分子生物學(xué)常用技術(shù)PCR

1、分子生物學(xué)常用技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù) u 凝膠電泳凝膠電泳 u 分子雜交技分子雜交技 術(shù)術(shù) u PCR PCR 技術(shù)技術(shù) DNA DNA 物理圖譜物理圖譜 DNADNA序列測(cè)定序列測(cè)定 生物芯片生物芯片 “基因靶向基因靶向”技術(shù)技術(shù) RNA干擾干擾技術(shù)技術(shù) PCR 內(nèi)容包括內(nèi)容包括: PCR 技術(shù)的技術(shù)的發(fā)發(fā)明明 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 PCR 技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 PCR 條件優(yōu)化條件優(yōu)化 PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCR 技術(shù)的發(fā)展史技術(shù)的發(fā)展史 PCR 反應(yīng)條件反應(yīng)條件 PCR 技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 (請(qǐng)自學(xué)) u PCR PCR 技術(shù)技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(P

2、olymerase Chain Reaction ,PCR)(Polymerase Chain Reaction ,PCR) 體外體外核酸擴(kuò)增技術(shù)將目的基因或某一核酸擴(kuò)增技術(shù)將目的基因或某一DNADNA片段于數(shù)小時(shí)片段于數(shù)小時(shí) 內(nèi)內(nèi)體外體外擴(kuò)增至百萬(wàn)倍擴(kuò)增至百萬(wàn)倍, ,千萬(wàn)倍。千萬(wàn)倍。 PCR PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域: : 革命性創(chuàng)舉革命性創(chuàng)舉和和里程碑。里程碑。 迅速滲透到各個(gè)領(lǐng)域迅速滲透到各個(gè)領(lǐng)域: : 分子克隆、分子克隆、 目的基礎(chǔ)檢測(cè)目的基礎(chǔ)檢測(cè) 、基因診斷、基因表達(dá)調(diào)控、基因診斷、基因表達(dá)調(diào)控, ,、 法醫(yī)學(xué)鑒定、食品衛(wèi)生法醫(yī)學(xué)鑒定、食品衛(wèi)生 , ,、環(huán)境監(jiān)測(cè)考古

3、學(xué)等。、環(huán)境監(jiān)測(cè)考古學(xué)等。 簡(jiǎn)便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、簡(jiǎn)便、特異、快速、靈敏、產(chǎn)率高、 重復(fù)重復(fù) 性好、易自動(dòng)化等性好、易自動(dòng)化等 可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò) 增出足量的增出足量的DNADNA供分析研究和檢測(cè)鑒定，用供分析研究和檢測(cè)鑒定，用PCRPCR幾幾 小時(shí)便可完成。小時(shí)便可完成。 DNA DNA克隆重組克隆重組, PCR, DNA, PCR, DNA序列分析序列分析構(gòu)成了整構(gòu)成了整 個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。 PCR PCR 特點(diǎn)特點(diǎn): : RT-PCR RAPD-PCRRandom Amplifica

4、tion of Polymorphic DNA. DDRT-PCR差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR LAM-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Multiplex PCR Anchored PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR Recombinant PCR SSCP In situ PCR Flow chip PCR 技術(shù) 請(qǐng)自學(xué) ( (一一): PCR): PCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明 19711971年年: : Korana Korana 設(shè)想設(shè)想 本世紀(jì)本世紀(jì)6060年代末、年代末、7070年代

5、初人們致力于研究基因年代初人們致力于研究基因 的體外分離技術(shù)，的體外分離技術(shù)，KoranaKorana于于19711971年最早提出核酸體外擴(kuò)年最早提出核酸體外擴(kuò) 增的設(shè)想：增的設(shè)想： “經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)DNADNA變性，與合適的引物雜交，用變性，與合適的引物雜交，用DNADNA聚合聚合 酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNAtRNA基因基因”。 1983年年: Kary B. Mullis (1944 -) 在在CetusCetus公司工作期間，公司工作期間， 他原本是要合成他原本是要合成DNADNA引物來(lái)進(jìn)行引物來(lái)進(jìn)行 測(cè)序工作，測(cè)序工作， 常為沒(méi)有足夠多

6、的模板常為沒(méi)有足夠多的模板DNADNA而煩惱。一天晚上，他而煩惱。一天晚上，他 開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用引物去擴(kuò)增模板引物去擴(kuò)增模板DNA DNA 的想的想 法法. MullisMullis開車的時(shí)候開車的時(shí)候, , 瞬間感覺(jué)兩排路燈就是瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNADNA的兩條鏈，自己的兩條鏈，自己 的車和對(duì)面開來(lái)的車象是的車和對(duì)面開來(lái)的車象是DNADNA聚合酶，面對(duì)面地合聚合酶，面對(duì)面地合DNADNA， 19851985年年: Mullis PCR: Mullis PCR設(shè)想的實(shí)現(xiàn)設(shè)想的實(shí)現(xiàn) 原理類似于原理類似于DNADNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給的體內(nèi)復(fù)制，

