。壁兩部分。l初生壁初生壁是細

9、胞生長期形成的。初生壁一般較薄是細胞生長期形成的。初生壁一般較薄（1 13m3m），富有彈性。），富有彈性。l初生壁的組成：初生壁的組成：主要是多糖和蛋白質(zhì)；多糖主要成主要是多糖和蛋白質(zhì)；多糖主要成分為纖維素、半纖維素和果膠類物質(zhì)。許多纖維素分為纖維素、半纖維素和果膠類物質(zhì)。許多纖維素形成微纖絲。形成微纖絲。l細胞壁的機械強度細胞壁的機械強度：主要來自于微纖絲。：主要來自于微纖絲。1314植物次生細胞壁植物次生細胞壁次生細胞壁次生細胞壁：植物細胞生長停止后，在細胞質(zhì)和初：植物細胞生長停止后，在細胞質(zhì)和初生細胞壁之間形成次生細胞壁。生細胞壁之間形成次生細胞壁。次生壁一般較厚次生壁一般較厚(4(4

10、mm以上以上) )，常有三層組成。，常有三層組成。在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁多，在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素的沉積。存在木質(zhì)素的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬性，使植物細胞具有很高的機械強度。細胞具有很高的機械強度。15木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯微鏡圖木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯微鏡圖纖維素纖維素半纖維素半纖維素16分分 類類作作 用用 機機 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性機機械械法法研磨法研磨法固體剪切作用固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作

11、；可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作；大分大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法高壓勻漿法液體剪切作用液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲破碎法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作不適合大規(guī)模操作非非機機械械法法生物法生物法酶分解作用酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離；具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離；溶酶價格高，通用性差溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法改變細胞膜

12、的滲透性改變細胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離；具一定選擇性，漿液易分離；但釋放率較但釋放率較低，通用性差低，通用性差滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)- -融化融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法干燥法改變細胞膜滲透性改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活3.2 3.2 常用的細胞破碎技術(shù)常用的細胞破碎技術(shù)17機械破碎機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎

13、法化學(xué)破碎化學(xué)破碎有機溶劑：表面活性劑：酸堿生物法破碎生物法破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使細胞破碎。力，使細胞破碎。通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。壞，而使細胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細胞通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理細胞破碎方法及其原理181. 1. 機械法

14、機械法機械破碎法又可分為機械破碎法又可分為高壓勻漿破碎法（高壓勻漿破碎法（homogenizationhomogenization）高速研磨破碎法（高速研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasonicationultrasonication）19作用機理：高壓液體剪切力作用機理：高壓液體剪切力1 1）高壓勻漿法）高壓勻漿法（High-pressure homogenizationHigh-pressure homogenization）細胞懸浮液從細胞懸浮液從高壓室針高壓室針形閥形閥噴出，高速噴出的噴出，高速噴出的漿液又漿液又射

15、到靜止的撞擊射到靜止的撞擊環(huán)上環(huán)上，被迫改變方向從，被迫改變方向從出口管流出。出口管流出。細胞在這一系列高速運細胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了高速剪動過程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，切、碰撞及壓力驟降，造成細胞破碎。造成細胞破碎。20高壓勻漿機高壓勻漿機21高壓勻漿法適用的范圍高壓勻漿法適用的范圍適用于大規(guī)模細胞破碎適用于大規(guī)模細胞破碎高壓勻漿法適用的范圍：高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎；酵母和大多數(shù)細菌細胞的破碎；料液細胞濃度可以很高，料液細胞濃度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高壓勻漿法。不宜使用高壓勻漿法。易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，易造成堵塞的團狀或

16、絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌較小的革蘭氏陽性菌22l操作壓力：升高壓力有利于破碎，操作壓力：升高壓力有利于破碎，減少細胞的循減少細胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全環(huán)次數(shù)，甚至一次通過勻漿閥就可達到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細胞碎片不至過小。的破碎，這樣就可避免細胞碎片不至過小。l細菌種類：破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的細菌種類：破碎性能還隨菌體種類和生長環(huán)境的不同而不同不同而不同大腸桿菌的細胞比酵母細胞容易破碎，大腸桿菌的細胞比酵母細胞容易破碎，生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在生長在簡單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。影

17、響高壓勻漿器細胞破碎因素影響高壓勻漿器細胞破碎因素23影響高壓勻漿器細胞破碎因素影響高壓勻漿器細胞破碎因素被破碎的細胞分率符合如下公式：被破碎的細胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)= K N Pln1/(1-R)= K N P 式中式中 R R 破碎率破碎率 N -N -循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)K K 與溫度有關(guān)的常數(shù)與溫度有關(guān)的常數(shù)P P 操作壓力操作壓力 與微生物種類有關(guān)的常數(shù)與微生物種類有關(guān)的常數(shù)242 2）研磨法）研磨法 bead millbead millu作用機理：固體剪切力作用機理：固體剪切力u細胞懸浮液與細小的玻璃小細胞懸浮液與細小的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨珠、石英砂、氧化

