免疫組化雙重染色技術(shù)優(yōu)秀課件

1、2021/3/291第八章第八章. 免疫組化雙重染色技術(shù)免疫組化雙重染色技術(shù) (Double staining technology in immunohistochemistry)用免疫組化方法在同一張組織切片上同時(shí)顯示兩種或兩用免疫組化方法在同一張組織切片上同時(shí)顯示兩種或兩種以上的抗原種以上的抗原, 以發(fā)現(xiàn)其定位以發(fā)現(xiàn)其定位, 形態(tài)和功能上的相互關(guān)系形態(tài)和功能上的相互關(guān)系. 一一. 連續(xù)切片雙重染色法連續(xù)切片雙重染色法 A. 最簡(jiǎn)單最可靠最簡(jiǎn)單最可靠. 用同樣的免疫組化方法用同樣的免疫組化方法, 在兩張相鄰切在兩張相鄰切片上各顯示一種抗原片上各顯示一種抗原, 然后比較然后比較. 由于每張切

2、片上只進(jìn)行由于每張切片上只進(jìn)行一次染色一次染色, 所以不會(huì)互相干擾或出現(xiàn)假性雙標(biāo)記所以不會(huì)互相干擾或出現(xiàn)假性雙標(biāo)記. B. 切片厚度切片厚度13 m. 如果較厚如神經(jīng)組織切片如果較厚如神經(jīng)組織切片(1020 m), 可以采用可以采用“鏡像鏡像”法法, 即相鄰切片翻轉(zhuǎn)后貼在載玻片上即相鄰切片翻轉(zhuǎn)后貼在載玻片上, 或利用軟件或利用軟件PS. 2021/3/292二二. 免疫熒光雙重染色法免疫熒光雙重染色法: 用用不同的熒光色素不同的熒光色素標(biāo)記標(biāo)記不同的抗不同的抗體體, 染色后觀察染色后觀察, 相應(yīng)的抗原物質(zhì)顯示不同的顏色相應(yīng)的抗原物質(zhì)顯示不同的顏色. A. 直接法直接法: 1. 一步法一步法:

3、將將FITC (490495520530nm, 黃綠色熒光黃綠色熒光)和和TRITC (550620nm, 紅色熒光紅色熒光)分別標(biāo)記的兩種抗體按一定比例混分別標(biāo)記的兩種抗體按一定比例混合合, 使每個(gè)抗體均為最適稀釋度使每個(gè)抗體均為最適稀釋度, 然后孵育切片然后孵育切片. 2. 二步法二步法: 先后依次使用兩種熒光抗體分別孵育切片先后依次使用兩種熒光抗體分別孵育切片. 2021/3/2933. 觀察觀察: 同一個(gè)視野里同一個(gè)視野里.a. 對(duì)每一種熒光標(biāo)記物對(duì)每一種熒光標(biāo)記物(綠色或紅色綠色或紅色)使用不同的使用不同的濾色板濾色板進(jìn)行進(jìn)行觀察和照相觀察和照相, 每張照片顯示一種熒光每張照片顯示一

4、種熒光, 比較兩張照片比較兩張照片. b. 兩種熒光重疊照相兩種熒光重疊照相, 則在一張照片上可發(fā)現(xiàn)分別含不同抗則在一張照片上可發(fā)現(xiàn)分別含不同抗原的細(xì)胞原的細(xì)胞(呈綠色或紅色呈綠色或紅色), 如果兩種抗原存在于同一個(gè)細(xì)胞如果兩種抗原存在于同一個(gè)細(xì)胞或結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu), 則呈現(xiàn)兩種紅綠熒光的混合色則呈現(xiàn)兩種紅綠熒光的混合色, 如黃色如黃色. 免疫熒光雙重染色法免疫熒光雙重染色法: FITC綠色綠色, TRITC紅色紅色, 混合色為黃色混合色為黃色.2021/3/294B. 間接法間接法: 1. 兩種一抗不標(biāo)記兩種一抗不標(biāo)記, 但來(lái)自但來(lái)自不同種屬的不同種屬的動(dòng)物如兔和豚鼠動(dòng)物如兔和豚鼠. 2. 兩種來(lái)

5、源于兩種來(lái)源于同種動(dòng)物或不同種動(dòng)物或不同種動(dòng)物同種動(dòng)物的二抗的二抗(如羊抗兔如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗或羊抗兔兔IgG和豬抗豚鼠和豬抗豚鼠IgG)分別以分別以FITC和和TRITC標(biāo)記標(biāo)記. 3. 染色程序染色程序:a. 先用第一種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片先用第一種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片, 顯示第顯示第一種抗原一種抗原; 然后再用第二種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育然后再用第二種一抗和相應(yīng)的標(biāo)記二抗依次孵育切片切片, 顯示第二種抗原顯示第二種抗原. b. 將兩種一抗混合后孵育切片將兩種一抗混合后孵育切片, 再將兩種標(biāo)記的二抗混合后再將兩種標(biāo)記的二抗混合后