7、只是在試管中給DNADNA的體的體 外合成提供外合成提供: : 摸板摸板DNA DNA 、寡核苷酸引物、寡核苷酸引物、DNADNA聚合酶、合聚合酶、合 適的緩沖體系、適的緩沖體系、DNADNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。 MullisMullis使用是大腸桿菌使用是大腸桿菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶 I I 的的KlenowKlenow片片 段段. . 缺點(diǎn)是：缺點(diǎn)是： 1): 1): KlenowKlenow酶酶不耐高溫不耐高溫， 9090會(huì)變性失活，每次循會(huì)變性失活，每次循 環(huán)都要重新加。環(huán)都要重新加。 2): 2): 特異性差特異性差: : 引物鏈延伸

8、反應(yīng)在引物鏈延伸反應(yīng)在3737下進(jìn)行，模板下進(jìn)行，模板 和引物之間的堿基錯(cuò)配，合成的和引物之間的堿基錯(cuò)配，合成的DNADNA片段不均一。片段不均一。 19881988年年: : KeohanogKeohanog 改用改用T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶進(jìn)行進(jìn)行PCRPCR，擴(kuò)增的，擴(kuò)增的DNADNA片段均一，片段均一， 特異性高特異性高。但。但不耐高溫不耐高溫, , 每循環(huán)一次，仍需加入新酶。每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 19881988年年Saiki Saiki 等等: : 從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌( (t thermushermus aqaquatic

9、usuaticus) ) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNADNA聚合酶聚合酶: : 耐高溫耐高溫， 9393下反應(yīng)下反應(yīng)2h2h后其殘留活性是原來(lái)的后其殘留活性是原來(lái)的60%60%，在，在952h952h后后 殘留活性殘留活性: 40%. 1): 40%. 1):不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶; ; 2):2):大大提高了大大提高了特異性特異性, , 擴(kuò)增效率和靈敏性擴(kuò)增效率和靈敏性，增加了擴(kuò)，增加了擴(kuò) 增長(zhǎng)度增長(zhǎng)度(2.0Kb)(2.0Kb)。 此酶命名為此酶命名為TaqTaq DNA DNA多聚酶多聚酶( (TaqTaq DNA Polymerase) DN

10、A Polymerase)。 TaqTaq DNA DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)使多聚酶的發(fā)現(xiàn)使PCRPCR得以廣泛應(yīng)用。得以廣泛應(yīng)用。 19931993年年: : MulisMulis 眾望所歸地獲得了眾望所歸地獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)， 他所取得的成就是發(fā)明了他所取得的成就是發(fā)明了PCRPCR技術(shù)。技術(shù)。 1998-1999年年: Bill Clinton 唯一一個(gè)在全美國(guó)人面前就自己的唯一一個(gè)在全美國(guó)人面前就自己的性丑聞事性丑聞事 件件道歉的美國(guó)總統(tǒng)道歉的美國(guó)總統(tǒng), , 因?yàn)橐驗(yàn)?1): 1): 有了有了 PCRPCR技術(shù)技術(shù), 2):, 2): 不懂不懂PCRPCR技術(shù)。技術(shù)。 1998

11、1998年，美國(guó)總統(tǒng)比爾年，美國(guó)總統(tǒng)比爾克林頓曾當(dāng)眾宣稱，克林頓曾當(dāng)眾宣稱， 他與白宮實(shí)習(xí)生萊溫斯基他與白宮實(shí)習(xí)生萊溫斯基“沒(méi)有發(fā)生任何性關(guān)系沒(méi)有發(fā)生任何性關(guān)系”， 但萊溫斯基隨后出示了一條沾有克林頓精液的藍(lán)裙但萊溫斯基隨后出示了一條沾有克林頓精液的藍(lán)裙 子。子。8 8個(gè)月后，克林頓不得不被迫承認(rèn)錯(cuò)誤個(gè)月后，克林頓不得不被迫承認(rèn)錯(cuò)誤 一樣的一樣的PCR、一樣的美國(guó)人、一樣的美國(guó)人 ( (二二): PCR): PCR技術(shù)基本原理技術(shù)基本原理 PCRPCR由由變性變性-退火退火-延伸延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 1): 1): 模板模板DNADNA的的變性變性：模板：模板DNA

12、DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至9494左右后，雙鏈左右后，雙鏈 DNADNA變性為單鏈變性為單鏈DNA DNA ； 2): 2): 模板模板DNADNA與引物的與引物的退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )：溫度降至：溫度降至5555左右，引左右，引 物與模板物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 3): 3): 引物的引物的延伸延伸：DNADNA模板模板-引物結(jié)合物在引物結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的 作用下，以作用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保 留復(fù)制原理，合成一條新的與模板留復(fù)制原理

13、，合成一條新的與模板DNA DNA 鏈互補(bǔ)的鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈半保留復(fù)制鏈 重復(fù)循環(huán)變性重復(fù)循環(huán)變性-退火退火-延伸三過(guò)程延伸三過(guò)程，就可獲得更多的，就可獲得更多的“半保半保 留復(fù)制鏈留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一 個(gè)循環(huán)需個(gè)循環(huán)需2 24 4分鐘，分鐘， 2 23 3小時(shí)就能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)小時(shí)就能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn) 倍。倍。 PCRPCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCRPCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNADNA擴(kuò)增量呈指數(shù)擴(kuò)增量呈指數(shù) 上升。最終的上升。最終的DNA DNA

