十炭疽防治技術(shù)規(guī)范

1、十三、炭疽防治技術(shù)規(guī)范炭疽（Anthrax ）是由炭疽芽胞桿菌引起的一種人畜共患傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（ OIE ）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其 列為二類動物疫病。為預(yù)防和控制炭疽，依據(jù)中華人民共和國動物防疫法和其它 相關(guān)法律法規(guī)，制定本規(guī)范。1 適用范圍 本規(guī)范規(guī)定了炭疽的診斷、疫情報告、疫情處理、防治措施和控 制標(biāo)準(zhǔn)。本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事動物飼養(yǎng)、 經(jīng)營及其 產(chǎn)品的生產(chǎn)、 經(jīng)營的單位和個人， 以及從事動物防疫活動的單位和個 人。2 診斷依據(jù)本病流行病學(xué)調(diào)查、 臨床癥狀， 結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果做出綜 合判定。2.1 流行特點(diǎn) 本病為人畜共患傳染病， 各種家畜、 野生

2、動物及人對本病都有不 同程度的易感性。草食動物最易感，其次是雜食動物，再次是肉食動 物，家禽一般不感染。人也易感。患病動物和因炭疽而死亡的動物尸體以及污染的土壤、 草地、水、 飼料都是本病的主要傳染源， 炭疽芽胞對環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力， 其 污染的土壤、水源及場地可形成持久的疫源地。本病主要經(jīng)消化道、 呼吸道和皮膚感染。本病呈地方性流行。有一定的季節(jié)性，多發(fā)生在吸血昆蟲多、雨 水多、洪水泛濫的季節(jié)。2.2 臨床癥狀2.2.1 本規(guī)范規(guī)定本病的潛伏期為 20 天。2.2.2 典型癥狀 本病主要呈急性經(jīng)過，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全為 特征。牛：體溫升高常達(dá)41C以上，可視黏膜呈暗紫色，心

3、動過速、 呼吸困難。呈慢性經(jīng)過的病牛，在頸、胸前、肩胛、腹下或外陰部常 見水腫；皮膚病灶溫度增高，堅(jiān)硬，有壓痛，也可發(fā)生壞死，有時形 成潰瘍；頸部水腫常與咽炎和喉頭水腫相伴發(fā)生， 致使呼吸困難加重。 急性病例一般經(jīng)2436小時后死亡，亞急性病例一般經(jīng) 25天后 死亡。馬：體溫升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常見水腫。舌炭疽多見255死亡，有炭疽癰時，病程可達(dá) 38天。羊：多表現(xiàn)為最急性（猝死）病癥，搖擺、磨牙、抽搐，掙扎、 突然倒斃， 有的可見從天然孔流出帶氣泡的黑紅色血液。 病程稍長者 也只持續(xù)數(shù)小時后死亡。豬：多為局限性變化，呈慢性經(jīng)過，臨床癥狀不明顯，常在宰后 見病變。犬和其它肉食動物臨床癥

4、狀不明顯。2.3 病理變化死亡患病動物可視黏膜發(fā)紺、 出血。血液呈暗紫紅色， 凝固不良， 粘稠似煤焦油狀。皮下、肌間、咽喉等部位有漿液性滲出及出血。淋 巴結(jié)腫大、充血，切面潮紅。脾臟高度腫脹，達(dá)正常數(shù)倍，脾髓呈黑 紫色。嚴(yán)禁在非生物安全條件下進(jìn)行疑似患病動物、 患病動物的尸體剖檢。2.4 實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)診斷必須在相應(yīng)級別的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2.4.1 病原鑒定2.4.1.1 樣品采集、包裝與運(yùn)輸按照 NYT561 2.1.2 、4.1、 5.1 執(zhí)行。2.4.1.2 病原學(xué)診斷 炭疽的病原分離及鑒定（見 NY/T561 ）。2.4.2 血清學(xué)診斷 炭疽沉淀反應(yīng)（見 NY/T561 ）

