蛋白類藥物生產(chǎn)

1、蛋白類藥物生產(chǎn)工藝蛋白質(zhì)類藥物是生化藥物中非常活躍的一個領(lǐng)域， 目前的生化產(chǎn)品主要是從動物臟器 或組織包括人的血液中分離而得。 20 世紀(jì) 70 年代后，人們開始應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)一 些蛋白質(zhì)藥物，已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品如胰島素、干擾素、白細(xì)胞介素、生長素、EPO、tPA、 TNF 等，現(xiàn)正從微生物和動物細(xì)胞的表達(dá)轉(zhuǎn)向基因動植物發(fā)展。第一節(jié) 主要蛋白質(zhì)類藥物的制備 蛋白質(zhì)類藥物主要包括蛋白質(zhì)類激素、蛋白質(zhì)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、血漿蛋白質(zhì)類、黏 蛋白、膠原蛋白及蛋白酶抑制劑等，其作用方式包括對機體各系統(tǒng)和細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)、被 動免疫、替代療法等。一、蛋白質(zhì)激素類 蛋白質(zhì)類激素主要包括垂體蛋白質(zhì)激素、

2、促性腺激素和其他蛋白質(zhì)激素。其中垂體蛋 白質(zhì)激素包括 生長素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲狀腺素 (TSH)、促卵泡激素 (FSH)等。促 性腺激素包括人絨毛膜促性腺激素 (HCG) 、血清促性腺激素 ( SGH )等。其他蛋白質(zhì)激素包 括胰島素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。(一) 生長素 (growthhormone，GH) 生長素是動物腦垂體前葉外側(cè)的特異分泌細(xì)胞分泌的一種促進(jìn)生長的蛋白質(zhì)激素， 具 有調(diào)節(jié)生長與發(fā)育的功能，對多種人類疾病有很好的療效。人生長素( human growth hormone，hGH)由一條 191 個氨基酸的多肽構(gòu)成的一鏈多肽 的球形蛋白質(zhì)， 分子中含兩條二硫

3、鍵， 分子量為 21700，等電點 4.9，沉降系數(shù) S20，W 2.179， 其活性不需要整個分子結(jié)構(gòu)， N 端 1134氨基酸為活性所必需， C 端的肽鏈起到保護(hù)作用， 其化學(xué)結(jié)構(gòu)與催乳素近似，故生長素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生長素作用。生長素 包含大小兩個環(huán)，以親水球蛋白的形式存在。不同種類動物的生長素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與免疫 性質(zhì)等都有較大差別。 生長素的生產(chǎn)工藝有傳統(tǒng)的方法和基因工程技術(shù)方法。1生長素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法傳統(tǒng)方法是從腦垂體前葉分離純化，其生產(chǎn)工藝見圖 11-1 所示。提取分級沉淀前處理傳統(tǒng)的工藝過程如下 材料獲取 處死動物，立即解剖，取出腦垂體，冰上速凍， -20 冷凍保存。

4、 預(yù)處理 腦垂體使用前，用蒸餾水沖洗數(shù)次，解凍，剝離前后葉。 勻漿 取動物垂體前葉，分割成小塊，加水，用硫酸銨調(diào) pH 至 5.5，置組織搗碎 機中勻漿。 提取 對勻漿以水抽提， 10 000rpm離心 30min；取沉淀，以 pH 4.0的0.1molL 硫 酸銨溶液抽提，離心（同上） ，取沉淀，再用 pH 5.5的 0.25molL 的硫酸銨溶液抽提，離 心，取上清抽提液。 沉淀 調(diào)節(jié)抽提液 pH 7.5，加飽和硫酸銨溶液至硫酸銨濃度為 lmol L，離心，取上 清液。 再沉淀 對上清液再加飽和硫酸銨溶液至 1.8molL ，離心，得沉淀。 除鹽 將沉淀溶于少量蒸餾水中，對蒸餾水進(jìn)行透析，

5、得透析內(nèi)液。 等電點沉淀 將所得透析內(nèi)液用 HCL 或NaOH分別依次于 pH 4.0和 pH 4.9進(jìn)行等 電點沉淀以除去雜蛋白，離心、取上清液。 鹽析 調(diào)上清液 pH為 4.0，加飽和硫酸銨溶液至濃度為 1.25molL鹽析，離心，得 沉淀物。 除鹽 將沉淀物溶于少量蒸餾水中，對含 0.1molL 氯化鈉的 Tris-HCL (pH 8.5) 緩 沖溶液進(jìn)行透析，得透析內(nèi)液。凝膠過濾 透析內(nèi)液上 Sephades G-75凝膠柱，用含 0.1 mol L 氯化鈉的 50mmol L Tris-HCL (pH 8.5 )緩沖溶液進(jìn)行洗脫，分步收集，活性 GH 存在于第峰中。透析 將活性峰部分

6、對 6.5mmolL的硼砂-鹽酸(pH 8.7)緩沖溶液進(jìn)行透析， 得透析 內(nèi)液。層析 將透析內(nèi)液上 DEAE-C(DE-52)柱，用含 00.3molL 氯化鈉的 6.5mmolL 硼砂-鹽酸 ( pH 8.0 ) 緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，合并活性峰，脫鹽，凍干得 GH。2人生長素的基因工程法hGH 的種屬特異性很強， 動物生長激素不能用于人， 所以開始時 hGH的惟一來源是從 人尸體的腦垂體中取得，來源困難，價格昂貴，應(yīng)用受到限制。目前已利用基因工程技術(shù) 生產(chǎn)出 hGH，美國的 Genentech公司利用枯草桿菌系統(tǒng)表達(dá)的 hGH 產(chǎn)量高達(dá) 1.5g/L，這也 是第一代重組人生長激素，商品名

7、稱為 Protropin.生產(chǎn)路線如圖 11-2 所示。圖 11-2 利用基因工程菌生產(chǎn)生長素的工藝路線()1)工藝過程如下： 工程菌的構(gòu)建 利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高效分泌型基因工程菌株，在生長激素的N-端增加分泌信號肽序列， 使表達(dá)合成的重組人生長激素結(jié)構(gòu)和天然人生長激素完全一致。 菌種繁殖 采用 M9 培養(yǎng)基，添加 CAA（ 酪蛋白氨基酸 ） ，調(diào)節(jié) pH 至 70，置于搖 床上， 30，進(jìn)行菌種培養(yǎng)繁殖。 發(fā)酵 培養(yǎng)基同菌種繁殖培養(yǎng)基， 種子培養(yǎng)過夜，開始進(jìn)行發(fā)酵，時間一般為 1618h， 溫度為 37，pH7.07.5，溶解氧不能低于 20%。 補料發(fā)酵 在發(fā)酵進(jìn)行 57 h后，需要適量