14、擴(kuò)增量可用下列公式計(jì)算擴(kuò)增量可用下列公式計(jì)算 Y Y(1(1X)X)n n Y Y代表代表DNADNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X X表示平表示平(Y)(Y)均每次均每次 的擴(kuò)增效率，的擴(kuò)增效率，n n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值 為為100%100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺(tái)期產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺(tái)期 Theoretical increase Log Target DNA Cycle # Reality Y(1X)n 反應(yīng)初期，靶序列反應(yīng)初期，靶序列DNADNA片段的增

15、片段的增 加呈指數(shù)形式，隨著加呈指數(shù)形式，隨著PCRPCR產(chǎn)物的逐漸產(chǎn)物的逐漸 積累，被擴(kuò)增的積累，被擴(kuò)增的DNA DNA 片段而進(jìn)入線性片段而進(jìn)入線性 增長(zhǎng)期或靜止期，增長(zhǎng)期或靜止期， 即出現(xiàn)即出現(xiàn)“停滯效停滯效 應(yīng)應(yīng)” ” ，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期(Plateau).(Plateau). ( (引物、引物、 dNTPdNTP反應(yīng)原料消耗、反應(yīng)原料消耗、 PCR PCR 擴(kuò)增效率及擴(kuò)增效率及DNADNA聚合酶種類和活聚合酶種類和活 性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩匦约胺翘禺愋援a(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩? )。 大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是 不可避免的。到達(dá)平臺(tái)期所需

16、循環(huán)次不可避免的。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次 數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物 長(zhǎng)片段產(chǎn)物長(zhǎng)片段產(chǎn)物 短片段產(chǎn)物短片段產(chǎn)物 長(zhǎng)片段產(chǎn)物和短片段產(chǎn)物是由于引物所結(jié)合的模板不一長(zhǎng)片段產(chǎn)物和短片段產(chǎn)物是由于引物所結(jié)合的模板不一 樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中， 以兩條互補(bǔ)的以兩條互補(bǔ)的DNADNA為模板，引物是向?yàn)槟０?，引物是?3端開始延伸，端開始延伸， 其其55端端 是固定的，是固定的，3 3 端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)長(zhǎng) 產(chǎn)物片段

17、產(chǎn)物片段”。 進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新 合成的鏈合成的鏈( (即即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段長(zhǎng)產(chǎn)物片段”) )結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)，結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)， 由于新鏈模板的由于新鏈模板的55端序列是固定的，端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片這就等于這次延伸的片 段段33端被固定了止點(diǎn)，端被固定了止點(diǎn)， 保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于 引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”。 短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)

18、引物鏈55端之間，端之間， 是需要擴(kuò)增的特定片段。是需要擴(kuò)增的特定片段。 “ “短產(chǎn)物片段短產(chǎn)物片段”按按指數(shù)倍數(shù)增加指數(shù)倍數(shù)增加 “ “長(zhǎng)產(chǎn)物片段長(zhǎng)產(chǎn)物片段”以以算術(shù)倍數(shù)增加（原始模板算術(shù)倍數(shù)增加（原始模板 拷貝拷貝X X 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)， 幾乎可以忽略不計(jì)，幾乎可以忽略不計(jì)， 這使這使 得得PCRPCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠 純純DNADNA片段供分析與檢測(cè)用。片段供分析與檢測(cè)用。 Y(1X)n PCR 原理原理 演示演示 : (三三): PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： Total volume 100ul

19、(20-100ul) 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 各各10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul PCRPCR反應(yīng)五要素：反應(yīng)五要素： 引物、引物、TaqTaq酶、酶、dNTPdNTP、模板、模板、 MgMg2+ 2+ 1: 1: 引物：引物： 引物是引物是PCRPCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵特異性反應(yīng)的關(guān)鍵 PCR PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNADNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的 程度。理論上

20、，只要知道任何一段模板程度。理論上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列， 就就 能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCRPCR就可就可 將模板將模板DNADNA在體外大量擴(kuò)增在體外大量擴(kuò)增. . 引物量：引物量： 每條引物的濃度每條引物的濃度1010100pmol100pmol，以最低，以最低 引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起 錯(cuò)配錯(cuò)配, , 非特異性擴(kuò)增和二聚體的機(jī)會(huì)。非特異性擴(kuò)增和二聚體的機(jī)會(huì)。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 1): 1): 引物長(zhǎng)度：引物長(zhǎng)度：

21、 15-30bp15-30bp，常用為，常用為20bp20bp左右。左右。 2): PCR2): PCR產(chǎn)物：產(chǎn)物： 200-500bp200-500bp，可擴(kuò)增長(zhǎng)至，可擴(kuò)增長(zhǎng)至30kb30kb的片段。的片段。 3): 3): 引物堿基：引物堿基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%，G+CG+C太少擴(kuò)增效果不佳，太少擴(kuò)增效果不佳， G+CG+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGCATGC最好隨機(jī)分布，避免最好隨機(jī)分布，避免4 4個(gè)個(gè) 單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。單一堿基的連續(xù)出現(xiàn)。 4): 4): 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)

