核酸知識學(xué)習(xí)

1、2021/3/141 酶水解酶水解2021/3/1422、RNAase牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) RNase I 或 RNase A 最適pH :7.0-8.2 產(chǎn)物:3-嘧啶核苷酸或3-嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸,高度專一的內(nèi)切酶RNase T1 耐熱、耐酸 產(chǎn)物:3-鳥苷酸或3-鳥苷酸結(jié)尾的寡核苷酸,專一性更高2021/3/143內(nèi)切核酸酶對內(nèi)切核酸酶對RNA的水解位點(diǎn)示意圖的水解位點(diǎn)示意圖5 p p p pOHPyPuPyPy1 p p pGACU p p pGA3 RNAase IRNAase IRNAase T1RNAase T1Pu :嘌呤嘌呤

2、Py:嘧啶嘧啶 2021/3/1443、DNase牛胰脫氧核糖核酸酶牛胰脫氧核糖核酸酶,DNase I 無堿基專一性,切斷雙鏈或單鏈DNA 產(chǎn)物:以5-磷酸為末端的寡核苷酸, 最適 pH 78牛脾脫氧核糖核酸酶牛脾脫氧核糖核酸酶,DNase 無堿基專一性, 產(chǎn)物:以3-磷酸為末端的寡核苷酸,最適 pH 45DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶2021/3/145外切核酸酶對核酸的水解位點(diǎn)外切核酸酶對核酸的水解位點(diǎn)5 p p p pOHB p p p p3 BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶（ 5 5 端外切端外切5 5得得3 3）蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶（ 3 3 端外切端外切3 3得得

3、5 5）4 非專一性核酸酶類非專一性核酸酶類可作用于可作用于RNA 或或 DNA2021/3/146二 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收1 天然天然DNA2 變性變性DNA3 核苷酸總吸收值核苷酸總吸收值2202402602800.10.20.30.4波長（波長（nmnm）光光吸吸收收123DNA的紫外吸收光譜的紫外吸收光譜最大吸收峰為最大吸收峰為260 nm2021/3/1473 核酸的變性、復(fù)性及雜交核酸的變性、復(fù)性及雜交 （一）變性（一）變性DNADNA的變性過程的變性過程部分雙螺旋解開部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團(tuán)無規(guī)則線團(tuán) 鏈內(nèi)堿基配對鏈內(nèi)堿基配對在物理、化學(xué)因素影響下在物理、化學(xué)因素影響下

4、, DNA堿基對間的氫鍵斷裂堿基對間的氫鍵斷裂,雙雙螺旋解開螺旋解開,這是一個是躍變過程這是一個是躍變過程,伴有伴有A260增加（增加（增色效增色效應(yīng)應(yīng)）,DNA的功能喪失。的功能喪失。2021/3/148變性因素:熱變性酸堿變性（pH小于4或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）變性后的理化性質(zhì):260nm吸收值升高。粘度降低,浮力密度升高。二級結(jié)構(gòu)改變,部分失活。2021/3/149 增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)增色效應(yīng):在DNA的變性過程中,摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)減色效應(yīng):在DNA的復(fù)性過程中,摩爾吸光系數(shù)減小。DNA的變性是爆發(fā)式的,變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內(nèi)

5、。2021/3/14101 Tm1 Tm:熔解溫度（熔解溫度（melting temperaturemelting temperature）Poly d(A-T)DNAPoly d(G-C) DNA的變性發(fā)生的變性發(fā)生在一個很窄的溫度在一個很窄的溫度范圍內(nèi)范圍內(nèi),通常把熱變通常把熱變性過程中性過程中A260 達(dá)到達(dá)到最大值一半時的溫最大值一半時的溫度稱為該度稱為該DNA的熔的熔解溫度解溫度,用用Tm表示。表示。 某些某些DNADNA的的TmTm值值60801001 .01 .41 .2100%A260t 0CTmTmTmTmTmTm1231232021/3/1411 熔解溫度熔解溫度（Tm）濃

6、度50ug/mL時,雙鏈DNA A260=1.00,完全變性（單鏈）A260= 1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半時,即1.185時,對應(yīng)的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在8295之間2021/3/14122、 影響影響DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性。均一性高,變性的溫度范圍越窄,據(jù)此可分析DNA的均一性。2021/3/1413G-C含量與Tm值成正比。測定Tm,可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.442021/3/1414 介質(zhì)中離子強(qiáng)度介質(zhì)中離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度高,Tm高。2021/3/1415（二）復(fù)性復(fù)性在一定條件下在一定條件下,變性變性DNA 單鏈間堿基重新