8、補充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、 CAA、 無機鹽和微量無素，如 PO43-、Fe2- 、 Co2- 等離子，通過添加補料，可使菌體生長的對數(shù)期 延，發(fā)酵菌體產(chǎn)量增加了一倍。 其余的發(fā)酵條件與上述條件相同， 菌體生長至穩(wěn)定期放罐。 。 離心 將發(fā)酵菌體進(jìn)行凍融破碎，按一定比例，加入預(yù)冷的由 10 mmol/L Tris 和 1mmol/L EDTA 組成的緩沖溶液（ pH 7.5），80rpm 攪拌 1h，離心，收集上清液。 粗提 在上清液中加入硫酸銨至飽和濃度 45%，4放置 2h，10000rpm離心 30min， 收集沉淀。 脫鹽 沉淀用 10 mmol/L Tris 和 1mmol/LE

9、DTA 組成的 pH 值為 8.0 的緩沖溶液溶解， 用 Sephadex -G25脫鹽。 純化 采用 Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose 進(jìn)行色譜，再加入固體硫酸銨達(dá)到 飽和濃度 45%，沉淀 2h，離心，收集沉淀，溶解沉淀，再通過sephacryl S-11HR 及DEAE-Sepharose進(jìn)行純化，得到人生長激素原料藥半成品 .。（2）質(zhì)量檢驗：質(zhì)量必須符合 2005 年版二部附錄規(guī)定。 目前，人和動物生長素基因都已在大腸桿菌中表達(dá)成功，重組人生長激素將會得到大 規(guī)模的生產(chǎn)，從而造福人類。（二） 胰島素 （ insulin ）胰島素是胰臟中胰島 細(xì)胞分泌的一

10、種蛋白質(zhì)激素，它是促進(jìn)合成代謝的激素，在調(diào)節(jié)機體糖代謝、脂肪代謝、核蛋白質(zhì)代謝方面都有重要作用，是維持血糖在正常水平的主 要激素之一。廣泛存在于人和動物的胰臟中，正常人的胰臟約含有200 萬個胰島，占胰臟總質(zhì)量的 1.5。胰島由 、 和 三種細(xì)胞組成，其中 細(xì)胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝 素，細(xì)胞制造胰島素， 細(xì)胞制造生長激素抑制因子。胰島素在 細(xì)胞中開始時是以活性 很弱的前體胰島素原存在，進(jìn)而分解為胰島素進(jìn)入血液循環(huán)，能使血糖降低，起到調(diào)節(jié)血 糖作用。臨床上主要用于治療胰島素依賴性糖尿病及糖尿病昏迷和酮癥酸中毒、精神分裂 癥、休克等。胰島素由 A、B兩條鏈組成， A 鏈含 21個氨基酸殘基，

11、B 鏈含 30個氨基酸殘基，兩鏈 之間由兩個二硫鍵相連，在 A 鏈內(nèi)部含有一個二硫鍵。不同種屬動物的胰島素分子結(jié)構(gòu)大 致相同，主要差別在 A鏈二硫橋中間的第 8位、9位和 10位上的三個氨基酸及 B鏈C末 端的一個氨基酸上，隨種屬而異，但其生理功能是相同的。生產(chǎn)胰島素的方法較多，有傳 統(tǒng)的方法和基因工程技術(shù)方法。1動物胰臟制胰島素由動物胰臟生產(chǎn)胰島素的方法較多，目前被普遍采用的是酸醇法和鋅沉淀法。現(xiàn)以酸醇法為例，介紹胰島素的生產(chǎn)工藝。其工藝路線如圖 11-3 所示。提取堿化鹽析去脂硫酸 pH3.63.8 減壓濃縮除酸性蛋白水，丙酮，氨水 pH4.24.3 鋅沉淀除堿性蛋白，結(jié)晶 檸檬酸，醋酸鋅

12、，丙酮，氨水 pH8.0,5以下過濾后調(diào) pH6.0圖 11-3 酸醇法生產(chǎn)胰島素的工藝路線1）工藝過程如下： 提取 凍胰塊用刨胰機刨碎，加入 2.32.6倍的 86 88乙醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和 5草酸，在 122攪拌提取 3h，離心。濾渣再用 1倍量 68 70乙醇和 0.4草酸提取 2h， 離心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰島素。 堿化、酸化 邊攪拌提取液邊加入濃氨水調(diào) pH 8.0 8.4 （12 2），立即過濾，除 去堿性蛋白，濾液應(yīng)澄清，并及時用硫酸酸化至 pH 3.63.8，降溫至 5，靜置 4h 以上， 使酸性蛋白充分沉淀。 減壓濃縮 吸取上清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層用帆布過濾，沉淀

13、物棄去，取上清 液，30以下減壓蒸去乙醇， 濃縮至濃縮液相對密度為 1.041.06 （約為原體積的 1 101 9 為止 ）。 去脂、鹽析 濃縮液轉(zhuǎn)入去脂鍋內(nèi)， 5min 內(nèi)加熱至 50后，立即用冰鹽水降溫至 5，靜置 34h，分離下層清液 （脂層用于回收胰島素 ）。用鹽酸調(diào) pH 2.3 2.5，于 222 攪拌加入 27 （質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) ）固體氯化鈉，保溫靜置數(shù)小時。析出物即為胰島素粗品。 精制 鹽析物按干重計算，加入 7 倍量蒸餾水溶解，再加入 3 倍量的冷丙酮，用 4molL 氨水調(diào) pH 4.24.3，然后補加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例為 73。充分?jǐn)嚢?后，低溫 5以下放置過夜

14、，次日在低溫下離心分離，取上清夜，在上清夜中加入4molL氨水使 pH 6.26.4，加入 3.6（體積分?jǐn)?shù)）的醋酸鋅溶液 （濃度為 20），再用 4molL氨水 調(diào)節(jié) pH 6.0，低溫放置過夜，次日過濾，分離沉淀。 結(jié)晶 將沉淀用冷丙酮洗滌，得干品，再按干品質(zhì)量每克加冷2檸檬酸 50mL 、6.5醋酸鋅溶液 2mL 、丙酮 16mL，并用冰水稀釋至 100mL，使其充分溶解， 5以下，用 4molL 氨水調(diào) pH 8.0，迅速過濾。濾液立即用 10檸檬酸溶液調(diào) pH 6.0，補加丙酮，使 整個溶液體系保持丙酮含量為 16。慢速攪拌 35h 使結(jié)晶析出。在顯微鏡下觀察，外形 為正方形或扁斜形