6、孵育切片孵育切片, 最后用熒光顯微鏡觀察最后用熒光顯微鏡觀察. 2021/3/295免疫熒光雙重染色法免疫熒光雙重染色法: FITC綠色綠色, TRITC紅色紅色, 混合色為黃色混合色為黃色.2021/3/296Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue2021/3/297三三. 免疫酶雙重染色免疫酶雙重染色A. 單酶法單酶法: 1. 原理原理: a. 用一種酶如用一種酶如 HRP標(biāo)記

7、顯示兩種不同的抗原標(biāo)記顯示兩種不同的抗原, 但用但用不同的不同的電子供體電子供體如如 DAB和和CN呈現(xiàn)不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物. b. 兩種一抗兩種一抗來(lái)自同種屬動(dòng)物來(lái)自同種屬動(dòng)物, 兩重染色之間需將第一次兩重染色之間需將第一次染色反應(yīng)中的染色反應(yīng)中的各級(jí)抗體和酶各級(jí)抗體和酶或或各級(jí)抗體各級(jí)抗體, 酶和反應(yīng)產(chǎn)物酶和反應(yīng)產(chǎn)物從組織上從組織上洗脫洗脫. c. 連續(xù)做兩次染色連續(xù)做兩次染色, 所費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)所費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng). 2021/3/298抗體抗體, 酶和反應(yīng)產(chǎn)物洗脫酶和反應(yīng)產(chǎn)物洗脫2021/3/2992. 染色的最佳條件染色的最佳條件: 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色先對(duì)兩種待檢抗

8、原分別染色, 以決定合適的以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等抗體稀釋度和反應(yīng)條件等. 3. 雙重染色的先后次序雙重染色的先后次序: a. 先顯示含量較少的抗原先顯示含量較少的抗原. b. 先顯示容易受染色過(guò)程和洗脫過(guò)程影響的組織抗原先顯示容易受染色過(guò)程和洗脫過(guò)程影響的組織抗原.c. 先用不太敏感的抗體先用不太敏感的抗體.d. 先用先用DAB顯色顯色. 4. 對(duì)照試驗(yàn)對(duì)照試驗(yàn): a. 單染對(duì)照單染對(duì)照.b. 在進(jìn)行第二次染色前在進(jìn)行第二次染色前, 要證明第一次染色的各級(jí)抗體和酶活要證明第一次染色的各級(jí)抗體和酶活性被完全除去性被完全除去, 而且洗脫后對(duì)第二個(gè)待檢抗原無(wú)影響而且洗脫后對(duì)第二個(gè)待檢抗原

9、無(wú)影響. 2021/3/29105. 抗體洗脫抗體洗脫:a. 酸洗法酸洗法: pH2.2甘氨酸甘氨酸-HCl緩沖緩沖液液(可加入適量二甲基甲酰胺可加入適量二甲基甲酰胺, DMF)14小時(shí)使抗原小時(shí)使抗原-抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物解離解離. b. 氧化法氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分分, 氧化除去氧化除去抗體抗體, 0.5% Na2S2O5漂白液脫色漂白液脫色. 第一次染色用第一次染色用CN顯色顯色, 并注意對(duì)并注意對(duì)第二種抗原的影響第二種抗原的影響.c. 甲醛蒸氣法甲醛蒸氣法: 1升容器升容器+3g多聚多聚甲醛甲醛+切片切片, 置置80

10、烤箱烤箱14小時(shí)小時(shí), 蒸汽破壞抗體的蒸汽破壞抗體的Ig結(jié)合部位結(jié)合部位.第一次用第一次用ABC法法, 氧化法洗脫抗體氧化法洗脫抗體. 對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)此為假性雙標(biāo)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)此為假性雙標(biāo).2021/3/29116. 具體操作步驟具體操作步驟: a. 方法方法1: 第一次染色后第一次染色后, 除去抗體和酶除去抗體和酶而使有色反應(yīng)終產(chǎn)而使有色反應(yīng)終產(chǎn)物留在抗原部位物留在抗原部位, 再用同樣方法進(jìn)行第二次染色再用同樣方法進(jìn)行第二次染色. *. 切片處理切片處理, 抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉同前抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉同前. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2顯色顯色.

