動(dòng)物科學(xué)院結(jié)題報(bào)告

1、附件 3項(xiàng)目類別項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目結(jié)題書項(xiàng)目名稱：豬腎 D-氨基酸氧化酶的分離純化及其性質(zhì)的初步研究申 請(qǐng) 人：陳家麗所在院部：動(dòng)物科學(xué)學(xué)院專業(yè)年級(jí)：03級(jí)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院生物工程方向 2 班填表說明一、 填寫結(jié)題報(bào)告書前，請(qǐng)先咨詢指導(dǎo)教師或有關(guān)專業(yè)教 師。申請(qǐng)書的各項(xiàng)內(nèi)容要求實(shí)事求是， 逐條認(rèn)真填寫。 表達(dá)明確、 嚴(yán)謹(jǐn)，一律要求用打印稿件。二 、申請(qǐng)書為 A4 復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊(cè)。一式三份（至 少一份原件），由指導(dǎo)教師和所在院（部）審查并簽署意見后報(bào)大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)項(xiàng)目指導(dǎo)中心。三 、一級(jí)標(biāo)題三號(hào)宋體加粗，用“一、二、三”標(biāo)示；二 級(jí)標(biāo)題四號(hào)楷體加粗，用“ （一）

2、（二）（三）”標(biāo)示；三級(jí)標(biāo)題四 號(hào)仿宋加粗，用“ 1、2、 3”標(biāo)示；四級(jí)標(biāo)題四號(hào)仿宋，用“ ”標(biāo)示。示例：一、 XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義（一）XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的的意義1、XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義 XXXX課題立項(xiàng)與研究的目的意義四、如表格不夠，可以加附頁(yè)。、簡(jiǎn)表項(xiàng) 目 簡(jiǎn) 況項(xiàng)目名稱豬腎 D-氨基酸氧化酶的分離純化及其性質(zhì)的初步研究項(xiàng)目類別A、文科類；B、理科類 ；申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)1500 元起止年月2004-5 至 2005-5項(xiàng) 目 組 成 員姓名性 別出生年 月年級(jí)專業(yè)班 級(jí)所在 學(xué)院上學(xué)年綜 合測(cè)評(píng)分項(xiàng)目中的 分工本人簽字陳家麗女1984.303 級(jí)動(dòng)物科 學(xué)生物工

3、程動(dòng)物 科學(xué)91.00主持并參 與全面的董潔嫻女1985.503 級(jí)方生向物科 學(xué)學(xué)生院命 科學(xué)78.00酶的工分作離 純化學(xué)院盧啟清男1983.803 級(jí)生物科 學(xué)生命 科學(xué) 學(xué)院76.82酶的分離 純化指 導(dǎo) 教 師 情 況姓名趙贛性別 男學(xué)位碩士職稱 講師研究方向生物化學(xué)與分子生物學(xué)授課名稱動(dòng)物生物化學(xué)、基礎(chǔ)生物化學(xué)（生物技術(shù)專業(yè)與非生物技術(shù)專業(yè)） 、分子生物學(xué)、高級(jí)動(dòng)物生物化學(xué)（獸醫(yī)學(xué)院研究生）項(xiàng) 目 簡(jiǎn) 介資料表明， D-氨基酸的含量過高會(huì)引起一些疾病（如腎、肝臟某些疾病及 老年癡呆癥等） ，因此 D-氨基酸氧化酶在對(duì)多種疾病的防治上有重要作用。目前對(duì)豬中 D-氨基酸氧化酶的研究較少

4、。本實(shí)驗(yàn)以豬腎為材料，擬從豬腎中提取 D- 氨基酸氧化酶，分離純化后初步研究D- 氨基酸氧化酶的有關(guān)性質(zhì)。本項(xiàng)目可以為進(jìn)行 D-氨基酸氧化酶的深入研究以及有關(guān)豬病的防治提供基 本的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、項(xiàng)目研究的內(nèi)容與方法 本項(xiàng)目的基本內(nèi)容： 分離純化豬腎的 D- 氨基酸氧化酶，并初步研究其性質(zhì)。實(shí)施方案：取一定量的豬腎，勻漿后離心，取上清液。經(jīng)硫酸銨與有機(jī)試劑的分 級(jí)分離、透析、層析（如凝膠過濾、離子交換層析等） 、濃縮等步驟將 D-氨基酸氧化 酶分離純化出來，然后用所提取的純酶對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行初步的研究。1、分離純化豬腎的 D- 氨基酸氧化酶；2、測(cè)定其最適 pH 、最適溫度、 Km 值，研究多種化合