15、六面體結(jié)晶，再轉(zhuǎn)入 5左右低溫室放置 34d，使結(jié)晶完全。離心收集結(jié)晶，并小心刷去上層灰黃色無定形沉淀，用蒸餾水或醋酸銨緩沖液洗滌，再用丙酮、乙 醚脫水，離心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得結(jié)晶胰島素（ 2）質(zhì)量檢驗 測定胰島素效價， 各國藥典規(guī)定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。（3）在整個生產(chǎn)過程中，為提高胰島素的質(zhì)量和產(chǎn)量，應(yīng)注意以下幾個方面： 胰臟質(zhì)量是胰島素生產(chǎn)中的關(guān)鍵， 在我國是一個薄弱環(huán)節(jié)。 工業(yè)生產(chǎn)用的原料主要 是豬、牛的胰臟。不同種類和年齡的動物，其胰臟中胰島素量有所差別，牛胰含量一般高 于豬胰。采摘胰臟要注意保持腺體組織的完整，避免摘斷，并且離體后要立即深凍，先在 -

16、30以下急凍后轉(zhuǎn)入 -20保存?zhèn)溆?，如用液氮速凍，效果更好。在胰臟中，胰尾部分胰島 素含量較高，如單獨使用可提高收率 10。 濃縮 濃縮工序的條件，對胰島素收率影響很大。如采用離心薄膜蒸發(fā)器，在第一 次濃縮后，濃縮液用有機溶劑去脂，再進(jìn)行第二次濃縮，被濃縮溶液受熱時間極短，避免 了胰島素效價的損失。 產(chǎn)品純度 在常規(guī)的結(jié)晶胰島素中， 除了胰島素主成分外， 還含有其他一些雜蛋白 抗原成份，如胰島素原、精氨酸胰島素、胰多肽等。因此要對結(jié)晶胰島素進(jìn)一步純化，胰 島素原的含量顯著降低。2人胰島素的制備（1）酶促半合成法 豬與人的胰島素差別僅是 B30 位上的一個氨基酸，豬的是丙氨酸，人的則是蘇氨酸。利

17、用胰蛋白酶的轉(zhuǎn)酰胺作用，將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素 B30蘇氨酸 （丁?；?）丁酸，通過硅 膠柱層析，然后用三氟乙酸處理，斷裂保護(hù)基團(tuán)，再用離子交換層析純化，得到高純度人 胰島素。（2）利用基因工程技術(shù)制備目前，國際上生產(chǎn)醫(yī)用重組人胰島素 （ recombinant human insulin, rhI）的方法主要有 3 種1）用基因工程大腸桿菌 （ Escherichia coli, E.coli ）分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素 （ human insulin, hI）的 A 、B 鏈。然后經(jīng)化學(xué)再氧化法 ,使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵 ,得到 hI。這一 方法缺點較多 ,目前已較少使用。2）用

18、基因工程 E. coli 發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原 （ human proinsulin, hP I） ,后經(jīng)加工形成 h I。 這種方法， E. coli 系統(tǒng)表達(dá)量高 ,但缺點是不利于表達(dá) hI 這樣的小蛋白 ,產(chǎn)物易降解 ,故常采 用融和蛋白形式將 hPI 連接在一個較大的蛋白質(zhì)后 ,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過一系列復(fù)雜的后加工才 能形成有活性的 hI。3）通過基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn) hP I,經(jīng)后加工形成 hI 。酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表 達(dá)系統(tǒng)簡單 ,但缺點是生產(chǎn)慢 ,生產(chǎn)周期長 ,且重組蛋白分泌量少 （150 mg/L） ,產(chǎn)量低。工藝生產(chǎn)過程見圖 11-4。 菌種RRhP I/pQE-40 E.

19、coli M15 菌株 培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成為： 5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L 硫酸銨, 2.5 g/L葡萄 糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨芐青霉素, 50mg/L 卡那霉素, pH 7.2。 一次發(fā)酵將 10 ml 經(jīng)過活化的 RRhP I/ pQE-40 E.coliM15 轉(zhuǎn)移至 100 ml 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) , 活化 菌種。 發(fā)酵罐培養(yǎng)將一次發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至含有 1.5 L 培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng) （轉(zhuǎn)速為 300 r/min, 通氣量為 11. 511.8） ,一段時間后加入一定量新鮮的培養(yǎng)基并用 NaOH 調(diào)節(jié) pH。在對 數(shù)

20、生長中期加入 0.5mmol /L IPTG 并升溫誘導(dǎo) RRhPI表達(dá) 4 h,轉(zhuǎn)速隨即調(diào)為 400500 r /min, 增大通氣量至 1 1.81 2.0,繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后 ,收集菌體。 包涵體的收集和洗滌將收集的濕菌體凍存于 -20,然后懸浮于緩沖液 A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/LEDTA,50 mmol/L NaCl, 5% 甘油, 0.10.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 5 6 ml/g濕菌)中,加入溶菌 酶( 5 mg/g濕菌體) ,室溫或 37振蕩 2 h。冰浴超聲 10 s 30次,其間每次間隔 20 s,功率為 200W。1

21、0條件下 1000 g離心 5 min 去除細(xì)胞碎片。上清液中的包涵體 ( Inclusion body, IB) 在4 條件下 27000 g離心15 min收集,然后用含 2 mol/L 尿素的緩沖液 A充分懸浮,室溫靜 置 30 min 后 4 條件下 17000 g離心 15 min,收集沉淀。沉淀再用含 2%脫氧膽酸鈉的緩沖 液A充分懸浮, 4 條件下 17000 g離心 15min,收集沉淀。最后沉淀用 10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3洗滌兩次 (4,17000 g離心 15 min ) 。 RRhPI 的初步純化將收集的 IB用含有 0.1%0.3% -巰基乙醇

22、的緩沖液 B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿 素, pH 8.0)溶解,上于已用緩沖液 B平衡的 DEAE-Sepharose FF柱,用合適的氯化鈉梯度洗脫 , 收集含 RRhPI 的洗脫液。 RRhPI 的重組復(fù)性將初步純化后的 RRhPI通過 Sephadex G-25脫尿素,轉(zhuǎn)換緩沖液為不同 pH 的50 mmol/L Gly-NaOH 重組液,或含有適量 GSSG的 Gly-NaOH 緩沖液中 ,使蛋白終濃度為 0.10.6 mg/ml, 收集趨于正確折疊的 RRhPI單體組分,加入適量 GSH 和GSSG,4放置 24 h。 酶切轉(zhuǎn)化向 RRhPI 復(fù)