11、 TBS洗兩次洗兩次, 每每次次510分分. *. 氧化法洗脫氧化法洗脫. TBS洗如上洗如上. *. 用用PAP法完成第二次染色法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2顯色顯色. TBS洗如上洗如上. 甘油膠封片甘油膠封片. 2021/3/2912一抗來(lái)自同種動(dòng)物的單酶法免疫酶雙重染色一抗來(lái)自同種動(dòng)物的單酶法免疫酶雙重染色 2021/3/2913大鼠垂體前葉促性腺激素細(xì)胞大鼠垂體前葉促性腺激素細(xì)胞(藍(lán)色藍(lán)色)和生長(zhǎng)激素細(xì)胞和生長(zhǎng)激素細(xì)胞(棕色棕色), 免疫免疫酶酶(PAP法法)雙重染色雙重染色.2021/3/2914b. 方法方法2: 第一次染色后第一次染色后, 照相記錄照相

12、記錄結(jié)果并記住照相視野的部結(jié)果并記住照相視野的部位位. 用有機(jī)溶劑用有機(jī)溶劑將反應(yīng)終產(chǎn)物溶解除去將反應(yīng)終產(chǎn)物溶解除去, 并將第一次染色形成并將第一次染色形成的的抗體復(fù)合物洗脫掉抗體復(fù)合物洗脫掉, 然后進(jìn)行第二次染色然后進(jìn)行第二次染色. 對(duì)同一部位再一對(duì)同一部位再一次照相次照相, 比較先后照相所得照片比較先后照相所得照片. *. 切片處理同上切片處理同上. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2顯色顯色. TBS洗兩次洗兩次, 每次每次510分分. *. 以以TBS封片封片, 照相照相(注意隨時(shí)從蓋片邊緣補(bǔ)加注意隨時(shí)從蓋片邊緣補(bǔ)加TBS, 防止切片防止切片干燥干燥).

13、 *. 去蓋片去蓋片, TBS洗洗, 再用酒精再用酒精-二甲苯二甲苯-酒精處理酒精處理, 除去除去CN藍(lán)色反藍(lán)色反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)產(chǎn)物, DDH2O洗洗. *. 氧化法洗脫氧化法洗脫, 然后然后TBS洗兩次如前洗兩次如前. *. PAP法完成第法完成第2次染色次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或或CN-H2O2顯色顯色. *. TBS洗同上洗同上, 封片封片. *. 找出第一次照相的部位找出第一次照相的部位, 再次照相再次照相. 2021/3/2915大鼠垂體前葉大鼠垂體前葉GnRH相關(guān)肽陽(yáng)性細(xì)胞相關(guān)肽陽(yáng)性細(xì)胞(左左, 藍(lán)色藍(lán)色)與促性腺激素細(xì)胞與促性腺激素細(xì)胞(右右, 棕色棕色)為同一種

14、細(xì)胞為同一種細(xì)胞, 免疫酶免疫酶(PAP法法)雙重染色雙重染色.2021/3/2916B. 雙酶法雙酶法: 1. 原理原理: a. 用兩種無(wú)關(guān)的酶分別標(biāo)記顯示兩種抗原用兩種無(wú)關(guān)的酶分別標(biāo)記顯示兩種抗原, 常用的酶為常用的酶為HRP和和AKP, 或或HRP和葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧化酶. b. 兩種一抗來(lái)源于兩種一抗來(lái)源于不同種屬的動(dòng)物不同種屬的動(dòng)物, 如兔和小鼠如兔和小鼠, 或同種動(dòng)或同種動(dòng)物物(如小鼠如小鼠)的兩種的兩種單克隆單克隆抗體抗體, 但其但其Ig亞類(lèi)不同亞類(lèi)不同, 如如IgGl和和IgG2a. c. 兩種二抗分別是抗兔兩種二抗分別是抗兔IgG和抗小鼠和抗小鼠IgG, 或抗小鼠或抗小鼠

15、IgGl和抗和抗小鼠小鼠IgG2a. 可以來(lái)自可以來(lái)自同種屬動(dòng)物或不同種屬動(dòng)物同種屬動(dòng)物或不同種屬動(dòng)物, 可以是可以是酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體(一個(gè)用一個(gè)用HRP, 另一個(gè)用另一個(gè)用AKP標(biāo)記標(biāo)記), 也可以是未標(biāo)記也可以是未標(biāo)記抗體抗體(一個(gè)用兔一個(gè)用兔PAP, 另一個(gè)用小鼠另一個(gè)用小鼠APAAP).2021/3/2917c. 可避免抗體殘留而引起的假性雙標(biāo)記可避免抗體殘留而引起的假性雙標(biāo)記, 不需中間洗脫處理不需中間洗脫處理. 由由于無(wú)交叉反應(yīng)于無(wú)交叉反應(yīng), 可將兩重染色的同一層抗體混合同時(shí)使用并可將兩重染色的同一層抗體混合同時(shí)使用并先先后顯示后顯示兩種酶的活性?xún)煞N酶的活性, 在同一張切片上獲得不