22、，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別 是是33端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體二聚體。 3 5 3 5 3 5 3 5 Stable Interaction Amplification Primer Dimers 5): 5): 引物引物33端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基，以避免因末端堿基 不配對(duì)而導(dǎo)致不配對(duì)而導(dǎo)致PCRPCR失敗。失敗。 6): 6): 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú) 明顯同源性明顯同源性. . 7): 7): 引物引物55端加上合適的酶切位點(diǎn)，這對(duì)被擴(kuò)增的靶序列端加

23、上合適的酶切位點(diǎn)，這對(duì)被擴(kuò)增的靶序列 的酶切分析或分子克隆很有好處。在算的酶切分析或分子克隆很有好處。在算TmTm值時(shí)不算值時(shí)不算, , 但但 在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們?cè)跈z測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們 8): 8): 使用兼并引物時(shí)使用兼并引物時(shí), , 要參考密碼子使用表要參考密碼子使用表, ,注意生物的注意生物的 偏好性偏好性, ,不要在不要在33端使用兼并引物端使用兼并引物, ,并使用并使用 較高的引物較高的引物 濃度濃度(1uM-3uM) (1uM-3uM) 9): 9): 最好學(xué)會(huì)使用一種最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5, Oligo6, design

24、software. PP5, Oligo6, DNAstarDNAstar, Vector NTI, Online, Vector NTI, Online desgindesgin et al. et al. 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則續(xù)： 2: 2: 酶及其濃度酶及其濃度 兩種兩種TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: : 1): 1):一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶 2): 2): 基因工程酶基因工程酶 催化一典型的催化一典型的PCRPCR反應(yīng)約需酶量反應(yīng)約需酶量: 2.5U(: 2.5U(總反應(yīng)體積為總反應(yīng)體積為 100ul)1

25、00ul) 濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物 量減少。量減少。 3: 3: dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度的質(zhì)量與濃度 dNTPdNTP的質(zhì)量與濃度和的質(zhì)量與濃度和PCRPCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，擴(kuò)增效率有密切關(guān)系， dNTPdNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性 。用。用1M 1M Tris.HCLTris.HCL的緩沖液的緩沖液7.07.07.57.5配成高濃度后，小配成高濃度后，小 量分裝，量分裝， -20-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTPdNTP降解。

26、降解。 在在PCRPCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，dNTPdNTP應(yīng)為應(yīng)為5050200umol/L200umol/L，4 4種種dNTPdNTP 的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就的濃度要相等，如其中任何一種濃度偏高或偏低，就 會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過(guò)低又會(huì)降低PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTPdNTP 能與能與MgMg2+ 2+結(jié)合，使游離的 結(jié)合，使游離的MgMg2+ 2+濃度降低。 濃度降低。 4: 4: 模板核酸模板核酸 DNA DNA 粗制品及總粗制品及總RNARNA均可作為擴(kuò)增模板均可作為擴(kuò)增模板 模板核酸的量與純化程度，是模板核酸的量與純化程度

27、，是PCRPCR成敗與否的關(guān)成敗與否的關(guān) 鍵環(huán)節(jié)之一。鍵環(huán)節(jié)之一。 一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解 細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基 因游離，直接用于因游離，直接用于PCRPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。 RNA RNA模板提取一般采用模板提取一般采用KitKit提取，要防止提取，要防止RNaseRNase降降 解解RNARNA，。，。 5: Mg5: Mg2+ 2+濃度 濃度 Mg Mg2+ 2+對(duì) 對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在 一般的一般

28、的PCRPCR反應(yīng)中，各種反應(yīng)中，各種dNTPdNTP濃度為濃度為200umol/L200umol/L時(shí)，時(shí)， MgMg2+ 2+濃度為 濃度為1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L為宜。為宜。 Mg2+ Mg2+濃度濃度過(guò)高過(guò)高，反應(yīng)，反應(yīng)特異性降低特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)，出現(xiàn)非特異擴(kuò) 增。增。 Mg2+濃度濃度過(guò)低過(guò)低會(huì)會(huì)降低降低TaqTaq DNA DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使，使 反應(yīng)產(chǎn)物減少。反應(yīng)產(chǎn)物減少。 ( (四四): PCR): PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件: : 1.1.溫度溫度 ( (變性變性- -退火退火- -延伸延伸) ) 2.2.時(shí)間時(shí)間 ( (變性變性-

29、 -退火退火- -延伸延伸) ) 3.3.循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 1: 1: 變性溫度與時(shí)間：變性溫度與時(shí)間： 94 30-60 sec94 30-60 sec 變性溫度低，解鏈不完全。變性溫度低，解鏈不完全。 一般情況下，一般情況下，9393941min941min足以使模板足以使模板DNADNA變性變性 溫度過(guò)高，高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影響。溫度過(guò)高，高溫環(huán)境對(duì)酶的活性有影響。 不完全變性，就會(huì)導(dǎo)致不完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCRPCR失敗。失敗。 2: 2: 退火溫度與時(shí)間退火溫度與時(shí)間： 40 4060 3060 3060sec60sec 退火溫度是影響退火溫度是影響PCRPCR特異性的特異性的較重

30、要因素較重要因素 退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還 有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適 的溫度：的溫度： Tm Tm值值( (解鏈溫度解鏈溫度)=4(G+C)=4(G+C)2(A+T)2(A+T) 復(fù)性溫度復(fù)性溫度=Tm=Tm值值-(5-(510)10) 在在TmTm值允許范圍內(nèi)，值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和 模板間的非特異性結(jié)合，模板間的非特異性結(jié)合， 提高提高PCRPCR反應(yīng)的特