23、性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶 , 37酶切一段時間 , 然后用 0.1 mol/L ZnCl 2 終止反應(yīng)并沉淀生成的 hI。 hI 的純化將 0.6g IB 分別用含 0.1%, 0.2%, 0.3% -巰基乙醇的 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿素 , pH8.0 溶解,進(jìn)行 DEAE-Sepharose FF 離子交換層析 ,然后將收集得到的 RRhPI 組分通過 Sephadex G-25脫尿素以使 RRhPI 復(fù)性。圖 11-4 利用基因工程菌生產(chǎn)人胰島素的工藝路線 (仿自李曉紅， 2007 )蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子包括干擾素

24、( IF)、，、白細(xì)胞介素 1-18 (IL) ，神經(jīng)生 長因子( NGF)、肝細(xì)胞生長因子 (HGF) ，血小板衍生的生長因子 (PDGF)，腫瘤壞死因子 (TNF) ，集落刺激因子 (CSF)，組織纖溶酶原激活因子 (t-PA)，促紅細(xì)胞生成素 (EPO)，骨發(fā) 生蛋白(BMP)等。(一) 干擾素 ( Interferon ,IFN )干擾素指由干擾素誘生劑誘導(dǎo)有關(guān)生物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類高活性、多功能的誘生蛋白 質(zhì)。這類誘生蛋白質(zhì)從細(xì)胞中產(chǎn)生和釋放之后，作用于相應(yīng)的其它同種生物細(xì)胞，并使其 獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的 “免疫力 ”，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的 作用，是人體防御

25、系統(tǒng)的重要組成。人干擾素根據(jù)其來源細(xì)胞不同，分為白細(xì)胞干擾素 (IFN-、)類淋巴細(xì)胞干擾素 (IFN- 與 IFN-的混合物 )、成纖維細(xì)胞干擾素 (IFN- 、)T 細(xì)胞 干擾素 (IFN- 等)幾類。按其抗原性的不同，分為 型、 型和 型三種，同一型別，根據(jù) 氨基酸序列的差異， 又分為許多亞型，如常用的 IFN-包括 IFN- a、IFN- Ib和 IFN-b 等亞型。干擾素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破壞， 不被 DNase 和 RNase 水解破壞等特性。干擾素的生產(chǎn)方法有傳統(tǒng)的體外誘生法和基因工程法。1傳統(tǒng)的體外誘生法 傳統(tǒng)的方法是通過體外誘生的方法獲

26、得干擾素。干擾素具有高度的種屬特異性，臨床 使用的干擾素都用人的細(xì)胞制備， -干擾素用人血白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞制備； -干擾素用人成纖維細(xì)胞制備。 目前我國已完善了利用血庫血大量制備人血細(xì)胞干擾素的方法， 達(dá)到 106Umg 蛋白的水平。其工藝路線見圖 11-5圖 11-5 誘生法生產(chǎn)干擾素的工藝路線(1)工藝過程如下： 分離灰黃層 取新鮮血液 400mL/ 份，加入 ACD 抗凝劑，離心，分離出血漿，小心 抽取灰黃層。每份血可抽取 1315mL，放置 4冰箱中過夜。 氯化銨處理 每份灰黃層加入 30mL 緩沖鹽水， 再加入 9 倍體積量的 0.83 冷氯化 銨，混勻， 4放置 10min，4離心

27、(8000 r/min) 20min。棄上清液，加入適量緩沖鹽水，收 集沉淀細(xì)胞，制備懸浮液，重復(fù)上次處理，溶解殘存的紅細(xì)胞。取沉淀的白細(xì)胞懸于培養(yǎng) 液中，冰浴保存，取樣作活細(xì)胞計數(shù)。 啟動誘生 于白細(xì)胞懸浮液加入白細(xì)胞干擾素，使其濃度為100 gmL，37水浴攪拌培養(yǎng) 2h。 正式誘生 啟動后的白細(xì)胞加入仙臺病毒 (在 10 天齡雞胚中培養(yǎng) 48 72h，收獲尿 囊液)使其最后濃度為 100150血凝單位 mL，在37攪拌培養(yǎng)過夜。 仙臺病毒誘導(dǎo)人白 細(xì)胞產(chǎn)生。 收集 將培養(yǎng)物離心 (2500 r/min) 30min ，吸取上清液即得粗制干擾素。 純化 在粗制干擾素中加入硫氰化鉀到 0.5

28、molL，用鹽酸調(diào) pH為 3.5，離心，得 沉淀l。沉淀1加入原體積 15量的冷乙醇( 94)，離心，得上清液 1。上清液 1用鹽酸調(diào)節(jié) pH 5.5 ，離心棄去沉淀，再調(diào)至 pH 5.8 ，離心，得上清液 2 和沉淀 2。沉淀 2 加入原體積 150量的甘氨酸-鹽酸緩沖液 (pH 2)溶解，得 IFNl 。上清液 2用NaOH調(diào)節(jié) pH值至 8.0， 離心，棄上清液，得沉淀 3。沉淀3加原體積 150量的0.lmolL PBS和0. 5molL硫氰 化鉀(pH 8)溶解，pH值降至5.2，離心，得上清液 3和沉淀 4。 沉淀4加原體積 125000 量pH 為8.0的0.1molL PBS

29、溶解，調(diào)至 pH為77.5，對 PBS ( pH 7.3)透析，過夜，離 心，收集上清液，檢測，得 IFN- 。調(diào)節(jié)上清液 3 pH值為3.0，離心，得沉淀 5。沉淀 5加 入原體積 15000量的 pH 8.0，0.1molL PBS，加NaOH調(diào)節(jié)pH 77.5，對 PBS ( pH7.3) 透析過夜，離心，收集上清液，檢測，得 IFN- 。(2)質(zhì)量檢驗 我國用微量板染色的病變抑制法測定。國際上規(guī)定，能保護(hù)50%細(xì)胞免受病毒攻擊的濃度即為一個 IFN 活性單位。該法特點是一次純化量大， 回收率高于 60；經(jīng)濟，簡便，易于普及，效價可達(dá) 1.2 108U mL，比活 2.2 106 Umg