16、同顏色的反應(yīng)終在同一張切片上獲得不同顏色的反應(yīng)終產(chǎn)物產(chǎn)物, 如棕色和藍(lán)色如棕色和藍(lán)色. 如兩種抗原共存于同一個(gè)細(xì)胞如兩種抗原共存于同一個(gè)細(xì)胞, 則出現(xiàn)灰則出現(xiàn)灰紫色的混合色紫色的混合色. 2021/3/29182. 染色的最佳條件染色的最佳條件: 先對(duì)兩種待檢抗原分別染色先對(duì)兩種待檢抗原分別染色, 以決定以決定合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等合適的抗體稀釋度和反應(yīng)條件等. 3. 雙重染色的先后次序雙重染色的先后次序: 先顯示先顯示HRP, 再顯示再顯示AKP或葡萄糖或葡萄糖氧化酶氧化酶. 4. 對(duì)照試驗(yàn)對(duì)照試驗(yàn): a. 單染對(duì)照單染對(duì)照.b. 必需排除兩套抗體系統(tǒng)之間的必需排除兩套抗體系統(tǒng)之間的交

17、叉反應(yīng)交叉反應(yīng). 如第二種羊抗如第二種羊抗兔兔IgG二抗可能與第一種小鼠二抗可能與第一種小鼠IgG一抗結(jié)合而出現(xiàn)假性雙一抗結(jié)合而出現(xiàn)假性雙標(biāo)記標(biāo)記, 因此應(yīng)事先做抗體進(jìn)行交叉染色實(shí)驗(yàn)因此應(yīng)事先做抗體進(jìn)行交叉染色實(shí)驗(yàn). 2021/3/29195. 染色步驟染色步驟: 以先后使用以先后使用PAP法和法和APAAP法為例法為例. a. 切片處理切片處理, 抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉如前抑制內(nèi)源性酶及正常血清封閉如前. b. 兩種一抗混合液兩種一抗混合液(各自稀釋度由單染色決定各自稀釋度由單染色決定), 室溫室溫30分或分或4過(guò)夜過(guò)夜. TBS洗兩次洗兩次, 每次每次510分分. c. 兩種二抗混合液

18、兩種二抗混合液(各自稀釋度由單染色決定各自稀釋度由單染色決定), 室溫室溫30分分. TBS洗同上洗同上. d. PAP和和APAAP混合液混合液(各自稀釋度由單染色決定各自稀釋度由單染色決定), 室溫室溫30分分. TBS洗同上洗同上. e. 顯示顯示HRP, 如用如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 鏡下控制染色鏡下控制染色. TBS洗洗同上同上. f. 顯示顯示AKP, 如用萘酚如用萘酚AS-MX磷酸鹽加固藍(lán)磷酸鹽加固藍(lán)BB, 鏡下控制染色鏡下控制染色. TBS洗同上洗同上. g. 甘油膠封片甘油膠封片. 2021/3/29206. 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): a. 過(guò)厚過(guò)厚切片切片(7

19、m)可能出現(xiàn)混合色可能出現(xiàn)混合色(雙標(biāo)記雙標(biāo)記)的假象的假象. b. APAAP法中緩沖液用法中緩沖液用TBS而不用而不用PBS, 或至少在顯示酶或至少在顯示酶活性的一步中用活性的一步中用TBS. c. 內(nèi)源性?xún)?nèi)源性AKP一般不會(huì)引起問(wèn)題一般不會(huì)引起問(wèn)題. d. 正常血清封閉用兩種二抗來(lái)源動(dòng)物的正常血清正常血清封閉用兩種二抗來(lái)源動(dòng)物的正常血清. 四四. 免疫酶免疫酶-免疫熒光雙重染色法免疫熒光雙重染色法: 首先用免疫酶法顯示首先用免疫酶法顯示第一種抗原第一種抗原, 然后用間接免疫熒光法定位第二種抗原然后用間接免疫熒光法定位第二種抗原. 若若兩個(gè)一抗來(lái)自同一動(dòng)物兩個(gè)一抗來(lái)自同一動(dòng)物, 需要注意可能發(fā)生的需要注意可能發(fā)生的交叉反應(yīng)交叉反應(yīng).2021/3/2921五五. 免疫酶免疫酶-免疫金免疫金(銀銀)雙重染色法雙重染色法: A. 免疫酶免疫酶-免疫金雙重染色法免疫金雙重染色法: 1. 用用PAP法顯示第一種抗原法顯示第一種抗原, 為了加強(qiáng)與膠體金的紅色為了加強(qiáng)與膠體金的紅色的對(duì)比的對(duì)比, 用用CN顯色顯色(藍(lán)色藍(lán)色), 如該抗原存在于神經(jīng)如該抗原存在于神經(jīng), 則用則用DAB顯色顯色. 2. 用酸洗法洗脫第一次染色的抗體復(fù)合物用