31、異性。復(fù)性時(shí)間一般為反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為 303060sec60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 3: 3: 延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度與時(shí)間：常用溫度為常用溫度為7272 TaqTaq DNA DNA聚合酶的生物學(xué)活性：聚合酶的生物學(xué)活性： 707080 15080 150核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 6070 60核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 55 2455 24核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 PCRPCR反應(yīng)的延伸常用溫度為反應(yīng)的延伸常用溫度為7272，過(guò)高的延伸溫度不利于引，過(guò)高的延伸溫度不利于引 物和模板的結(jié)合。物和模

32、板的結(jié)合。PCRPCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng) 度而定，一般度而定，一般1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時(shí)間片段，延伸時(shí)間1min1min是足夠是足夠 的。的。3 3 4kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；擴(kuò)增；擴(kuò)增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min。延伸進(jìn)間過(guò)。延伸進(jìn)間過(guò) 長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。 低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。 4: 4: 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù): :25254040次次 循環(huán)次數(shù)決定循環(huán)次數(shù)決定PCRPC

33、R擴(kuò)增程度。擴(kuò)增程度。PCRPCR循環(huán)次數(shù)主要取決循環(huán)次數(shù)主要取決 于模板于模板DNADNA的濃度。模板的濃度。模板DNADNA少少 , ,酶質(zhì)量活性差酶質(zhì)量活性差, , 適當(dāng)適當(dāng) 增加循環(huán)次數(shù)增加循環(huán)次數(shù). . 一般的循環(huán)次數(shù)選在一般的循環(huán)次數(shù)選在25254040次之間，次之間， 循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 ( (五五): PCR): PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 PCR PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增 ，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì) 其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定。其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定。 1

34、. 1. 凝膠電泳分析：凝膠電泳分析：PCRPCR產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EBEB溴乙錠染色紫外儀下觀溴乙錠染色紫外儀下觀 察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCRPCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù) 計(jì)的一致。計(jì)的一致。 2. 2. 酶切分析：根據(jù)酶切分析：根據(jù)PCRPCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng) 的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒的酶切、獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒 定，還能進(jìn)行變異性研究。定，還能進(jìn)行變異性研究。 3. 3. 分子雜交：分子雜交是檢測(cè)分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCRPCR產(chǎn)物特異性的有

35、力證據(jù)，產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)， 也是檢測(cè)也是檢測(cè)PCR PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。產(chǎn)物堿基突變的有效方法。 4. 4. 核酸序列分析：是檢測(cè)核酸序列分析：是檢測(cè)PCRPCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。產(chǎn)物特異性的最可靠方法。 ( (六六): PCR ): PCR 條件優(yōu)化條件優(yōu)化 1: 1: 理想的理想的primers: primers: 特異地特異地與目的序列兩側(cè)的單一與目的序列兩側(cè)的單一 DNA DNA序列而非其他序列而非其他DNADNA序列退火的引物序列退火的引物 2: 2: 優(yōu)化反應(yīng)試劑濃度優(yōu)化反應(yīng)試劑濃度: : a): Mg a): Mg離子的作用主要是離子的作用主要是 dNTPd

36、NTP-Mg -Mg 與核酸骨架相與核酸骨架相 互作用互作用 并能影響并能影響PolymerasePolymerase的活性，一般的的活性，一般的 情況下情況下 Mg Mg的濃度在的濃度在0.5-5mM0.5-5mM之間調(diào)整，調(diào)整了之間調(diào)整，調(diào)整了 dNTPsdNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整MgMg離子的濃度離子的濃度; ; b): NH4+ K+ b): NH4+ K+都會(huì)影響都會(huì)影響PCRPCR，增加，增加K+K+的濃度后的濃度后, , 會(huì)會(huì) 因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的 溫度溫度, ,從而降低了從而降低

37、了PCRPCR的的 嚴(yán)謹(jǐn)性嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency)(stringency)，NH4+NH4+也也 有相同的作用有相同的作用; ; c): polymerase c): polymerase ：不同公司的酶質(zhì)量活性有所不：不同公司的酶質(zhì)量活性有所不 同同, ,需要自己摸索適合的酶的濃度需要自己摸索適合的酶的濃度; ; d): template d): template 50ul PCR SYSTEM 50ul PCR SYSTEM = = human DNA 0.1ug-1ug human DNA 0.1ug-1ug E.ColiE.Coli 10ng-100ng 10ng-100ng L

38、amadaDNALamadaDNA 0.5ng-5ng 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng = = 3: 3: 溫度溫度: : a. a. denaturationdenaturation 常規(guī)是先常規(guī)是先9494度變性度變性5 5分鐘分鐘, GC Rich, GC Rich的摸板是的摸板是9595度度5 5分鐘分鐘 ; ; 然后然后9494度度30-60S.30-60S. b. annealing b. annealing 重點(diǎn)：重點(diǎn)：一般情況下一般情況下, , 是從是從Tm - 5CTm - 5C度根據(jù)情況配合以度