5、。2.4.3 分子生物學(xué)診斷 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR ）（見附件 1）。3 疫情報告3.1 任何單位和個人發(fā)現(xiàn)患有本病或者疑似本病的動物，都應(yīng) 立即向當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機(jī)構(gòu)報告。3.2 當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報告后，按國家動物疫情 報告管理的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。4 疫情處理依據(jù)本病流行病學(xué)調(diào)查、 臨床癥狀， 結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷做出的綜合 判定結(jié)果可做為疫情處理依據(jù)。4.1 當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疑似炭疽疫情報告后，應(yīng)及時 派員到現(xiàn)場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和臨床檢查， 采集病料送符合規(guī)定的實(shí) 驗(yàn)室診斷，并立即隔離疑似患病動物及同群動物，限制移動。對病死動物尸體， 嚴(yán)禁進(jìn)行開放式解剖檢查， 采樣時必須按規(guī)

6、定261進(jìn)行，防止病原污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2 確診為炭疽后，必須按下列要求處理。4.2.1 由所在地縣級以上獸醫(yī)主管部門劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅 區(qū)。疫 點(diǎn)：指患病動物所在地點(diǎn)。一般是指患病動物及同群動物所 在畜場（戶組）或其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營單位。疫 區(qū)：指由疫點(diǎn)邊緣外延 3 公里范圍內(nèi)的區(qū)域。在實(shí)際劃分疫 區(qū)時，應(yīng)考慮當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)環(huán)境和自然屏障（如河流、山脈等）以及氣象 因素，科學(xué)確定疫區(qū)范圍。受威脅區(qū)：指疫區(qū)外延 5 公里范圍內(nèi)的區(qū)域。4.2.2 本病呈零星散發(fā)時，應(yīng)對患病動物作無血撲殺處理，對同 群動物立即進(jìn)行強(qiáng)制免疫接種，并隔離觀察 20 天。對病死動物及排 泄物、可能被污染飼料

7、、 污水等按附件 2 的要求進(jìn)行無害化處理； 對 可能被污染的物品、交通工具、用具、動物舍進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒（見 附件 2）。疫區(qū)、受威脅區(qū)所有易感動物進(jìn)行緊急免疫接種。對病死 動物尸體嚴(yán)禁進(jìn)行開放式解剖檢查， 采樣必須按規(guī)定進(jìn)行， 防止病原 污染環(huán)境，形成永久性疫源地。4.2.3 本病呈暴發(fā)流行時（ 1 個縣 10 天內(nèi)發(fā)現(xiàn) 5 頭以上的患 病動物），要報請同級人民政府對疫區(qū)實(shí)行封鎖；人民政府在接到封鎖報告后，應(yīng)立即發(fā)布封鎖令，并對疫區(qū)實(shí)施封鎖。疫點(diǎn)、疫區(qū)和受威脅區(qū)采取的處理措施如下：4.2.3.1 疫點(diǎn) 出入口必須設(shè)立消毒設(shè)施。限制人、易感動物、車輛進(jìn)出和動物 產(chǎn)品及可能受污染的物品運(yùn)出。

8、對疫點(diǎn)內(nèi)動物舍、 場地以及所有運(yùn)載 工具、飲水用具等必須進(jìn)行嚴(yán)格徹底地消毒?；疾游锖屯簞游锶窟M(jìn)行無血撲殺處理。 其它易感動物緊急 免疫接種。對所有病死動物、 被撲殺動物，以及排泄物和可能被污染的墊料、 飼料等物品產(chǎn)品按附件 2 要求進(jìn)行無害化處理。動物尸體需要運(yùn)送時，應(yīng)使用防漏容器，須有明顯標(biāo)志，并在動 物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的監(jiān)督下實(shí)施。4.2.3.2 疫區(qū)：交通要道建立動物防疫監(jiān)督檢查站， 派專人監(jiān)管 動物及其產(chǎn)品的流動，對進(jìn)出人員、車輛須進(jìn)行消毒。停止疫區(qū)內(nèi)動 物及其產(chǎn)品的交易、移動。 所有易感動物必須圈養(yǎng)，或在指定地點(diǎn)放 養(yǎng)；對動物舍、道路等可能污染的場所進(jìn)行消毒。對疫區(qū)內(nèi)的所有易感動物