5、物對(duì)其活性的激活及抑制 作用等；3、測(cè)定其分子量、等電點(diǎn)、必需活性基團(tuán)等。以上均在前人的工作基礎(chǔ)上開展工作， 有前人的經(jīng)驗(yàn)做參考， 可以完成預(yù)期的實(shí) 驗(yàn)?zāi)康?。三、?xiàng)目研究過程與資料查閱情況1. 在實(shí)驗(yàn)過程中我們查閱了大量的資料和文獻(xiàn)，并借鑒和參考了其中的方法，現(xiàn)將對(duì)本 實(shí)驗(yàn)有重要幫助的資料和文獻(xiàn)羅列如下：1 1.劉杰武 柴敏強(qiáng)等 江浙蝮蛇毒 L2 氨基酸氧化酶的分離純化及其性質(zhì)鑒定 生物化 學(xué)與生物物理學(xué)報(bào) 2002 , 34 （3） : 305 - 3102. 孫明忠 丁蘭等 白眉蝮蛇蛇毒 L2氨基酸氧化酶的純化與表征高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)1999,13. 史訓(xùn)龍 馮美卿等 基因工程酵母菌來源的

6、D-氨基酸氧化酶分離純化 復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī) 學(xué)版） 2005 Jan 32 （ 1）四、項(xiàng)目成果完成形式和價(jià)值 在前人的基礎(chǔ)上，我們對(duì)測(cè)定酶活方法的改良進(jìn)行了摸索并取得了良好的結(jié)果，使測(cè)定 D- 氨基酸氧化酶方法操作性強(qiáng)， 同時(shí)我們還對(duì) D-氨基酸氧化酶酶活的最適 pH 環(huán)境進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)， 最終確定 D- 氨基酸氧化酶酶活的最適 pH 環(huán)境為 7.2。所以通過本項(xiàng)目的研究確立了有效的、 操作性強(qiáng)的測(cè)定酶活的方法， 摸清 D-氨基酸氧化酶酶活的最適 pH 環(huán)境。 這就為后續(xù)工作奠 定了基礎(chǔ)。五、經(jīng)費(fèi)使用情況全部用完六、申請(qǐng)人對(duì)該項(xiàng)目研究工作完成后的認(rèn)識(shí)總結(jié) 在這一年的工作中， 我們?cè)谡n程學(xué)習(xí)任務(wù)繁重的

7、情況下， 擠出時(shí)間積極參與到創(chuàng)新項(xiàng)目的活 動(dòng)中來，獲得了初步的結(jié)果。我們感到在這個(gè)過程中鞏固了所學(xué)的知識(shí)與技術(shù)，在對(duì)問題的 分析與解決方面比以前有較大的進(jìn)步， 感到以前學(xué)得還很不夠。 我們希望在今后的實(shí)驗(yàn)中不 僅能夠?qū)⒀芯抗ぷ魍瓿珊茫?而且能夠使自己在對(duì)專業(yè)的理論知識(shí)與專業(yè)技術(shù)手段的運(yùn)用方面 有更進(jìn)一步的提高。七、指導(dǎo)教師對(duì)項(xiàng)目完成情況的意見 該參與者在學(xué)習(xí)任務(wù)較重的情況下， 能夠積極地參與此創(chuàng)新項(xiàng)目的研究工作， 獲得了初步的 結(jié)果，并對(duì)自己以往的學(xué)習(xí)進(jìn)行了反思。這無疑是有積極意義的。從這一年的創(chuàng)新項(xiàng)目的實(shí)施過程來看， 項(xiàng)目的申報(bào)內(nèi)容不宜過大過多， 應(yīng)將學(xué)生能夠完 成作為衡量的標(biāo)準(zhǔn)之一。因?yàn)槟?/p>