18、鋁等研磨劑（直徑小于劑（直徑小于1mm1mm）一起快速）一起快速攪拌或研磨。攪拌或研磨。研磨劑、珠子與細胞之間的互研磨劑、珠子與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。釋放出內(nèi)含物。u在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速研磨機用高速研磨機WSKWSK臥式高效全能研磨機臥式高效全能研磨機25研磨機破碎作用方程研磨機破碎作用方程u破碎作用符合下列公式：破碎作用符合下列公式： ln1/(1-R)= K t ln1/(1-R)= K t R R 破碎率；破碎率；K K一一 速度常數(shù)；速度常數(shù)；t t一一 時間。時間。uK K與攪拌轉(zhuǎn)速、細胞懸浮液

19、濃度，循環(huán)速度，與攪拌轉(zhuǎn)速、細胞懸浮液濃度，循環(huán)速度，研磨劑量，顆粒大小，以及溫度等相關(guān)。研磨劑量，顆粒大小，以及溫度等相關(guān)。263 3）超聲波破碎）超聲波破碎l作用機理：液體剪切力作用機理：液體剪切力l超聲波破碎法超聲波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超利用超聲波振蕩器發(fā)射的聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz15-25kHz（千赫）的超聲波探頭處理（千赫）的超聲波探頭處理細胞懸浮液。細胞懸浮液。l超聲波的細胞破碎效率與細超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的頻胞種類、濃度和超聲波的頻率有關(guān)。率有關(guān)。27超聲波破碎的機理超聲波破碎的機理(一般認

20、為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用一般認為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),cavitation),(液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細胞的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細胞上造成了剪切力，使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從上造成了剪切力，使細胞內(nèi)液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。而使細胞破碎。(操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進行。外部冷卻的容器中進行。28超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于高濃

21、超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于高濃度微生物的破碎。度微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，一般桿菌比球菌易破碎，G-G-細菌比細菌比G+G+細菌易破細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。碎，對酵母菌的效果較差。缺點：缺點：超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基能使某些敏感性活性超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。物質(zhì)失活。對冷卻的要求非常高，所以不易放大，但在實對冷卻的要求非常高，所以不易放大，但在實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。29技術(shù)技術(shù)原理原理效果效果 成本成本舉例舉例勻漿法勻漿法( (孔型孔型) )使細胞受到液體剪使細胞受到液體剪切力而破碎切力而破碎劇烈劇烈 適中適中

22、細胞懸浮液大規(guī)模細胞懸浮液大規(guī)模處理處理研磨破碎研磨破碎法法細胞被玻璃珠或鐵細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎珠搗碎劇烈劇烈 便宜便宜細胞懸浮液和植物細胞懸浮液和植物細胞的大規(guī)模處理細胞的大規(guī)模處理超聲波法超聲波法 使細胞受到液體剪使細胞受到液體剪切力而破碎切力而破碎適中適中 昂貴昂貴細胞懸浮液小規(guī)模細胞懸浮液小規(guī)模處理處理不同機械破碎方法的比較不同機械破碎方法的比較302.2.非機械法非機械法非機械方法很多非機械方法很多1) 1) 生物法生物法- -酶溶解酶溶解（enzyme lysisenzyme lysis）2) 2) 化學(xué)法溶胞化學(xué)法溶胞（chemical treatmentchemical tr

23、eatment）3) 3) 物理法物理法滲透壓沖擊滲透壓沖擊（osmotic shockosmotic shock）凍結(jié)和融化凍結(jié)和融化（freezing and thawingfreezing and thawing）干燥法干燥法其中酶溶解法和化學(xué)溶胞應(yīng)用最廣其中酶溶解法和化學(xué)溶胞應(yīng)用最廣31 1) 1) 生物法（酶溶法生物法（酶溶法 Enymatic lysis)Enymatic lysis)生物法是利用溶解細胞壁的酶處理細胞，使細胞生物法是利用溶解細胞壁的酶處理細胞，使細胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜。細胞膜。A.A.外加酶法外加

24、酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1-1，6-6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶殼多糖酶32特點是專一性強，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細胞特點是專一性強，因此在選擇酶系統(tǒng)時，必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選擇。的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來選擇。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能專一性地分解細胞壁上能專一性地分解細胞壁上肽聚糖肽聚糖分分子的子的-1,4-1,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。解。l革蘭氏陽性菌懸浮液中加入

25、革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象?，F(xiàn)象。l放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，為主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、酵母和真菌由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。等。l植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用植物細胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維纖維素酶和素酶和半纖維素酶半纖維素酶裂解。裂解。33有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入有時采

26、用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入時需確定相應(yīng)的次序。時需確定相應(yīng)的次序。 對酵母細胞采用酶法破碎時對酵母細胞采用酶法破碎時（1 1）先加入）先加入蛋白酶蛋白酶溶解蛋白質(zhì)溶解蛋白質(zhì)- -甘露聚糖結(jié)構(gòu)，甘露聚糖結(jié)構(gòu)，（2 2）再加入）再加入葡聚糖酶溶解葡聚糖酶溶解葡聚糖層，葡聚糖層，（3 3）最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透）最后只剩下原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。壓變化，則細胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。34B.B.自溶作用自溶作用 l 自溶作用是酶溶解的另一種方法，自溶作用是酶溶解的另一種方法，利用生物體自身利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的

