脂肪酶的與應(yīng)用

1、脂肪酶的概述與應(yīng)用一 脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隸屬于羧基酯水解酶類(lèi)，能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的動(dòng)、植物和微生物（如霉菌、細(xì)菌等）組織中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸廣泛的應(yīng)用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面脂肪酶廣泛的存在于動(dòng)植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類(lèi)物質(zhì)生成糖類(lèi)，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動(dòng)物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動(dòng)物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補(bǔ)充胰脂肪酶對(duì)脂肪消化的不足，在肉食動(dòng)

2、物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。脂肪酶是一類(lèi)具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類(lèi)的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類(lèi)的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴(lài)于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶的性質(zhì)研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩(wěn)定性、底物特異性等幾個(gè)方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質(zhì)，它們?cè)诜肿恿?、最適pH、最適溫度、pH和熱穩(wěn)定性、等電點(diǎn)和其他生化性質(zhì)方面存在不同（Veerar

3、agavan等）?？傮w而言，微生物脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍，高穩(wěn)定性和活性，對(duì)底物有特異性（Schmid等；Kazlauskas等）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應(yīng)是在2個(gè)彼此分離的完全不同的相的界面上進(jìn)行。這是脂肪酶區(qū)別于酯酶的一個(gè)特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最適底物是由短鏈脂肪酸（C8）形成的酯。脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同

4、來(lái)源的脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活力。其中用于有機(jī)相合成的具有轉(zhuǎn)酯化或酯化功能的脂肪酶的規(guī)?；a(chǎn)對(duì)于酶催化合成精細(xì)化學(xué)品和手性化合物有重要意義。脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸。酶是一種活性蛋白質(zhì)。因此，一切對(duì)蛋白質(zhì)活性有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性，受溫度、pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。脂肪酶在微生物中有廣泛的分布，其產(chǎn)生菌主要是霉菌和細(xì)菌。已經(jīng)公布的適用于甘油三酯加工的不同來(lái)源的脂肪酶有33種，其中18種來(lái)自霉菌，7種來(lái)自細(xì)菌。脂肪酶可將甘油酯（油、脂）水解，在不

5、同階段可釋放出脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用標(biāo)準(zhǔn)的堿溶液滴定，以滴定值表示酶活力。二 脂肪酶的結(jié)構(gòu)解析1、 分子結(jié)構(gòu)研究表明, 來(lái)源不同的脂肪酶 ,其氨基酸組成數(shù)目從 270 641 不等 , 其分子量為29 000 100 000。迄今為止 ,人們已經(jīng)對(duì)多種脂肪酶進(jìn)行克隆和表達(dá) ,并利用 X-衍射等手段和定向修飾等技術(shù)測(cè)定了酶的氨基酸組成、晶體結(jié)構(gòu) 、等電點(diǎn)等參數(shù), 確定了組成脂肪酶活性中心的三元組(triad)結(jié)構(gòu) 。表1列出了幾種常見(jiàn)的脂肪酶的結(jié)構(gòu)特征參數(shù)。正如下表所示, 多數(shù)酶都有變種(如 CCL(A)和CCL(B)、GCL 和 GCL 等),不過(guò)這些不同變

6、種的酶具有絕大多數(shù)相同的氨基酸序列, 其氨基酸組成數(shù)目完全相同, 不同的只是個(gè)別氨基酸的差異 。一般而言, 不僅構(gòu)成活性中心的三元組氨基酸種類(lèi)相同 , 而且位置不變;其分子量和等電點(diǎn)略有不同。2、 脂肪酶催化中心三元組研究表明，盡管不同來(lái)源的脂肪酶有不同的氨基酸組成(殘基數(shù)目、分子量 、三維空間結(jié)構(gòu)等),但由于生物的同源性和進(jìn)化過(guò)程的保守性 ,其催化中心擁有相似或相同的特征區(qū) His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W 、X、Y、Z 指非特異性氨基酸)。如圖1所示，絕大多數(shù)脂肪酶的活性中心都由 Ser 和 His 參與組成, His、Ser與另

7、一種氨基酸殘基(如 CCL 和 GCL的Glu、RML 和 hPL 的 Asp 等)一起構(gòu)成脂肪酶催化活性中心的三元組(triad)。如圖 2 所示 3、 立體結(jié)構(gòu)具體參數(shù)方法：三脂肪酶的純化與表達(dá)l pPIC9k- mRCL 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.以華根霉基因組DNA為模板使用PCR方法擴(kuò)增RCL（華根霉脂肪酶全基因）成熟肽，擴(kuò)增的基因片段純化后克隆到載體 pMD19-T Vector 中，轉(zhuǎn)化E.coli.DH5及進(jìn)行重組質(zhì)粒的篩選，由此構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD19-mRCL 。2.由質(zhì)粒 pMD19-mRCL切下目的基因片段，連入表達(dá)載體 pPIC9k 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9k-mRCL 。（