8、前學(xué)生的學(xué)習(xí)任務(wù)較重，課余的時(shí)間還不夠多。另外，就業(yè) 與考研的壓力所造成的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于學(xué)生對(duì)創(chuàng)新項(xiàng)目?jī)?nèi)容的興趣與對(duì)提高科研能力的追求。 這從申報(bào)時(shí)的項(xiàng)目申請(qǐng)人與最后的實(shí)際參與者不同這一現(xiàn)象即可見一斑。 這些需要引起學(xué)校 的注意。簽字： 年月日八、項(xiàng)目所在單位專家評(píng)審意見簽字： 年月日九、主管部門審核意見單位蓋章 負(fù)責(zé)人簽字：年月日豬腎 D-氨基酸氧化酶的分離純化及其性質(zhì)的初步研究陳家麗 董潔嫻 盧啟清指導(dǎo)老師：趙贛摘要：在不同的 PH 環(huán)境下研究從豬腎中提取的粗酶的酶活，最終得出PH7.2 是 D- 氨基酸氧化酶的較佳酶活環(huán)境。在測(cè)酶活方面用奈斯試劑代替 TCA 終止反應(yīng)取得良好效果。最后 用

9、葡聚糖柱層析和離子交換柱分離提純 D- 氨基酸氧化酶。關(guān)鍵詞：豬腎 D- 氨基酸氧化酶奈斯試劑 柱層析 聚丙烯酰胺凝膠電泳前言： 1924 年化學(xué)家 K.Frendenberg 將 L- 氨基酸冠以“天然” ， D-氨基酸就成了“非天然” ， 類似的 D-糖是“天然” ， L-糖是“非天然” 。這樣來區(qū)分生物手性分子的一個(gè)必然結(jié)論是在 生命物質(zhì)只存在 L- 氨基酸，這是歷史的錯(cuò)誤。生物化學(xué)發(fā)展表明這個(gè)錯(cuò)誤的影響十分深遠(yuǎn)， 甚至在今天仍然存在。 糾正這個(gè)流行觀念。 正確認(rèn)識(shí)生物手性分子對(duì)應(yīng)體之間的關(guān)系， 對(duì)于 生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、宇宙化學(xué)和生命起源研究具有重要意義。40 年代 E.E Sn

10、eLL 等發(fā)現(xiàn)在鏈球菌和乳桿菌德培養(yǎng)液中D- 丙氨酸可以代替 B6，由此引出一系列關(guān)于細(xì)菌中 D- 氨基酸的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞壁中含有D- 氨基酸，也由于流行觀念的影響，生命物質(zhì)只含有 L-氨基酸的結(jié)論自然正確，而細(xì)胞壁含有D- 氨基酸只是一種例外。 1969 年 J.J.Corrigan 在評(píng)論許多昆蟲中發(fā)現(xiàn) D- 氨基酸是仍然相信氨基酸的天然和非天 然之分是正確的：在哺乳動(dòng)物中沒有可靠證據(jù)表明存在 D- 氨基酸。隨著分析方法的發(fā)展， 不斷在海洋動(dòng)物、陸生動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、藻類、種子植物中發(fā)現(xiàn)各種D-氨基酸，特別是人體中 D- 氨基酸研究，人們最終將拋棄生物手性分子天然和非天然

11、之分。由 Krebs 首先發(fā)現(xiàn)的 D-氨基酸氧化酶于 50 年代的到其結(jié)晶，從而能詳細(xì)研究其性質(zhì)、反應(yīng)機(jī)制，使用這種酶測(cè)定生物樣品中D-氨基酸，更進(jìn)一步認(rèn)識(shí) D-氨基酸的存在。 80 年代最后幾年測(cè)定了該酶基因的 cDNA 堿基序列。通過研究缺少這種酶的鼠進(jìn)一步了解這種酶 的生理作用，還發(fā)現(xiàn)其含量大于用于使 D- 氨基酸氧化、脫氧化的量，因此推測(cè)還具有其他 生理作用。 1949 年就知道 D- 天冬安酸氧化酶的存在，由于精制困難，對(duì)其認(rèn)識(shí)則較晚些， 最后于 1987 年于牛腎得到純品，從而有可能深入研究。實(shí)驗(yàn)部分1 儀器與材料：1.1 儀器： 721 型分光光度計(jì) 恒溫水浴鍋 電子天平 冰凍離