30、(蛋白)。IFN-中干擾素含量占回收干擾素的 82，比活也比較 高。2基因工程法 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，運用基因工程技術(shù)，已能在人體外大規(guī)模地生產(chǎn)人干擾素即基 因工程干擾素。 目前，編碼干擾素的基因已能在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動物細(xì)胞中得到表達(dá)。 、 三型基因工程干擾素都已研制成功，并投放市場，用于治療的病種達(dá) 20 多種。我國衛(wèi)生部 已批準(zhǔn)生產(chǎn)的干擾素品種有 IFN- l、b IFN- a、IFN- b和IFN-r 四種。目前，人們在利 用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制活性更高，更適于臨床應(yīng)用的干擾素類似物和干擾素雜合體等各種 新型干擾素。生產(chǎn)技術(shù)路線如圖 11-6 所示圖 11-6 利用基因工程生產(chǎn)干擾

31、素的工藝路線 基因工程菌的構(gòu)建首先從產(chǎn)生干擾素的白細(xì)胞中提取干擾素 mRNA ，對其進(jìn)行分級分離。通過蟾蜍卵母 細(xì)胞找出活性最高的 mRNA ，并用此 mRNA 合成 cDNA 。將 cDNA 與含四環(huán)素和氨芐抗性 基因的質(zhì)粒 pBR322 重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K12，得到重組子質(zhì)粒。對每個重組子用粗提的 干擾素 mRNA 進(jìn)行雜交，把得到的雜交陽性克隆中的重組質(zhì)粒 DNA 放到無細(xì)胞合成系統(tǒng) 中進(jìn)行翻譯。對翻譯體系的產(chǎn)物進(jìn)行干擾素活性檢測。再將干擾素的 cDNA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌 表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌在特定條件下進(jìn)行高效表達(dá)。其生產(chǎn)流程如圖 11-7 所示。圖 11-7 構(gòu)建干擾素工程菌的一

32、般流程 工程菌的發(fā)酵a. 種子制備 將構(gòu)建的基因工程菌傳代后于 -70下甘油管中保存。如構(gòu)建的人干擾素 -b 基因工程菌 SW-IFN-abE.coli-DHSa。質(zhì)粒用 PL 啟動子，含氨芐西林抗性基因。 使用時進(jìn)行活化。b. 種子罐培養(yǎng) 將菌種按 1種量接種到種子培養(yǎng)基， 種子培養(yǎng)基的配方： 1蛋白胨、0.5酵母提取物、 0.5NaCl；30搖床培養(yǎng) 10h，作為發(fā)酵罐種子使用。c. 發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方： 1蛋白胨、0.5酵母提取物、0.01NH4Cl、0.05 NaCl、0.6Na2HP04、0.001CaCl2、0.3KH2P04、0.01MgS04、0.4葡萄糖、 50mg

33、 mL 氨芐西林、少量防泡劑。用 15 L 發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為 10 L， pH 6.8， 攪拌 500 r/min，通風(fēng)比為 1：1 (m3min) ，溶氧為 50。30發(fā)酵 8h，然后在 42誘導(dǎo) 2 3h完成發(fā)酵。同時每隔不同時間取 2mL 發(fā)酵液，在 10 000 r/min 離心除去上清液，稱量菌 體濕重。在整個發(fā)酵過程中，要注意： ( 1)不同發(fā)酵階段培養(yǎng)基的成分有差異； ( 2)培養(yǎng)液中 要有足夠的溶解氧，不同的培養(yǎng)階段需要的溶解氧量也不同，通常通過增大攪拌速度，增 加空氣流量或者通入純氧來滿足條件； (3)發(fā)酵過程中在不同的階段應(yīng)控制不同的 pH，發(fā) 酵后期要降

34、低 pH，減少干擾素的水解；(4)要控制適當(dāng)?shù)臏囟?，既要保證菌體細(xì)胞膜的完 整和細(xì)胞中酶的活性，又要有利于提高干擾素的產(chǎn)量。 產(chǎn)物的提取與純化a.提取 發(fā)酵結(jié)束后，冷卻，離心 (4000 r/min)，30min，收集沉淀，得濕菌體。取濕菌 體懸浮于 20mmol L 的磷酸緩沖液 (pH 7.0)中，冰浴中進(jìn)行超聲破碎，釋放干擾素蛋白。 4000 r/min 離心 30min，得沉淀，用含 8mol L 尿素、20mmol 磷酸緩沖液 (pH 7.0)、0.5mmol L二巰基蘇糖醇溶液，室溫攪拌抽提 2h，然后 15000 r/min離心 30min。取上清液，用 20mmol L 磷酸緩

35、沖液 (pH 7.0) 稀釋至尿素濃度為 0.5mol L ，加二巰基蘇糖醇至 0.1mmolL，4 攪拌 15h，15000 r/min 離心 30min，除去不溶物。上清液經(jīng)截流量為 104相對分子質(zhì)量的中 空纖維超濾器濃縮，將濃縮的人干擾素b 溶液經(jīng)過 SephadexG-50 分離，層析柱(2cml00cm)先用 20mmolL 磷酸緩沖液 (pH 7.0)平衡，上柱后用同一緩沖液洗脫分離，收 集人干擾素 b 部分，經(jīng) SDS-PAGE檢查。b純化 將Sephadex G-50柱分離的人干擾素 b組分，再經(jīng) DE-52 柱(2cm50cm) 純化，人干擾素 b 組分上柱后用含 0.05

36、mol L 、0.1mol L、0.15mol L NaCl 的 20mmolL 磷酸緩沖液 (pH 70)分別洗滌，收集含人干擾素 b 的洗脫液。全過程蛋白質(zhì)回收率 為 20 25，產(chǎn)品不含雜蛋白、 DNA 及熱原質(zhì)。干擾素 b 含量符合要求。3干擾素質(zhì)量檢驗 基因工程干擾素半成品和成品均應(yīng)作檢測，包括干擾素效價、蛋白質(zhì)含量及比活性、 純度測定 、相對分子質(zhì)量、殘余外源性 DNA 含量、殘余血清 IgG 含量、殘余抗生素活性 、 干擾素效價測定、無菌試驗、熱原質(zhì)試驗。成品檢測：物理性狀 凍干制品外觀應(yīng)為白色或微黃色疏松體，加入注射水后，不 得含有肉眼可見的不溶物； 鑒別試驗 應(yīng)用 EIASA