9、進(jìn)行緊急免疫接種。4.2.3.3 受威脅區(qū)：對受威脅區(qū)內(nèi)的所有易感動物進(jìn)行緊急免疫 接種。4.2.3.4 進(jìn)行疫源分析與流行病學(xué)調(diào)查4.2.3.5 封鎖令的解除最后 1頭患病動物死亡或患病動物和同群動物撲殺處理后 20 天 內(nèi)不再出現(xiàn)新的病例， 進(jìn)行終末消毒后， 經(jīng)動物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)審驗(yàn)合 格后，由當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門向原發(fā)布封鎖令的機(jī)關(guān)申請發(fā)布解除封鎖 令。4.2.4 處理記錄對處理疫情的全過程必須做好完整的詳細(xì)記錄，建立檔案。5 預(yù)防與控制5.1 環(huán)境控制 飼養(yǎng)、生產(chǎn)、經(jīng)營場所和屠宰場必須符合動物防疫條件審核管 理辦法（農(nóng)業(yè)部 200215 號令）規(guī)定的動物防疫條件，建立嚴(yán)格的 衛(wèi)生（消毒）管理

10、制度。5.2 免疫接種5.2.1 各省根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔榱餍星闆r，按農(nóng)業(yè)部制定的免疫方案， 確定免疫接種對象、范圍。5.2.2 使用國家批準(zhǔn)的炭疽疫苗，并按免疫程序進(jìn)行適時免疫 接種，建立免疫檔案。5.3 檢疫5.3.1 產(chǎn)地檢疫按 GB16549 和動物檢疫管理辦法實(shí)施檢疫。檢出炭疽陽性 動物時，按本規(guī)范 4.2.2 規(guī)定處理。5.3.2 屠宰檢疫按 NY467 和動物檢疫管理辦法對屠宰的動物實(shí)施檢疫。5.4 消毒 對新老疫區(qū)進(jìn)行經(jīng)常性消毒，雨季要重點(diǎn)消毒。皮張、毛等按照 附件 2 實(shí)施消毒。5.5 人員防護(hù)動物防疫檢疫、 實(shí)驗(yàn)室診斷及飼養(yǎng)場、 畜產(chǎn)品及皮張加工企業(yè)工 作人員要注意個人防護(hù)，參與疫

11、情處理的有關(guān)人員，應(yīng)穿防護(hù)服、戴 口罩和手套，做好自身防護(hù)。附件 1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù)1 試劑1.1 消化液1.1.1 1M 三羥甲基氨基甲烷 -鹽酸 (Tris-HCl)(pH8.0)三羥甲基氨基甲烷12.11g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.1.2 0.5M 乙二銨四乙酸二鈉 (EDTA) 溶液(pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.1.3 20% 十二烷基磺酸鈉 (SDS) 溶液 (pH7.2)十二烷基磺酸鈉20g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 7.2

12、滅菌雙蒸水 加至 100mL1.1.4 消化液配制1M 三羥甲基氨基甲烷 -鹽酸 (Tris-HCl)(pH8.0) 2mL 0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液 (pH8.0)0.4mL20% 十二烷基磺酸鈉溶液 (pH7.2) 5mL 5M 氯化鈉 4mL 滅菌雙蒸水 加至 200mL1.2 蛋白酶 K 溶液蛋白酶 K 5g 滅菌雙蒸水 加至 250mL 1.3 酚/氯仿 /異戊醇混合液堿性酚25mL氯仿24mL異戊醇1mL1.4 2.5mmol/LdNTPdATP(100mmol/L)20 山dTTP(100mmol/L)20 山dGTP(100mmol/L)20 山dCTP(100m

13、mol/L)20 讓1.5 8pmol/ 山 PCR 引物上游引物ATXU (2 OD)加入701山滅菌雙蒸水溶解，下游引物ATXD (2 OD )加入697山滅菌雙蒸水溶解，分別取ATXU、ATXD溶液各300讓，混勻即為8pmol/山 擴(kuò)增引物。1.60.5 單位 Taq DNA 聚合酶5 單位 Taq DNA 聚合酶1山滅菌雙蒸水加至10 gL現(xiàn)用現(xiàn)配。1.710 XPCR緩沖液1.7.1 1mol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)( pH9.0)三羥基甲基氨基甲烷15.8g滅菌雙蒸水80mL濃鹽酸調(diào) pH 至 9.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.7.210 倍 PCR 緩