8、1）質(zhì)粒雙酶切克隆的質(zhì)粒 pMD19-mRCL 和酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9k 分別被 Avr和Not I 雙酶切，得到pMD19-mRCL質(zhì)粒雙酶切的 800bb 左右的小片段以及 pPIC9k 質(zhì)粒的雙酶切線性質(zhì)粒大片段，回收目的條帶。（2）連接載體 DNA 與目的 DNA 片段混合連接。（3）轉(zhuǎn)化 E.coli.DH5 及重組質(zhì)粒的篩選重組質(zhì)粒pPIC9K-mRCL的構(gòu)建l 重組蛋白在巴斯德畢赤酵母 GS115 中的初步表達(dá)1. 巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備2. 巴斯德畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化對(duì)質(zhì)粒線性化，回收酶切產(chǎn)物；再與巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻，電轉(zhuǎn)化得到含目的基因的重組巴斯德畢赤酵母3

9、. 重組巴斯德畢赤酵母的鑒定可用濃度梯度進(jìn)行抗性篩選4. 巴斯德畢赤酵母表達(dá)脂肪酶甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)（選擇的原因）：1.畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長(zhǎng)，因此有利于擴(kuò)大生產(chǎn)獲得高濃度細(xì)胞，從而進(jìn)行高效表達(dá) 2、通過(guò)質(zhì)粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達(dá)菌株3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子特別適用于外源基因的調(diào)控表達(dá)4、畢赤酵母自身分泌到培養(yǎng)基中蛋白很少，使得分 泌性的外源蛋白容易從培養(yǎng)基的基質(zhì)中分離5、畢赤酵母對(duì)外源蛋白產(chǎn)物進(jìn)

10、行N一乙酰糖基化修飾的結(jié)構(gòu)為高甘露糖型，糖鏈平均為814個(gè)甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3連接的甘露糖殘基(有強(qiáng)的免疫原性)，因而適用于臨床應(yīng)用6、使用方便、簡(jiǎn)單，而且成本較低4.表達(dá)后的純化步驟：l 對(duì)象: 重組巴斯德畢赤酵母l 過(guò)程：1. 搖瓶甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)2.脂肪酶的分離純化（1）10 KD 超濾膜濃縮將mRCL發(fā)酵液離心后棄掉沉淀，上清液用微孔濾膜過(guò)濾，微濾后的溶液用10 KD 超濾膜濃縮。濃縮酶液用緩沖液透析過(guò)夜。（2）強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析將透析液上樣到已用上述緩沖液預(yù)平衡的強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析（1.6cm20cm），用相同緩沖洗脫未吸附蛋白。后用NaCl濃度梯度緩沖液階

11、段洗脫吸附蛋白，一定的洗脫速率和時(shí)間分部收集，集中脂肪酶活性組分，用緩沖液透析。3）疏水色譜柱層析將透析后的酶液繼續(xù)用疏水柱層析(1.6 cm20 cm)層析，用相同緩沖液洗脫除去未吸附蛋白。然后用硫酸銨濃度梯度差緩沖液階段洗脫吸附蛋白，最后用 H2O 洗脫，一定的洗脫速率和時(shí)間分部收集，集中脂肪酶活性組分，透析除鹽。4）得到脂肪酶活性組分mRCL四脂肪酶的化學(xué)修飾設(shè)計(jì)思路脂肪酶作為一種水解酶，不僅催化水解反應(yīng)而 且催化有機(jī)相中酯合成和酯交換反應(yīng)。有機(jī)相酶催 化技術(shù)自 20 世紀(jì) 80 年代開(kāi)創(chuàng)以來(lái)，已獲得了巨大 的發(fā)展，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。 近幾年來(lái)人們?yōu)榱颂岣呙冈谟袡C(jī)相中的

12、溶解性及穩(wěn) 定性，在酶的化學(xué)手段修飾和生物學(xué)手段修飾方面 開(kāi)展了許多工作16。而化學(xué)修飾是提高和改變酶 催化性能的有效方法。Basri 等7用氨基酯的鹽酸鹽 對(duì)脂肪酶進(jìn)行化學(xué)修飾，發(fā)現(xiàn)修飾酶在有機(jī)溶劑中的溶解度、熱穩(wěn)定性和催化酯化反應(yīng)活性都有很大 提高。Tatsuo Maruyama 等8用硬脂酸修飾了脂肪 酶，發(fā)現(xiàn)雖然水解活性下降，但酯化活性明顯提高。 從文獻(xiàn)來(lái)看，就化學(xué)修飾改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修飾酶在有機(jī)相（均相）中的穩(wěn)定性、催化活性等問(wèn)題，而涉及非均相界面催化的研 究甚少。表面活性劑是一類(lèi)兼具親油基和親水基的兩 親物質(zhì)，它能富集于界面從而顯著地改變界面性質(zhì)。 修飾原理當(dāng)