39、根據(jù)情況配合以MgMg 離子濃度進(jìn)行調(diào)整離子濃度進(jìn)行調(diào)整. . 有條件的可以做有條件的可以做gradient gradient pcrpcr. . 退退 火的時(shí)間在火的時(shí)間在30-60S, 30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果時(shí)間短一些可以得到更好的效果. . 因?yàn)橐驗(yàn)? polymerase , polymerase 在在 annealing temp. annealing temp.時(shí)也會(huì)有一些時(shí)也會(huì)有一些 活性活性. . 所以在所以在annealingannealing的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), , 會(huì)極大的增加非會(huì)極大的增加非 特異性擴(kuò)增，如從特異性擴(kuò)增，如從gDNAgDNA里擴(kuò)增

40、大片段里擴(kuò)增大片段, , 還可使用還可使用two two step PCR. step PCR. 4: touchdown PCR 4: touchdown PCR 原理很簡(jiǎn)單原理很簡(jiǎn)單, ,連續(xù)降低連續(xù)降低annealing tempannealing temp從從Tm+5 - Tm-10Tm+5 - Tm-10 度度C C 。ANNEALING TEMP. 55ANNEALING TEMP. 55度度 94 5min 94 30s 94 5min 94 30s 6060 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 59 59

41、30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5858 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5151 30s 72 1min 2cycles 30s 72 1min 2cycles 94 30s 94 30s 5050 30s 72 1min 20cycles 30s 72 1min 20cycles 72 5min 72 5min 5: hot start PCR 5: hot start PCR 熱啟動(dòng)熱啟動(dòng)PCRPCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，是除了好的引物

42、設(shè)計(jì)之外，提高提高PCRPCR特特 異性最重要的方法之一。異性最重要的方法之一。 TaqTaq DNA DNA聚合酶的最佳延伸溫度在聚合酶的最佳延伸溫度在7272，聚合酶，聚合酶 在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)配制過(guò)程反應(yīng)配制過(guò)程 中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)中，以及在熱循環(huán)剛開始，溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn) 生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就 會(huì)被有效擴(kuò)增。會(huì)被有效擴(kuò)增。 hot start polymerase 激活：激活：94度度 10-15min 限制限制TaqTaq

43、DNA DNA聚合酶活性的常用方法是聚合酶活性的常用方法是: : a): a): 在冰上配制在冰上配制PCRPCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCRPCR 儀。方法儀。方法 簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性. . b): b): 在反應(yīng)體系達(dá)到在反應(yīng)體系達(dá)到9090度時(shí)，度時(shí)，PAUSEPAUSE，將溫度保持在，將溫度保持在 7070度以上，手工加入度以上，手工加入polymerasepolymerase，但這個(gè)方法，但這個(gè)方法 過(guò)于煩瑣，過(guò)于煩瑣， 尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。 c): c):

44、 其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本 成成 分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模分，入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模 板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)， 因蠟熔化而因蠟熔化而 把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這 樣的酶。樣的酶。 d): hot start polymerase 94 d): hot start polymerase 94度度 10-15min10-15min 6: Booster PCR (6: Booste

45、r PCR ( 熱心的擁護(hù)者熱心的擁護(hù)者, , 后推的人后推的人, , 支持者支持者, , 后援者后援者, , 調(diào)壓器調(diào)壓器) ) 開始幾個(gè)開始幾個(gè)cyclescycles保持保持primerprimer的低濃度的低濃度 1ug human genomic DNA 1ug human genomic DNA 大約在大約在3X100,0003X100,000個(gè)模板分子個(gè)模板分子, ,這這 樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. . 當(dāng)模板的濃度過(guò)低當(dāng)模板的濃度過(guò)低, ,比如低于比如低于100100個(gè)分子時(shí)個(gè)分子時(shí), , 引物和模板之引物和模板之 間

46、就很難發(fā)生反應(yīng)間就很難發(fā)生反應(yīng). . 引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體. .這樣這樣 就有來(lái)具體是這樣的就有來(lái)具體是這樣的. .開始幾個(gè)開始幾個(gè)cyclescycles保持保持primerprimer的低濃度的低濃度, ,保保 證證primer:templateprimer:template的的molar ratiomolar ratio在在10, 000,000 10 10, 000,000 10 0,000,000:1. 0,000,000:1. 以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性. .然后然后boostebooste Primer Primer 的濃

47、度到正常的水平的濃度到正常的水平 7: 7: 循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度 確定循環(huán)數(shù)的基本原理是確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: : 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分 析操作的最小循環(huán)數(shù)析操作的最小循環(huán)數(shù). . 產(chǎn)物的量不夠產(chǎn)物的量不夠, , 優(yōu)化的方法有優(yōu)化的方法有: : 1): 1): 增加增加TEMPLATE TEMPLATE 2): 2): 增加循環(huán)數(shù)增加循環(huán)數(shù) 如何確定循環(huán)數(shù)：做一個(gè)如何確定循環(huán)數(shù)：做一個(gè)PCRPCR體系體系,40,40循環(huán)循環(huán),50ul, ,50ul, 分分 別在別在20,25,30,3520,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,5ul,一起跑