14、沖液1mol/L二羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCI)( pH9.0) 1mL氯化鉀0.373g曲拉通 X-1000.1mL2651.8 溴化乙錠 (EB) 溶液溴化乙錠 0.2g 滅菌雙蒸水 加至 20mL1.9 電泳緩沖液 (50 倍 )1.9.1 0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉 (EDTA) 溶液 (pH8.0)二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào) pH 至 8.0滅菌雙蒸水加至 100mL1.9.2 TAE 電泳緩沖液 (50 倍)三羥基甲基氨基甲烷 (Tris)242g冰乙酸57.1mlL0.5mol/L 乙二銨四乙酸二鈉溶液 (pH8.0)100m

15、L滅菌雙蒸水加至 1 000mL用時用滅菌雙蒸水稀釋使用1.10 1.5 瓊脂糖凝膠瓊脂糖3gTAE 電泳緩沖液 (50 倍)4mL滅菌雙蒸水196mL微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20山。1.11 上樣緩沖液溴酚藍(lán) 0.2g ，加雙蒸水 10mL 過夜溶解。 50g 蔗糖加入 50ml 水 溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至 100mL。1.12 其它試劑異丙醇 （分析純 ）70%乙醇15mmoL/L 氯化鎂滅菌雙蒸水2 器材2.1 儀器分析天平、高速離心機(jī)、真空干燥器、 PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、液氮或-70 C冰箱、微波 爐、組織

16、研磨器、-20 C冰箱、可調(diào)移液器（2山、20山、200讓、 1000 山）。2.2 耗材眼科剪、眼科鑷、稱量紙、 20 mL 一次性注射器、 1.5 mL 滅菌 離心管、 0.2 mL 薄壁 PCR 管、瓊脂糖、 500 mL 量筒、 500 mL 錐形267瓶、吸頭（10讓、200山、1000山）、滅菌雙蒸水。2.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù) GenBank 上已發(fā)表的炭疽桿菌 POX1 質(zhì)粒序列， 設(shè)計(jì)并合 成了以下兩條引物：ATXU ： 5-AGAATGTATCACCAGAGGC-3 ATXD ： 5-GTTGTAGATTGGAGCCGTC-3 ，此對引物擴(kuò)增片段為 394bp 。2.4 樣品的采

17、集與處理2.4.1 樣品的采集病死或撲殺的動物取肝臟或脾；待檢的活動物，用注射器取血510mL , 28 C保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測。2.4.2 樣品的處理每份樣品分別處理。2.4.2.1 組織樣品處理稱取待檢病料 0.2g ，置研磨器中剪碎并研磨，加入 2mL 消化液 繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清100此加入1.5 mL滅菌離心 管中，再加入500山消化液和10山蛋白酶K溶液，混勻后，置55 C 水浴中 4 16h 。2.4.2.2 待檢菌的處理#取培養(yǎng)獲得的菌落，重懸于生理鹽水中。取其懸液100山加入1.5mL滅菌離心管中，再加入500山 消化液和10山 蛋白酶K溶液， 混勻后，置55 C

18、水浴中過夜。2.4.2.3 全血樣品處理待血凝后取上清放于離心管中，4C 8000 g離心5分鐘，取上 清100山，加入500山消化液和10山蛋白酶K溶液，混勻后，置 55 C水浴中過夜。2.4.2.4 陽性對照處理取培養(yǎng)的炭疽桿菌，重懸于生理鹽水中。取其懸液100讓，置1.5 mL滅菌離心管中，加入500山消化液和10山蛋白酶K溶液， 混勻后，置55 C水浴中過夜。2.4.2.5 陰性對照處理取滅菌雙蒸水100山，置1.5 mL滅菌離心管中，加入500山消 化液10 gl蛋白酶K溶液，混勻后，置55 C水浴中過夜。2.5 DNA 模板的提取2.5.1 取出已處理的樣品及陰、陽對照，加入600

