屋塵螨抗原Derp2重組恥垢分枝桿菌口服疫苗的制備及其實驗研究

1、屋塵螨抗原 Der p2 重組恥垢分枝桿菌口服疫苗的制備及其實驗研究支氣管哮喘(Asthma)是嚴重威脅人類健康的一種常見慢性疾病,其發(fā)病率和 死亡率在世界各地呈逐年上升的趨勢 ,糖皮質(zhì)激素雖能有效地控制其病癥 ,但因 其長期使用會出現(xiàn)不良反響 , 以及不能糾正機體已有的免疫紊亂和阻斷疾病進程 因此臨床上迫切需要尋找有效的途徑來預(yù)防此類變態(tài)反響性疾病的發(fā)生與開展。研究說明，變態(tài)反響性疾病患者體內(nèi)呈現(xiàn)過度的 Th2型免疫應(yīng)答，而結(jié)核桿菌等 分枝桿菌感染可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的 Thl 型免疫應(yīng)答。為改變機體對某些過敏原Th2優(yōu)勢應(yīng)答的狀態(tài),我科曾成功將屋塵螨抗原Der p2基因轉(zhuǎn)入卡介苗(BCG)

2、中表達，制備出抗原重組BCG(rBCG。經(jīng)靜脈和腹腔 注射接種后,在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了 Der p2特異性的Th1優(yōu)勢應(yīng)答。這意味著象哮喘這類對某些特定抗原過敏的疾病，可以利用抗原rBCG作為 疫苗而得到治療。但是短期內(nèi)重復(fù)注射接種 rBCG會引起局部嚴重的遲發(fā)性變態(tài) 反響而影響療效。為此，進一步給小鼠口服Der p2-rBCG,結(jié)果同樣誘導(dǎo)了抗原特異性的Th1應(yīng) 答。相關(guān)研究說明 , 口服分枝桿菌疫苗不僅能夠刺激理想的免疫應(yīng)答 , 而且經(jīng)濟方 便。然而,分枝桿菌不是腸道定植菌 ,其與腸道粘膜的親和力過低 ,大量口服還會 引起腸道正常菌群失調(diào)和口咽部感染 , 從而影響免疫效果。 研究發(fā)現(xiàn) , 空腸

3、彎曲菌 (C.jejuni) 外膜蛋白PEB1是 C.jejuni的主要粘附分子,在C.jejuni與腸道粘膜 的粘附中發(fā)揮重要作用 , 這為制備抗原特異性的腸道高親和力重組分枝桿菌口服 疫苗創(chuàng)造了條件目的1.利用基因工程手段 ,構(gòu)建能以胞壁形式表達屋塵螨 Der p2 和C.jejuni PEB1抗原的重組恥垢分枝桿菌rM.S 口服疫苗Der p2-PEB1-rM.S。2. 將Der p2-PEB1-rM.S與Der p2-rM.S 一起口服免疫小鼠,比擬兩者的生物學(xué)行為 及免疫學(xué)特性 , 為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。實驗方法和結(jié)果 1. PEB1 蛋白的表達及純化以 C.jejuni Penn

4、er O:19 標(biāo)準株基因組為模板,用PCF法擴增PEB1基因,并與pUC19克隆載體連接,經(jīng)測序證實 與Genbank公布的C.jejuni PEB1基因序列完全一致。將PEB1基因克隆入pPRO EX HTb原核表達載體,酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pPRO-PEB1并用IPTG進行誘導(dǎo)表 達。SDS-PAG分析說明成功地表達了與預(yù)期分子量一致的PEB1融合蛋白;Western-blot證實該蛋白可與抗His-mAb發(fā)生特異性反響。可溶性分析顯示 該蛋白以可溶形式存在于上清中，用Ni-NTA親和色譜法純化獲得了目的蛋白，純 度達 90%以上。2. 小鼠抗PEB1蛋白多克隆抗體的制備用皮下包埋的方法