13、水溶性的酶分子中引入長(zhǎng)鏈烷基后，便具有了類(lèi)似 于表面活性劑的兩親結(jié)構(gòu)。因此與未經(jīng)修飾的酶相 比，修飾后的酶疏水性增強(qiáng)，界面活性提高，從而有 利于在有機(jī)相或界面催化化學(xué)反應(yīng)，這對(duì)于酶的實(shí) 際應(yīng)用具有重要意義。本文從界面化學(xué)的角度對(duì)用 N-羥基琥珀酰亞胺活化的硬脂酸修飾的 Lipolase 脂 肪酶的界面化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，重點(diǎn)考察了修飾酶 降低表/界面張力的能力及界面催化活性。 1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1 化學(xué)試劑及儀器化學(xué)試劑：Lipolase 100L，諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；N-羥基琥珀酰亞胺，為生化試劑；硬脂酸及其他試劑，為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，?gòu)自中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。儀

14、器：冷凍干燥儀（7934001 8917z-01，USA），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UVIKON，Germany)，元素分析儀（Vario EL，Germany），表面張力儀（DCA315，USA)，界面張力儀（DVT30，Germany）及 LB 成膜裝置 LB5000（KSV5000，F(xiàn)inland)。1.2硬脂酸琥珀酰亞胺酯的制備活化后的硬脂酸易于與酶表面的氨基反應(yīng)，因此先將硬脂酸活化。將硬脂酸溶入適量 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入一定比例的 N-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳酰亞胺。三者摩爾比為12.252.25910。磁力攪拌反應(yīng) 8 h，反應(yīng)溫度為 30 。反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾，濾液

15、用乙醚萃取。蒸去乙醚得到白色固體，然后用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌后經(jīng)真空干燥即得。1.3Lipolase 脂肪酶的化學(xué)修飾在磁力攪拌下，將 Lipolase 100 L 用透析袋于去離子水中透析 2 天，冷凍干燥得到白色固體酶晶體。固體酶置于 5 冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?00 mg 固體酶溶于 20 mL 磷酸二氫鉀硼砂緩沖液（pH=7.4），將 200 mg 硬脂酸琥珀酰亞胺酯溶于 5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。10 下反應(yīng) 10 h。反應(yīng)完畢后，混合物在 4 000 r/min 下離心 15 min 除去未反應(yīng)的酯，重復(fù)操作兩次。上清液用透析袋于去離子水中透析一周后冷凍干燥，干燥后的產(chǎn)物即為修飾酶

16、。1.4 ：修飾度的測(cè)定由于在 Lipolase 表面引入烷基，所以修飾酶中酶含量降低，而酶中含氮量固定，故修飾后總含氮量降低。測(cè)定酶修飾前后的含氮量，其差值相對(duì)含量定義為修飾度。酶的平均含氮量由元素分析儀測(cè)定。實(shí)驗(yàn)測(cè)得未修飾酶的平均含氮量為 14.2%。1.5Lipolase 脂肪酶酶活測(cè)定水解活力采用橄欖油乳化液法測(cè)定1112；酯化活力按 M. Basri 等的方法進(jìn)行13。界面水解活力的測(cè)定按如下方法進(jìn)行：在 50 mL 錐形瓶中加入 10 mL 一定濃度的酶溶液（濃度：0.11 g/L），37 預(yù)熱 5 min，再加入 2 mL 橄欖油，低速磁力攪拌，橄欖油在 Lipolase 的催化

17、下在界面水解。生成的脂肪酸的量采用酸堿滴定法測(cè)定。1.6 Lipolase 脂肪酶水溶液的表/界面張力測(cè)定Lipolase 脂肪酶水溶液的表面張力采用吊片法測(cè)定14。正己烷-酶水溶液體系的界面張力采用滴體積法測(cè)定15。1.7Lipolase 脂肪酶 LB 膜的制備選擇水異丙醇-氯仿為鋪展劑1618，三者體積比為 561。亞相為用超純水配制的 5% KCl 鹽溶液。用微量注射器將酶溶液鋪展于亞相表面，待溶劑揮發(fā) 30 min 后用 LB 成膜裝置壓膜，壓膜速率為 3cm/min，同時(shí)得到-A 曲線。2結(jié)果與討論2.1 Lipolase 脂肪酶的水解活性圖 1 為溫度對(duì) Lipolase 催化橄欖