19、gL 酚/氯仿/異戊醇混合液，用力顛倒 10 次混勻， 12000g 離心 10 分鐘。2.5.2 取上清置 1.5mL 滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混 勻，置液氮中 3 分鐘。取出樣品管，室溫融化， 15000rpm 離心 15269分鐘2.5.3 棄上清，沿管壁緩緩滴入 1ml 70% 乙醇，輕輕旋轉(zhuǎn)洗一 次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上 1分鐘，真空抽干 15 分鐘（以無 乙醇味為準(zhǔn) ）。2.5.4 取出樣品管，用50讓滅菌雙蒸水溶解沉淀，作為模板備 用。2.6 PCR 擴(kuò)增總體積20山取滅菌雙蒸水8止2.5mmol/L dNTP、8pmol/讓擴(kuò) 增引物、15mmol/L氯化鎂、1

20、0 XPCR緩沖液、0.5單位TaqDNA聚 合酶各2山，2gL模板DNA。混勻，作好標(biāo)記，加入礦物油20讓覆 蓋（有熱蓋的自動DNA熱循環(huán)儀不用加礦物油）。擴(kuò)增條件為94C 3 分鐘后，94 C 30s , 58 C 30s , 72 C 30s 循環(huán) 35 次，72 C 延伸 5 分鐘。2.7 電泳將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15山混合3gL上樣緩沖液，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂 糖凝膠孔中， 以 5V/cm 電壓于 1 XTAE 緩沖液中電泳， 紫外凝膠成像 儀下觀察結(jié)果。2.8 結(jié)果判定在陽性對照出現(xiàn) 394bp 擴(kuò)增帶、陰性對照無帶出現(xiàn) （引物帶除外 ）時，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn) 394bp 擴(kuò)增帶

21、為炭疽桿菌陽性， 否則為陰性。273附件 2無害化處理1 炭疽動物尸體處理 應(yīng)結(jié)合遠(yuǎn)離人們生活、水源等因素考慮，因地制宜，就地焚燒。如需移動尸體，先用 5福爾馬林消毒尸體表面，然后搬運(yùn)，并將原 放置尸地及尸體天然孔出血及滲出物用 5%福爾馬林浸漬消毒數(shù)次， 在搬運(yùn)過程中避免污染沿途路段。 焚燒時將尸體墊起， 用油或木柴焚 燒，要求燃燒徹底。無條件進(jìn)行焚燒處理時，也可按規(guī)定進(jìn)行深埋處 理。2 糞肥、墊料、飼料的處理 被污染的糞肥、墊料、飼料等，應(yīng)混以適量干碎草，在遠(yuǎn)離建筑 物和易燃品處堆積徹底焚燒，然后取樣檢驗(yàn)，確認(rèn)無害后，方可用作 肥料。3 房屋、廄舍處理開放式房屋、廄舍可用 5%福爾馬林噴灑

22、消毒三遍，每次浸漬 2 小時。也可用 20漂白粉液噴霧， 200mL/m 2作用 2小時。對磚墻、 土墻、地面污染嚴(yán)重處，在離開易燃品條件下，亦可先用酒精或汽油 噴燈地毯式噴燒一遍，然后再用 5 福爾馬林噴灑消毒三遍。對可密閉房屋及室內(nèi)櫥柜、用具消毒，可用福爾馬林熏蒸。在室溫18 C條件下，對每2530m3空間，用10 %濃甲醛液（內(nèi)含37 % 甲醛氣體）約 4000mL ，用電煮鍋蒸 4 小時。蒸前先將門窗關(guān)閉，通 風(fēng)孔隙用高粘膠紙封嚴(yán)， 工作人員戴專用防毒面具操作。 密封 812 小時后，打開門窗換氣，然后使用。熏蒸消毒效果測定， 可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的紙片， 放在含組 氨酸的瓊脂平皿上，待熏后取出置37 C培養(yǎng)24小時，如無細(xì)菌生長 即認(rèn)為消毒有效。也可選擇其它消毒液進(jìn)行噴灑消毒，如4%戊二醛（pH8.08.5） 2小時浸洗、5%甲醛（約15%福爾馬林）2小時、3% H2O22小時 或過氧乙酸 2 小時。其中， H2O2 和過氧乙酸不宜用于有血液存在的 環(huán)境消毒；過氧乙酸不宜用