48、電泳分析一起跑電泳分析. . 從而確定最佳的循環(huán)數(shù)從而確定最佳的循環(huán)數(shù) 另一個(gè)會(huì)影響另一個(gè)會(huì)影響PCRPCR特異性的是特異性的是PCR cyclingPCR cycling時(shí)在兩個(gè)溫時(shí)在兩個(gè)溫 度間變化的速率度間變化的速率(ramping rate).(ramping rate).當(dāng)然是越高當(dāng)然是越高 越好越好. . 8: thermal cycler 8: thermal cycler PCRPCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視儀的因素我們經(jīng)常容易忽視. .長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整 PCRPCR儀儀, ,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度以保證其能夠到達(dá)正確的溫度. . 現(xiàn)在的現(xiàn)在的P

49、CRPCR儀基本上儀基本上 都有自檢功能都有自檢功能(self-diagnosis). (self-diagnosis). 9: PCR 9: PCR增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑 enhancerenhancer實(shí)在是多種多樣實(shí)在是多種多樣. .基本的原理不外是增加引物退火基本的原理不外是增加引物退火 特異性特異性, ,減少錯(cuò)配減少錯(cuò)配, , 增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量: : dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%, formamide at 5%, trimethylammonium chloride 10-100uM, detergents such as Tw

50、een 20 0.1-2.5% , polyethylene glycol (PEG)6000 5- 15% ，glycerol 10-15% , single stranded DNA binding proteins ，Gene 32 protein 1nM , E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM ，7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP , Taq Extender (stratagene) ， Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) ,

51、Q- solution(Qiagen) 10: Template DNA preparation10: Template DNA preparation 提取提取DNADNA時(shí)的試劑會(huì)抑制時(shí)的試劑會(huì)抑制PCRPCR反應(yīng)的順利進(jìn)行反應(yīng)的順利進(jìn)行. .因此因此 需要對(duì)需要對(duì)TEMPLATE DNATEMPLATE DNA進(jìn)行純化進(jìn)行純化. .特別是特別是SDS(0.01%) SDS(0.01%) 的的 情況下就能強(qiáng)烈抑制情況下就能強(qiáng)烈抑制PCRPCR的進(jìn)行的進(jìn)行. . 可以加入一些可以加入一些 nonionicnonionic試劑試劑, ,如如TweenTween, , NonidNonid, ,

52、 TritionTrition之類的反過(guò)來(lái)之類的反過(guò)來(lái) 抑制抑制SDS. SDS. 還有還有proteinaseproteinase K K也要除干凈也要除干凈, , 不然會(huì)降解不然會(huì)降解 polymerase. polymerase. 11: Nested PCR 11: Nested PCR 簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō) 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物兩對(duì)引物, , 一對(duì)是長(zhǎng)的一對(duì)是長(zhǎng)的, , 一對(duì)是包一對(duì)是包 含在長(zhǎng)引物內(nèi)的含在長(zhǎng)引物內(nèi)的, , 用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增 的模板的模板, ,這樣可以增加產(chǎn)物的量這樣可以增加產(chǎn)物的量. . 而且可以減少非特異而且可以減少非特異

53、性帶和錯(cuò)配的情況性帶和錯(cuò)配的情況. . Use Clean Bench (Hood) Use Nuclease free tubes Use Aerosol Resistant Tips Use Calibrated Micropipettor Use Large Volumes (5uL and up) Pipette Into Each Reaction Vessel Only Once (七): PCR儀技術(shù)的發(fā)展史 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品： 第一代：手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增 用三個(gè)恒溫水浴箱，分別將三個(gè)水浴溫度恒定在三個(gè)溫度：PCR 的高溫變性溫度（如9

54、4）低溫復(fù)性溫度（如58），適溫延 伸溫度（如72）。用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴， 標(biāo)本在每個(gè)水浴箱中恒溫的時(shí)間用秒表計(jì)時(shí)。 特點(diǎn)是：勞動(dòng)強(qiáng)度大，容易因疲勞引起差錯(cuò)；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡(jiǎn) 單，它無(wú)須升降溫過(guò)程，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，液體污染等。 機(jī)械手裝置，替代上述手工移動(dòng)標(biāo)本過(guò)程，形成了機(jī)械手 水浴式基因擴(kuò)增儀，該改進(jìn)解決了實(shí)驗(yàn)人員的高強(qiáng)度勞動(dòng)問(wèn)題， 但又帶來(lái)了一個(gè)機(jī)械手部件大行程頻繁相對(duì)運(yùn)動(dòng)而引起的高故 障。 第二代：自動(dòng)化控制型定性基因擴(kuò)增儀第二代：自動(dòng)化控制型定性基因擴(kuò)增儀 也有人稱該種擴(kuò)增儀為干式基因擴(kuò)增儀，它是最具也有人稱該種擴(kuò)增儀為干式基因擴(kuò)增儀，它是最具 代表性的擴(kuò)增儀，包括后續(xù)介紹

55、的第三代、第四代都代表性的擴(kuò)增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都 是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測(cè)部分。第二代的定是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測(cè)部分。第二代的定 性性PCRPCR只能判斷陰性陽(yáng)性，而無(wú)法評(píng)價(jià)特定核酸的濃度只能判斷陰性陽(yáng)性，而無(wú)法評(píng)價(jià)特定核酸的濃度 及定量分析及定量分析 第三代：終點(diǎn)定量第三代：終點(diǎn)定量/ /半定量半定量 自從自從19961996年美國(guó)年美國(guó)ABIABI公司發(fā)明第一臺(tái)熒光定量公司發(fā)明第一臺(tái)熒光定量 PCRPCR儀以來(lái)，儀以來(lái)，PCRPCR技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展. .終終 點(diǎn)定量點(diǎn)定量PCRPCR的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備投資少。終點(diǎn)定量的優(yōu)點(diǎn)