12、心機(jī) 葡聚糖凝膠柱 立式電泳儀71.2 材料與試劑：1.2.1 豬腎：市場(chǎng)上購(gòu)買的新鮮豬腎1.2.2 緩沖液： 0.1moL/L 甘氨酸鹽酸緩沖液 pH2.40.1moL/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.20.1moL/L 碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液 pH9.51.2.3 0.05moL/LTris 鹽酸緩沖液： 250mL 0.1moL/L 三羥基氨基甲烷（ Tris）溶液與 172.5mL 0.1moL/L 鹽酸混勻后，定容到 500mL 。1.2.4 考馬斯亮藍(lán) G250 蛋白試劑：稱取 100mg 考馬斯亮藍(lán) G250溶于 50mL90 乙醇溶液 中， 加入 85的磷酸 100mL ，最后用蒸餾水

13、定容到 1000mL。此溶液在室溫下可放 置 1 月。1.2.5 奈斯試劑：稱取 5克碘化鉀溶于 5 毫升蒸餾水中，加入飽和氯化汞溶液（ 100毫 升約溶解 5.7 克氯化汞） ，并不斷攪拌。直至產(chǎn)生的朱紅沉淀不再溶解時(shí)，再加40毫升 50氫氧化鈉溶液，稀釋至 100 毫升，混勻，靜置過夜，傾出清液存于棕色 瓶中。1.2.6 0.05moL/LD 丙氨酸：取 1克 D-丙氨酸溶于 225 毫升水1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠：（配膠方法） 3.9mL 水+4.8mLAri-bis- 緩沖液+3mLMTris+1.2uLAP + 5uLEDTEA 配成 6mL12% 凝膠2.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法：2.1

14、對(duì)最適 pH 值和測(cè)酶活方法的探索2.1.1 粗酶液的提取2.1.1.1 稱取 5 克豬腎，置于研缽中，加入少量石英砂和 20mL 緩沖液，研磨勻漿。2.1.1.2 將勻漿倒入離心管中， 4 10000rpm 離心 15min，收集上清液。2.1.2 三種 pH 值與三種測(cè)酶活方法的比較2.1.2.1 方法一：按下列表格加入以下物質(zhì)對(duì)照待測(cè)緩沖液2.4 mL2.4 mL酶液0.1 mL0.1 mL20%三氯乙酸3 mLD- 丙氨酸0.5 mL37水浴 30min20%三氯乙酸3 mLD- 丙氨酸0.5 mL過濾，取 0.5mL 與另一試管中奈斯試劑1 mL1 mL水7 mL7 mL475nm

15、下分光測(cè)定2.1.2.2 方法二：按下列表格加入以下物質(zhì)對(duì)照待測(cè)緩沖液2.4 mL2.4 mL酶液0.1 mL0.1 mL20%三氯乙酸1 mLD- 丙氨酸0.5 mL37水浴 30min20%三氯乙酸1 mLD- 丙氨酸0.5 mL過濾，取濾液 0.5mL 于另一試管中奈斯試劑1 mL1 mL水7 mL7 mL475nm 下分光測(cè)定2.1.2.3 方法三：按下列表格加入以下物質(zhì)對(duì)照待測(cè)緩沖液0.2 mL0.2 mL酶液0.1 mL0.1 mLD丙氨酸0.2 mL0.2 mL奈斯試劑0.5 mL37水浴 30min 離心 12000rpm 5min 取 0.1mL奈斯試劑0.5 mL水3.5

16、mL3.5 mL475nm 下測(cè)定光吸收值三種方法均選用 pH2.4 甘氨酸鹽酸緩沖液、 pH7.2 磷酸鹽緩沖液、 pH9.5 碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液進(jìn)行比較。2.2 D- 氨基酸氧化酶的提純2.2.1 粗酶液的提取2.2.1.1 稱取 5 克豬腎，置于研缽中，加入少量石英砂和 20mL 緩沖液，研磨勻漿。2.2.1.2 將勻漿倒入離心管中， 4 10000rpm 離心 15min，收集上清液。2.2.2 鹽析將粗提獲得的 D-氨基酸氧化酶的粗酶液中加入 （ NH 4）2SO4 固體至 30%的飽和度，04放置 4h 以上，待蛋白沉淀完全， 4 12000rmp 離心 15min ，收集沉淀。