27、酶產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程繼續(xù)下去。l改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘改變其生長環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到發(fā)產(chǎn)生過剩的酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達到自溶目的。自溶目的。l缺點是缺點是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。浮液粘度增大，過濾速度下降。35某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、某些化

28、學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素等，可以改變細胞壁或膜的滲透性，從而使胞抗生素等，可以改變細胞壁或膜的滲透性，從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。2) 2) 化學(xué)滲透法（化學(xué)滲透法（Chemical permeationChemical permeation）36n酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用常采用6mol/L HCl6mol/L HCl。n堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)，使某些組堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)，使某些組分從細胞內(nèi)滲漏出來。分從細胞內(nèi)滲漏出來。優(yōu)點：成本低，反應(yīng)激烈、速度快優(yōu)點：成本低，反應(yīng)激烈、速度快缺點：不

29、具選擇性。缺點：不具選擇性。A. A. 酸、堿處理法酸、堿處理法37細胞破碎常用的表面活性劑：細胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS，陰離子型）；。，陰離子型）；。非離子型如非離子型如Triton X-100Triton X-100和吐溫（和吐溫（TweenTween）等）等B. B. 表面活性劑表面活性劑表面活性劑是都是兩性的，既能和水作用也能和脂表面活性劑是都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用；作用；對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞磷脂層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。磷脂，破壞磷脂層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋

30、放出來。能與細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的能與細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解。通透性增加或溶解。38能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物能分解細胞壁中的磷脂，使細胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。質(zhì)被釋放出來。有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有機溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 C. C. 有機溶劑有機溶劑39u通用性差；通用性差；u時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%50%；u有些化學(xué)試劑有毒。有些化學(xué)試劑有毒。u化學(xué)試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，化學(xué)試劑的加入常會給隨后產(chǎn)物

31、的純化帶來困難， 并影響最終產(chǎn)物純度并影響最終產(chǎn)物純度化學(xué)滲透法特點：化學(xué)滲透法特點：缺點缺點l對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性可使一些較小分子量的物質(zhì)（多肽和小分子的酶蛋可使一些較小分子量的物質(zhì)（多肽和小分子的酶蛋白）透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；白）透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；l細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。分離和進一步提取。優(yōu)點優(yōu)點403) 3) 物理法物理法u滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法u凍結(jié)凍結(jié)- -融化法融化法u干燥法干燥法41A.A.滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是

32、較溫和的一種破碎方法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法n將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的將細胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），使細胞脫水收縮；再放入甘油或蔗糖溶液），使細胞脫水收縮；再放入水或緩沖液中，使細胞快速膨脹破裂。水或緩沖液中，使細胞快速膨脹破裂。僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。生素等），使細胞壁有缺陷，強度減弱。42B.B.凍結(jié)凍結(jié)- -融化法融化法 將細胞放在低溫下冷凍（約將細胞放在低溫下冷凍（

33、約-15-15），然后在），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。室溫中融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。作用機理：一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破作用機理：一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)變性。 43使細胞結(jié)合水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、使細胞結(jié)合

34、水分喪失，從而改變細胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽丁醇或緩沖液等對干燥細胞進行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。提出來。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-3025-30的氣流中吹干；的氣流中吹干；真空干燥多用于細菌。真空干燥多用于細菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)C. C. 干燥法干燥法氣流干燥氣流干燥真空干燥真空干燥噴霧干燥噴霧干燥冷凍干燥冷凍干燥4445選擇破碎方法的依據(jù)：選擇破碎方法的依據(jù)：u細胞處理量；細胞處理量； u細胞壁強度和結(jié)構(gòu)細胞壁強度和結(jié)構(gòu)( (高聚物交聯(lián)程度、

35、種高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度類和壁厚度) )；u目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性；目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性； u破碎程度；破碎程度；u目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放46破碎率的測定破碎率的測定細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。使導(dǎo)電率上升。 直接測定法直接測定法 目的產(chǎn)物測定法目的產(chǎn)物測定法 導(dǎo)電率測定法導(dǎo)電率測定法采用染色法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。采用染色法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。如：采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞如：采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細胞呈紫色，而受損害的細胞

36、呈亮紅色。呈紫色，而受損害的細胞呈亮紅色。將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量將破碎后的細胞懸浮液離心，測定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與或活性，并與100%100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計算其破碎率。破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計算其破碎率。47破碎技術(shù)的研究方向破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機械法相結(jié)合?；瘜W(xué)法、酶法、機械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、滲透壓法結(jié)合酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa95MPa壓壓力下勻漿力下勻漿4 4次，總破碎率接近次，總破碎率接近100%100%。而單獨采用高壓勻。而單獨采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