56、是設(shè)備投資少。終點(diǎn)定量PCRPCR技術(shù)是技術(shù)是 從定性向?qū)崟r(shí)定量過(guò)渡的一個(gè)中間產(chǎn)品從定性向?qū)崟r(shí)定量過(guò)渡的一個(gè)中間產(chǎn)品. . 第三代：終點(diǎn)定量第三代：終點(diǎn)定量/ /半定量半定量(Terminal detection(Terminal detection） 終點(diǎn)檢測(cè)法就是終點(diǎn)檢測(cè)法就是PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析和定擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析和定 量檢測(cè)的一種方法。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)量檢測(cè)的一種方法。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)PCRPCR終產(chǎn)物的定量檢測(cè)，必須對(duì)終產(chǎn)物的定量檢測(cè)，必須對(duì) PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)先標(biāo)志。產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)先標(biāo)志。 目前標(biāo)志物有：放射性同位素和非放射性標(biāo)志物。后者包括目前標(biāo)志物有

57、：放射性同位素和非放射性標(biāo)志物。后者包括 螺旋結(jié)構(gòu)染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素螺旋結(jié)構(gòu)染料（如溴化乙錠等）、地高辛、生物素以及熒光素 （包括普通熒光素如（包括普通熒光素如FamFam、TRAMATRAMA和鑭系螯合物等），地高辛、生和鑭系螯合物等），地高辛、生 物素以及熒光素可以通過(guò)標(biāo)志物素以及熒光素可以通過(guò)標(biāo)志dNTPdNTP或引物的或引物的55端從而摻入端從而摻入PCRPCR擴(kuò)擴(kuò) 增產(chǎn)物中，除熒光素標(biāo)志產(chǎn)物可直接發(fā)光外，其余可與增產(chǎn)物中，除熒光素標(biāo)志產(chǎn)物可直接發(fā)光外，其余可與HRPHRP或或AKPAKP 標(biāo)志的抗地高辛標(biāo)志的抗地高辛抗體抗體或親和素反應(yīng)，加入底物后產(chǎn)生顏色

58、、發(fā)光或親和素反應(yīng)，加入底物后產(chǎn)生顏色、發(fā)光 或熒光信號(hào)，從而進(jìn)行檢測(cè)。這些標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)志的是檢測(cè)時(shí)的或熒光信號(hào)，從而進(jìn)行檢測(cè)。這些標(biāo)志物進(jìn)行標(biāo)志的是檢測(cè)時(shí)的 捕獲劑或是作為定量檢測(cè)的指示劑捕獲劑或是作為定量檢測(cè)的指示劑. . 終點(diǎn)法檢測(cè)要特別注意終點(diǎn)法檢測(cè)要特別注意“平臺(tái)效應(yīng)平臺(tái)效應(yīng)”對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 第四代：實(shí)時(shí)定量第四代：實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)PCR (real-time PCR) 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)于技術(shù)于19961996年由美國(guó)年由美國(guó)Applied Applied BiosystemsBiosystems公司推出，由于該

59、技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCRPCR從定從定 性到定量的飛躍，而且與常規(guī)性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCRPCR相比，它具有特異性相比，它具有特異性 更強(qiáng)、有效解決更強(qiáng)、有效解決PCRPCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)， 目前已得到廣泛應(yīng)用。目前已得到廣泛應(yīng)用。 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)：實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)： PCRPCR儀儀實(shí)時(shí)熒光定量試劑實(shí)時(shí)熒光定量試劑+ +電腦電腦+ +自動(dòng)分析軟件，自動(dòng)分析軟件，。 常規(guī)常規(guī)PCR基于產(chǎn)物擴(kuò)增終點(diǎn)分析基于產(chǎn)物擴(kuò)增終點(diǎn)分析 凝膠電泳分析 5 Template Cycle 1 5 2X Template 4X

60、Template 30-40 cycles Cycle 2 5 5 5 5 對(duì)目的基因的有無(wú)進(jìn)行定性分析對(duì)目的基因的有無(wú)進(jìn)行定性分析 適用定性分析，不適適用定性分析，不適 合定量分析；合定量分析； PCR PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度從產(chǎn)物的長(zhǎng)度從 100bp 100bp 數(shù)數(shù)kbkb 實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè): :每個(gè)循環(huán)都每個(gè)循環(huán)都 產(chǎn)出熒光信號(hào)產(chǎn)出熒光信號(hào) 絕對(duì)定量，靈敏度更高絕對(duì)定量，靈敏度更高 PCRPCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度一般在產(chǎn)物的長(zhǎng)度一般在 60-150 bps60-150 bps 產(chǎn)物持續(xù)增加直到平臺(tái)期 Real-time PCR 在指數(shù)期線性范圍內(nèi)進(jìn)行熒光檢測(cè). Theoretical increa