37、 或中和試驗鑒定 ,結(jié)果為陽性； 水分 測定 用卡氏法，水分含量應(yīng)低于 3。半成品也要進(jìn)行無菌試驗、熱原質(zhì)試驗、干擾素 效價；安全試驗 取體重 350400g豚鼠 3 只，每只腹側(cè)皮下注射劑量為人每千克體重 臨床使用最大量的 3 倍，觀察 7 天，若豚鼠局部無紅腫、壞死、總體重不下降，則說明成 品合格。(二) 人紅細(xì)胞生成素 ( rhEPO)1結(jié)構(gòu)與性質(zhì)紅細(xì)胞生成素 (EPO)是一種糖蛋白， 是調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞， 對紅細(xì)胞生成有特異刺激作用 的細(xì)胞因子，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，在成人體內(nèi)主要由腎臟分泌，在病理狀態(tài)下， 與多種貧血尤其與終末期腎臟疾病貧血密切相關(guān)。紅細(xì)胞生成素有兩種，天然人紅細(xì)

38、胞生 成素和重組人紅細(xì)胞生成素。天然人紅細(xì)胞生成素是以人的尿、血等為原料，經(jīng)生物化學(xué) 方法純化得到。 重組人紅細(xì)胞生成素是以重組 DNA 技術(shù)生產(chǎn)的紅細(xì)胞生成素， 將人紅細(xì)胞 生成素的基因連接到表達(dá)載體上， 轉(zhuǎn)化 CHO 細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清夜中純化紅細(xì)胞生成素。 兩種人紅細(xì)胞生成素具有相同的體內(nèi)體外活性，根據(jù)其糖基的不同，可以分為rhEPO-和rhEPO-兩種。2生產(chǎn)工藝圖 11-8 利用基因工程菌生產(chǎn)人紅細(xì)胞生成素的工藝路線工藝路線如圖 11-8 所示。 克隆并篩選人紅細(xì)胞生成素基因 獲得人紅細(xì)胞生成素基因的方式有兩種， 一種 提取人胚胎 mRNA ，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 文庫，篩選文庫，

39、得到人紅細(xì)胞生成素基因，也可 以通過篩選人胚胎基因組文庫獲得。另一種是提取胚胎染色體 DNA ，通過 PCR 擴增獲得 基因片段，再體外拼接。 構(gòu)建紅細(xì)胞生成素基因表達(dá)載體 與編碼紅細(xì)胞生成素基因片段相連的表達(dá)載體 有 pDSVL 、pSV2 和 pD11。以構(gòu)建攜帶編碼人紅細(xì)胞生成素基因的核苷酸序列（ prEP）的 質(zhì)粒為例進(jìn)行說明。從人胚胎中提取總 RNA ，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, 進(jìn)行文庫篩選，得到人 紅細(xì)胞生成素基因， 將該基因與載體在連接體系中過夜 , 加入 T4 DNA 連接酶。挑取單菌落 接種于 5mL 培養(yǎng)基， 37過夜。 建立紅細(xì)胞生成素表達(dá)的細(xì)胞株 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物細(xì)

40、胞，經(jīng)篩選得到所 需要的細(xì)胞系，凍存?zhèn)溆谩?重組細(xì)胞株的培養(yǎng) 將凍存的細(xì)胞株取出， 37水浴解凍，離心，棄去凍存液。 采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，將解凍的細(xì)胞株接種于適量的 DMEM 培養(yǎng)基， 37、CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，連續(xù)傳代三次。采用消化酶將細(xì)胞消化，使細(xì)胞濃度為 2.5 106 個/mL，接種。采用生 物反應(yīng)器培養(yǎng)重組細(xì)胞株，采用 DMEM 培養(yǎng)基，加含小牛血清，控制條件 pH 7.0、攪拌速 度小于 50 r/min, 37、DO為 50 80，使細(xì)胞貼壁；細(xì)胞貼壁后提高轉(zhuǎn)速 80100 r/min， 培養(yǎng) 10d；更換無血清培養(yǎng)基在進(jìn)行灌流培養(yǎng)， 在此過程中， 連續(xù)收獲培養(yǎng)液， 在 4 8

41、保存。 紅細(xì)胞生成素的分離純化 采用三步法純化紅細(xì)胞生成素，將培養(yǎng)液通過濾膜過 濾，上 CM-Sephrose親和色譜柱， CM 柱預(yù)先用 Na-HAc-異丙醇活化， 20mmol/L Tris-HCL 平衡緩沖液平衡，然后用 02mol/L Tris 洗脫液洗脫，收集洗脫峰， 10mmol/L Tris 透析液 中透析過夜。透析過程中，透析液的體積為蛋白液體積的 15倍，換液 4 次， 0.22um濾膜 過濾?；钚越M分上平衡過的 DEAE 離子交換柱， 01mol/L NaCL-HCL 洗脫液洗脫，收集 活性洗脫峰，再上 10乙腈平衡的 RP-HPLC 柱， 10 70的乙腈洗脫液洗脫，收集

42、活 性洗脫峰，再用 20mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液平衡凝膠柱，并進(jìn)行洗脫，收集活性洗脫峰， 即為紅細(xì)胞生成素。 紅細(xì)胞生成素的活性檢測 紅細(xì)胞生成素的活性可以通過放射免疫分析和體內(nèi)生 物活性分析，體內(nèi)生物活性的測定可以采用網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法。在生產(chǎn)過程中， 重組細(xì)胞株的培養(yǎng)必須要注意是無菌條件、 溫度 37、氣體交換可靠、 pH 穩(wěn)定 7.07.2、葡萄糖是必不可少的碳源，另外采用生物反應(yīng)器時要能及時添加培養(yǎng)液 保證連續(xù)培養(yǎng)、載體要有足夠的表面積，使得細(xì)胞株得以高密度、高表達(dá)連續(xù)培養(yǎng)。 (三)白細(xì)胞介素 -2(Interleukin-2 ，IL-2)白細(xì)胞介素 (interleukin ，IL

43、) 由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和 介導(dǎo)作用的一類細(xì)胞因子，是淋巴因子家族的一員。目前已有IL-1 18。許多白細(xì)胞介素不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的相互作用，還參與其他細(xì)胞如造血干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等的相互作用。 IL-2 主要由 T 細(xì)胞或 T 細(xì)胞系產(chǎn)生， 脾臟、 淋巴結(jié)和扁桃腺中的 T 細(xì)胞受到刺激后都能產(chǎn)生 IL-2 ，人和動物某些 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系 或腫瘤細(xì)胞在有絲分裂原、鈣離子載體 （如 A23187） 或 PMA 刺激下可產(chǎn)生高水平的 IL-2 白細(xì)胞介素的生產(chǎn)方法有傳統(tǒng)的體外誘生法和基因工程法。1. 白細(xì)胞介素 -2 的傳