17、加（ NH 4） 2SO4固體至 60%飽和度， 04放置 4h 以上，待蛋白沉淀完全， 4 12000rmp 離心 15min ，收集沉淀。加（ NH 4） 2SO4固體至 90%飽和度， 04放置 4h 以上，待蛋白沉淀完全， 412000rmp 離心 15min ，收集沉淀。2.2.3 透析2.2.3.1 透析袋的處理：把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度（1020cm）的小段，在大體積的 2%（W/V ）碳酸氫鈉和 1mmoL/LEDTA （ pH8.0）中將透析袋煮沸 2030 分鐘。用 蒸餾水徹底清洗透析袋，并將透析袋的下端扎緊待用。2.2.3.2 透析過程： 將鹽析后的沉淀物裝入透析袋中， 將透

18、析袋的上端扎緊， 然后將其 放入蒸餾水中（保持酶樣完全浸入蒸餾水中） 。每隔 56 小時(shí)換一次水，換 3 至 5 次。2.2.3.3 透析后取 1mL 酶液離心， 12000rpm10min ，取上清液用方法三測(cè)酶活2.2.4 SepHadex G75 凝膠柱層析2.2.4.1 凝膠的預(yù)處理： 將凝膠放置在過量的蒸餾水中充分吸脹， 用傾瀉法除去混雜的 小顆粒 ,重復(fù) 3 到 4 次,加熱 100溶脹。2.2.4.2 裝柱2.2.4.2.1 垂直安裝好柱子2.2.4.2.2 將已溶脹的凝膠沿著玻璃棒徐徐灌入柱中， 盡量一次裝完， 讓其自然下降以 免出現(xiàn)不均勻的凝膠帶。2.2.4.3 洗柱： 50

19、0mL0.01moL/LTris 鹽酸緩沖液洗柱子。2.2.4.4 加樣2.2.4.4.1 凝膠沉集后，調(diào)整流速，加一濾紙于凝膠面上，以防止加樣時(shí)凝膠被沖起。2.2.4.4.2 吸取 1mL 已離心的粗酶液，小心地將樣品加到凝膠床的表面濾紙上。2.2.4.5 洗脫：用 0.05moL/LTris 鹽酸緩沖液進(jìn)行線性洗脫， 調(diào)節(jié)流速，4mL 每管每 5min ， 收集 100 管。2.3D- 氨基酸氧化酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按下列表格加入以下物質(zhì)硫酸氨（ uL ）57.51012.515水（ mL ）3.5953.59253.593.58753.585奈斯試劑3.5（mL）于 475nm 下測(cè)定

20、光吸收值102.4 SDS-PAGE 鑒定： :采用垂直平板式凝膠電泳 ,凝膠板大小為 8cm8cm0.2cm 分離膠濃度 為 12%pH8.9 電板緩沖液為 pH8.3Tris-gLy 緩沖液 , 取 10 L 樣品與 10LBuffer 緩沖液混合 后上樣，進(jìn)行蛋白凝膠電泳。電泳時(shí)恒壓為80v,電泳 2.5h,電泳應(yīng)用 20%三氯醋酸固定區(qū)帶后用考馬斯蘭 R230 染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果系列1 線性 （ 系列 1）2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線酶活：硫酸氨濃度 量（uL）57.51012.515OD4750.1960.2730.4390.5340.7282.2 粗酶在不同方法、不同 pH 值下的酶活：方法一方法

21、二方法三123平均值123平均值123平均值pH2.40-0.010.040.010.004-0.004000.0660.0680.0650.066PH7.20.020.05-0.030.013-0.0030.010.0050.0040.2800.2530.2520.262pH9.5-0.0030.01-0.0020.00130.01-0.0060.0010.00160.1090.0990.0890.099結(jié)果表明：如上圖，方法 1 和方法 2測(cè)定的酶活沒有任何規(guī)律性，測(cè)定的數(shù)據(jù)偏差很大，分 不出最佳酶活的 pH 環(huán)境。而方法 3 測(cè)定的酶活數(shù)據(jù)分布均勻 ,偏差在 0.01 之內(nèi)。并且由數(shù) 據(jù)可以看出在 pH7.2 下粗酶具有較佳的酶活性。2.3 透析后的 pH7.2 的粗酶酶活： （三個(gè)平