18、油水解酶活的影響。由圖 1 知，Lipolase 最適水解溫度約為 37 ，雖然修飾后水解酶活有所降低，但并不改變Lipolase 的最佳水解溫度，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致8。相同溫度下的酶活隨修飾度的增加而下降。修飾酶中酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降、修飾過(guò)程中酶的活力損失等均可能是水解酶活降低的原因之一；由于硬脂酸的引入使得 Lipolase 酶活部位的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化也可能導(dǎo)致 Lipolase 失活。五脂肪酶的應(yīng)用1、酶在食品工業(yè)酶在食品工業(yè)中具有廣泛而重要的作用, 近年來(lái)人們對(duì)脂肪酶的研究取得了很大的進(jìn)展, 已引起了全世界的廣泛關(guān)注。目前,脂肪酶在非水體系中反應(yīng)的研究在國(guó)外已取得突破性進(jìn)展, 脂肪酶的應(yīng)用

19、已深入到食品工業(yè)中的多個(gè)領(lǐng)域, 國(guó)內(nèi)脂肪酶在非水介質(zhì)中的酶促反應(yīng)亦成為近幾年的研究熱點(diǎn), 并取得一些可喜的成果。當(dāng)前, 由于固定化酶的方法過(guò)于復(fù)雜, 效率低、成本高, 或使用了有毒的化學(xué)試劑而不符合食品加工所必須滿(mǎn)足的經(jīng)濟(jì)和安全的標(biāo)準(zhǔn), 所有這些都限制了固定化脂肪酶技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用, 但隨著生物技術(shù)以及材料、化工等各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展, 相信固定化脂肪酶的工作會(huì)有新的突破。在食品中也將得到更廣泛的運(yùn)用, 對(duì)促進(jìn)食品工業(yè)快速發(fā)展具有重要意義 脂肪酶在焙烤食品中的應(yīng)用隨著焙烤食品工業(yè)的快速發(fā)展, 消費(fèi)者的食品安全和健康意識(shí)日益增強(qiáng), 對(duì)面粉及其制品提出了愈來(lái)愈高的要求。要想生產(chǎn)出好的面粉, 就需

20、要優(yōu)質(zhì)的原料, 而我國(guó)小麥由于品質(zhì)參差不齊, 要想達(dá)到焙烤食品工業(yè)的要求, 就要在面粉后處理中添加食品添加劑, 來(lái)彌補(bǔ)面粉品質(zhì)的不足。過(guò)去面包粉改良主要是化學(xué)改良劑, 如溴酸鉀, 雖然它對(duì)面團(tuán)及面包有較好的作用, 但長(zhǎng)期使用對(duì)人體有害, 2005 年 7 月 1日被我國(guó)禁止使用。隨著溴酸鉀被禁用, 如何使用天然無(wú)害具有替代功能的產(chǎn)品, 成為廣大焙烤食品及面粉企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn), 而生物酶制劑滿(mǎn)足了這方面的要求。酶作為一種生物制品, 在面粉改良中, 具有顯著的優(yōu)越性:酶本身就是活細(xì)胞產(chǎn)生的活性蛋白質(zhì), 不會(huì)留下有毒的物質(zhì); 酶的催化作用具有高度的專(zhuān)一性, 一種酶只對(duì)一種底物起作用, 如淀粉酶只能催化

21、淀粉的水解, 而對(duì)蛋白質(zhì)則無(wú)效。酶的催化效率非常高, 比一般催化劑高 1071 013 倍, 因此用量相當(dāng)少; 酶的操作條件溫和, 在常溫、常壓下就能進(jìn)行。脂肪酶是酶制劑的一種, 酶的所有特性它都具有, 與其它酶制劑如葡萄糖氧化酶復(fù)配后能夠取代化學(xué)增筋劑溴酸鉀。它能夠提高面制品的烘焙品質(zhì)、改善面包質(zhì)地、延長(zhǎng)制品的貨架期。脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯, 甘油一酯或甘油。它對(duì)面團(tuán)有強(qiáng)筋作用, 能夠提高面包的入爐急脹, 增大面包體積, 且對(duì)面包芯有二次增白作用。它符合了焙烤食品工業(yè)綠色、安全、健康的發(fā)展要求, 正愈來(lái)愈受到廣大焙烤食品及面粉企業(yè)的歡迎, 相信它在這些領(lǐng)域的應(yīng)用具有更加廣闊的前景。脂肪酶在乳品工業(yè)中的應(yīng)用應(yīng)用于乳酯水解, 包括奶酪和奶粉風(fēng)味的增強(qiáng)、奶酪的熟化、代用奶制品的生產(chǎn)、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并產(chǎn)生脂肪酸, 能賦予奶制品獨(dú)特的風(fēng)味。脂肪酶釋放的短碳鏈脂肪酸(C4- C6 ) 使產(chǎn)品具有一種獨(dú)特強(qiáng)烈的奶風(fēng)味, 而釋放的中碳脂肪酸 (