44、統(tǒng)生產(chǎn)方法IL-2 是由輔助 T 細(xì)胞經(jīng)抗原或 有絲分裂 原等刺激，在巨噬細(xì)胞或單核細(xì)胞分泌的 IL-1參與下，產(chǎn)生并分泌的含 133 個氨基酸的糖蛋白，分子量為 15420。在 pH 為 29 范圍內(nèi) 穩(wěn)定， 56 1h內(nèi)仍具有活性。臨床上主要用于治療一些免疫功能不全及癌癥的綜合治療白細(xì)胞介素 -2 的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是通過誘生的方法獲得。工藝路線如圖 11-9 所示誘生除雜蛋白濃縮洗脫 凝膠層析圖 11-9 誘生法生產(chǎn)白細(xì)胞介素 -2 的工藝路線 誘生 用加入雞瘟病毒和 PHA 的培養(yǎng)液培養(yǎng)人外周血白細(xì)胞，這兩種物質(zhì)起到聯(lián)合刺激的作用， 37培養(yǎng)。 除變性蛋白 用 6molL HCl 調(diào)節(jié) p

45、H2.02.5，再用 6molL NaOH 調(diào)回到 pH7.2 7.4，離心除去變性雜蛋白。 硫酸銨分級沉淀 取上述離心后的培養(yǎng)上清液，加飽和硫酸銨至 35飽和度， 4 靜置 24h，離心棄去沉淀。上清液補加固體硫酸銨至 85飽和度， 4靜置 24h，離心，收 集沉淀。 透析 將沉淀溶于 pH 6.5、10mmolL PBS中（內(nèi)含 2正丁醇和 0.15mol/L NaCL） 對pH 6.5、10mmolL PBS透析24h(更換 5次透析外液)。 藍(lán)色瓊脂糖層析 將上述透析內(nèi)液通過 Sepharose4B層析柱，用 PBS 洗去不吸附的 蛋白，再用含 0.4molL NaCl的PBS洗滌親和

46、柱，最后用含 1.0molL NaCL 的PBS解吸 IL-2 活性組分。 凝膠層析 將解吸的 IL-2 活性組分經(jīng)分子量為 6000 的 PEG 濃縮，再上 ACA44U1-trogel 層析柱。柱用含 0.1PEG、 2正丁醇和 pH7.6 的 0.5molL 甘氨酸的 0.2mol/L Tris-HCL 洗脫，得 IL-2 。2基因工程 IL-2 的制備目前國內(nèi)用酵母、動物細(xì)胞培養(yǎng)和用大腸桿菌基因重組的 IL-2 都已批準(zhǔn)生產(chǎn)，并用于 臨床。 重組 IL-2 的獲得過程中，已成功地利用大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞來表達(dá)重組 人 IL-2 ，但在大量生產(chǎn)重組 IL-2 中主要是使用大腸桿菌

47、。 基因工程菌的構(gòu)建從 ConA 激活的人白血病 T 細(xì)胞株提取高活性 IL-2 的 mRNA 作為模板，逆轉(zhuǎn)錄單鏈 cDNA ，經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，在 cDNA 末端連接若干 dCMP 殘基，再以寡聚 (dG)1218 為引物，利用 DNA 聚合酶 I 成雙鏈 cDNA ，經(jīng)蔗糖密度梯度離心法分離出此 cDNA 片段。通過 GC加尾法將此 cDNA 片段插入到 pBR322質(zhì)粒的 PstI 位點，用重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K12 株 X1776，得到 IL-2 的 cDNA 文庫。利用 mRNA 雜交試驗篩選 IL-2 cDNA 文庫得到含 IL-2 cDNA 質(zhì)粒的菌株。 已有一些

48、攜帶人突變型白細(xì)胞介素 2 ( IL-2) 的 質(zhì)粒，如 pPIC9K 等。 基因工程菌的發(fā)酵將IL-2 工程菌接種于含氨芐青霉素的 2 mL YPD 培養(yǎng)基中 , 過夜培養(yǎng) , 以1 %接種入含 100 mL BMGY的500 mL 三角瓶。 30 300 r/ min 培養(yǎng)至OD600 = 36 (大約1618 h)。棄上清液并將菌體細(xì)胞沉淀懸浮在 1/ 5 到1/ 10 原初始培養(yǎng)液體積的 BMMY 培養(yǎng)基中 ,0.5 % 到5 %甲醇誘導(dǎo)。在此過程中優(yōu)化表達(dá)條件 , 如通氣狀況、誘導(dǎo)時間（表達(dá)量隨時間延長逐 漸增加,培養(yǎng)48 h 達(dá)到高峰值）、初始pH 值、甲醇終濃度（目的蛋白量在甲醇

49、濃度為 1%時 達(dá)到最高）等。外源蛋白在甲醇酵母中的表達(dá)分 2步, 即菌體生長和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。先在以 甘油為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體 , 達(dá)到一定OD 值后, 離心, 棄去上清液 , 菌體懸浮于以甲 醇為碳源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá) , 每隔24 h 加1次甲醇 , 以彌補甲醇的損失。 IL-2 的分離IL-2 基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)酵液離心，收集菌體。菌體懸浮于 PBS 溶液中，超聲破碎，離心沉淀，用 PBS洗 3次，盡量去除雜蛋白及核酸，離心粗制包涵體， 包涵體主要含由 IL-2 單體分子聚合而成的多聚體， 不溶于水， 且其中的重組 IL-2 無生物活 性。 蛋白溶解 包涵體經(jīng)常出現(xiàn)

50、不溶解現(xiàn)象，使用高性能分散機，瞬間打開分子間的化學(xué)鍵，有利于 變性劑繼續(xù)打開蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的化學(xué)鍵，使蛋白完全溶解?？捎?mol L 鹽酸胍或 8mol L 脲或尿素使包涵體變性解聚成單分子 （變性后仍無生物學(xué)活性 ）。 IL-2 的復(fù)性采用50 mol/L CuSO的4含有PBS的溶液與 IL-2粗品以1：50體積混合后 , 置室溫過夜。 。 也可利用空氣氧化，或還原型谷胱甘肽復(fù)性，恢復(fù) IL-2 二硫鍵和正常分子結(jié)構(gòu)，獲得生物 學(xué)活性。 提高 IL-2 的復(fù)性率在復(fù)性過程中 ,只有 60%70%的 IL-2 能正確配對 ,另有 30%40%的 IL-2 則會形成錯 配體和二聚體 ,收