5、,以預(yù)先轉(zhuǎn)移到硝 酸纖維素膜上的純化PEB1蛋白免疫BALB/c小鼠,共免疫三次，每次間隔2周,最 后一次免疫結(jié)束2周后收集小鼠血清，同時設(shè)生理鹽水對照。間接ELISA方法測 定免疫小鼠血清中PEB1蛋白特異性抗體滴度為1:204800。3. 胞壁表達 Der p2-PEB1 融合蛋白重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建和鑒定用 PCR 法分別擴增PEB1和Der p2基因,經(jīng)測序正確后按照相應(yīng)的酶切位點將兩者克隆 入pUC19得到Der p2-PEB1融合基因。將 Der p2-PEB1融合基因亞克隆入大腸 埃希菌-分枝桿菌穿梭胞壁表達載體pCW構(gòu)建可胞壁表達Der p2-PEB1融合蛋白的重組質(zhì)粒pCW

6、-Der p2-PEB1并經(jīng)酶切鑒定證實。將重組質(zhì)粒電穿導(dǎo)入M.S感受態(tài)細胞，經(jīng)潮霉素抗性篩選rM.S陽性克隆。陽 性rM.S經(jīng)PCF特異性擴增目的基因片段,證實其中含有目的基因。用抗Der p2單克隆抗體和制備的小鼠PEB1抗血清對rM.S進行間接免疫熒 光鑒定,證實Der p2-PEB1融合蛋白可以在M.S外表表達。4.消化道環(huán)境對重組 M.S疫苗生物學(xué)行為的影響分別以 100卩I pCW-Der p2-PEB1-rM.S、pCW-Der p2-rM.S 和 M.S(1X 1013 CFU L-1)灌胃免疫 BALB/c小鼠，連續(xù) 5 天。于首次免疫后第 1、 6、 8、 10、 14、

7、28、 56d 收集各組小鼠糞便 , 處理后涂布 于7H10瓊脂平板,培養(yǎng)后計數(shù)平板上M.S的CFU分別于末次免疫后第2、14、 28、56d處死小鼠,無菌別離腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)、脾臟和肺臟,勻漿后涂布 7H10瓊脂平板,計數(shù)平板上M.S的CFU結(jié)果顯示,各組小鼠于口服免疫后次日即可在其糞便中排出M.S,第6天最多,隨后逐漸減少 , 至免疫后 2周完全消失 , 各組之間并無差異。小鼠口服免疫結(jié)束后 第2、14、28天均能在GALT勻漿中檢出M.S,其中pCW-Der p2-PEB1-rM.S組各 時間點菌落數(shù)均較 pCW-Der p2-rM.S 組明顯增加 (P&It;0.05)。除

8、第56天外，各組小鼠在其余各時間點均能在肺中檢出少量M.S。而所有小鼠在各個時間點均未從脾臟中檢出M.S。上述結(jié)果說明，PCW-Der p2-PEB1-rM.S更易于被腸道粘膜攝取并進入 GALT5.不同親和力rM.S 口服接種刺激BALB/c小鼠免疫應(yīng)答的差異分別予以100卩l(xiāng) pCW-Derp2-PEB1-rM.S、pCW-Derp2-rM.S、M.S(1 x 1013 CFU- L-1)和甘油灌胃 免疫BALB/c小鼠，連續(xù)5天。于末次免疫后 14、 28、 56 天將小鼠摘眼球取血 , 收集血清 , 并制備脾淋巴細 胞培養(yǎng)上清，用夾心ELISA法分別測定其中IFN- 丫、IL-2和IL

9、-4水平。結(jié)果表明，兩種疫苗免疫后小鼠血清和脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子IFN- 丫、IL-2 水平均明顯升高 ,Th2 型細胞因子 IL-4 水平那么明顯下降 ; 在小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中參加Der p2刺激可使IFN- 丫、IL-2含量升高、IL-4含量降低較M.S 組更為明顯；兩種rM.S之間的比擬也發(fā)現(xiàn)，pCW-Der p2-PEB1-rM.S組較pCW-Der p2-rM.S組IFN- 丫、IL-2水平有明顯升高,而IL-4水平無明顯差異。這說明:rM.S免疫后在小鼠體內(nèi)引發(fā)的免疫反響以誘導(dǎo)Th1優(yōu)勢為主,且這種應(yīng)答是 Der p2 特異性的 ；PEB1 導(dǎo)入 rM.S 后可以提高 rM.S 口服的免疫效率。 結(jié)論:1.兩種不同親和力的 rM.S 疫苗 pCW-Derp2-PEB1-rM.S 和 pC