51、集生產(chǎn)過程中經(jīng)高效液相色譜洗脫下來的錯配體和二聚體（色譜峰的左部 分）進(jìn)行重新氧化復(fù)性 ,可以使 IL-2 的回收率提高 20%以上。 IL-2 的純化用 7mol L 尿素溶解 IL-2 包涵體，得到上清液，上清液經(jīng)過 SephadexG-100凝膠過濾和分子量為 650的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) DEAE 離子交換層析，得均一的 IL-2 ，純度高達(dá) 98， 比活性達(dá) 4.3 106Umg 蛋白，回收率為 30.8。進(jìn)一步純化重組 IL-2 是利用 IL-2 的疏水 性，經(jīng)超濾濃縮后利用反相高效液相層析 (RP-HPLC)和較高濃度的乙腈 (60 )的流動相進(jìn)行 梯度洗脫，從而得到高純度的 IL-2

52、 ；也可以通過受體親和層析一步純化， 可得到純度為 95 以上的 IL-2 。3質(zhì)量檢驗IL-2 生物活性用 3H-TdR 摻入法測定。三、血漿蛋白類血漿蛋白質(zhì)類包括白蛋白 (Alb) 、纖維蛋白溶酶原、血漿纖維結(jié)合蛋白 (FN)、免疫丙種 球蛋白，抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白， Veil， s病免疫球蛋白，抗 -D 免疫球蛋白，抗 -HBs 免疫球 蛋白，抗血友病球蛋白，纖維蛋白原 (Fg)，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子等。不 同物種間的血漿蛋白質(zhì)存在著種屬差異，雖然動物血與人血的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似，但不 能用于人體。(一)白蛋白(1) 結(jié)構(gòu)和性質(zhì)白蛋白又稱清蛋白，是人血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，約占總

53、蛋白的55，對人沒有抗原性。白蛋白為單鏈，由 584 個氨基酸殘基組成， N-末端是天冬氨酸， C-末端為亮氨酸， 相對分子質(zhì)量為 65000，pI值為 4.7，沉降系數(shù) S20,w 4.6，電泳遷移率 5.92?？扇苡谒桶?飽和的硫酸銨溶液中，一般在飽和度為 60以上的硫酸銨析出沉淀。對酸較穩(wěn)定，受熱后 聚合變性，但仍較其它血漿蛋白質(zhì)耐熱。在白蛋白溶液中加入氯化鈉或脂肪酸的鹽，能提 高蛋白的熱穩(wěn)定性，利用這種性質(zhì)，可使白蛋白與其它蛋白質(zhì)分離。從人血漿中分離的白蛋白有兩種制品：一種是從健康人血漿中分離制得的，稱人血清白蛋白；另一種是從健康產(chǎn)婦胎盤血中分離制得的，稱胎盤血白蛋白。同種白蛋白制品

54、無抗原性，主要功能是維持血漿膠體滲透壓。在臨床上用于失血性休克、嚴(yán)重?zé)齻?、低蛋白血癥等的治療。2）生產(chǎn)工藝工藝路線如圖 11-10 所示人血漿絡(luò)合分離圖 11-10 白蛋白生產(chǎn)的工藝路線工藝流程： 絡(luò)合 將人血漿放入不銹鋼夾層反應(yīng)罐內(nèi)， 開啟攪拌器，碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié) pH 8.6， 加入等體積的 2利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢?，靜置 24h，分離上清液與絡(luò)合沉淀。 解離 沉淀加無菌蒸餾水稀釋， 0.5mol L HCL 調(diào)節(jié) pH 值至弱酸性，加入 0.15 0.2氯化鈉，不斷攪拌進(jìn)行解離。充分解離后， 65恒溫 1h，立即用自來水夾層循環(huán)冷卻將解離液進(jìn)行離心，分離液用不銹鋼壓濾器澄清過濾。 超濾 澄

55、清濾液用超濾器濃縮。 熱處理 濃縮液在 60恒溫處理 10h，滅活病毒。 除菌 以不銹鋼壓濾器過濾，通過 Sartoltis 冷滅菌系統(tǒng)除菌。 分裝 白蛋白含量及全項檢查合格后， 用自動定量灌注器進(jìn)行分瓶灌裝或冷凍干燥 得白蛋白成品。本品分為 10與 25兩種蛋白濃度規(guī)格。3）質(zhì)量檢驗 性狀呈淡黃色略帶黏稠狀的澄明液體或白色疏松物體（凍干品 ），pH 6.67.2；凍干制劑水分含量不超過 1；其純度為白蛋白含量應(yīng)占蛋白含量的 95以上；殘余硫酸銨含量應(yīng)不超過 0.01（gmL） 。其它無菌試驗、安全試驗、毒性試驗、熱原試驗均應(yīng)符合衛(wèi)生部白蛋白制造及檢定人血漿供應(yīng)有限，血液來源中各種傳染病病源較

56、多 ,來自人源血漿的白蛋白在純化過程 中難免將病毒帶入最終產(chǎn)品，利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)白蛋白則可避免病毒感染。重組人血 清白蛋白成為一種趨勢。（二）人血丙種免疫球蛋白（1）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)人血丙種球蛋白即 免疫球蛋白 （ Ig ），是一類主要存在于血漿中、 具有抗體活性的糖蛋 白，其抗體成分存在于 和 r 球蛋白部分。具有被動免疫作用。免疫球蛋白約占血漿蛋白 總量的 20，除存在于血漿中外，也少量地存在于其他組織液、外分泌液和淋巴細(xì)胞的表 面。免疫球蛋白具有被動免疫、被動 -自動免疫以及非特異性。在臨床上可用于預(yù)防流行性 疾病如病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹、水痘和丙種球蛋白缺乏癥。（2）生產(chǎn)流程生產(chǎn)流程線如圖 11-11 所示圖 11-11 人血丙種球蛋白生產(chǎn)的工藝路線（3）生產(chǎn)工藝 絡(luò)合 人血漿放入不銹鋼夾層反應(yīng)罐內(nèi)，開啟攪拌器，碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH 8.6，加入等體積 2 利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢?，靜置 24h，分離上清液與絡(luò)合沉淀。 鹽析 取上清部分，在不銹鋼反應(yīng)罐中開啟攪拌器，并以 lmolL鹽酸調(diào) pH 7.0， 加 23結(jié)晶硫酸銨，充分?jǐn)嚢韬蟪恋盱o置 4h 以上。 離心 吸去清液，將下部混濁液泵入離心機中離心，得沉淀。 溶解 將沉淀用適量無熱原蒸餾水稀釋溶解。 層析 通過 DEAE-Seph