7、配對恢復(fù)單鏈間堿基重新配對恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu),伴有伴有A260減小（減小（減色效應(yīng)減色效應(yīng)）,DNA的功的功能恢復(fù)。能恢復(fù)。2021/3/1416熱變性DNA在緩慢冷卻時可以復(fù)性,快速冷卻不能復(fù)性。DNA片段越大,復(fù)性越慢;DNA濃度越大,復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Cot衡量。2021/3/1417Cot 是Co 與 t 的乘積,Co 為變性DNA（復(fù)性前）的原始濃度,以摩爾濃度（mol/L）表示,t為復(fù)性時間,以秒（s）表示。 復(fù)性分?jǐn)?shù) f = 1/1+kCot Cot 是指復(fù)性完成一半時的是指復(fù)性完成一半時的Cot值值。2021/3/1418不同DNA的復(fù)性動力學(xué)曲線。2021/3/14

8、19（三）分子雜交分子雜交2021/3/1420分子雜交的原理示意圖分子雜交的原理示意圖 不 同 來 源 的不 同 來 源 的DNA單鏈間或單單鏈間或單鏈鏈DNA與與RNA之之間只要有堿基配間只要有堿基配對的區(qū)域?qū)Φ膮^(qū)域,在復(fù)性在復(fù)性時可形成局部雙時可形成局部雙螺旋區(qū)螺旋區(qū),稱稱核酸分核酸分子雜交子雜交（hybridization）制備特定的探針制備特定的探針（probe）通過）通過雜交技術(shù)可進(jìn)行雜交技術(shù)可進(jìn)行基因的檢測和定基因的檢測和定位 研 究 。 實(shí) 例位 研 究 。 實(shí) 例:southern印跡法印跡法 2021/3/1421Southern印跡法印跡法限制片段限制片段限制性酶切割限制

9、性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記與放射性標(biāo)記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影用緩沖液用緩沖液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜帶有帶有DNA片片段的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜2021/3/1422四 核酸的沉降特性與超速離心核酸的沉降特性與超速離心沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（S） 生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉生物大分子在單位離心力場作用下的沉降速度稱為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場的作用下, ,從靜從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時間。其單位用止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度

10、所需要的時間。其單位用SvedbergSvedberg, ,即即s s表示表示, ,s=1s=11010-13-13秒。秒。 沉降系數(shù)（沉降系數(shù)（S S）與分子量（）與分子量（M M）的關(guān)系）的關(guān)系M =RTsD(1-)Svederg方程方程:2021/3/1423不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋）,密度和沉降速率不同,用Cs-Cl密度梯度離心可以將不同構(gòu)象DNA、RNA與蛋白質(zhì)區(qū)分開來這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化。2021/3/1424第四節(jié)第四節(jié) 核酸的分離核酸的分離,合成合成,鑒定和序列測定鑒定和序列測定 一一 分離分離, ,純化和定量純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài),防止降解和變性。

11、條件溫和,防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。2021/3/1425 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在,DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/L NaCl）,但不溶于低鹽溶液（0.14mol/L NaCl）,據(jù)此,采用高鹽提取,低鹽沉淀,可將DNP與RNA核蛋白分開,提取出DNP。 DNP可用水飽和的酚抽提,去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀 DNA分離純化分離純化2021/3/1426 紫外分光光度法紫外分光光度法( (A260) ) 定磷法（定磷法（DNA含磷含磷9.2%,RNA含磷含磷9.0% ） 定糖法（定糖法（DNA;二苯

12、胺法二苯胺法, RNA;苔黑酚法）苔黑酚法）（三）核酸的定量核酸的定量 2021/3/1427二 DNA的化學(xué)合成的化學(xué)合成:合成方向:3 5端5-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)。3-OH用氨基亞磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護(hù) 2021/3/1428三三 一級結(jié)構(gòu)的測定一級結(jié)構(gòu)的測定（1） 雙脫氧終止法雙脫氧終止法英國 Sanger1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu), 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎1975 設(shè)計出DNA測序法, 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎合成一段與待測DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。 2021/3/14292021/3/14302021/3/14312021/3/1432MOV:M

13、CB4.0DideoxysequencingofDNA2021/3/14332021/3/1434（2） 化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 Maxam-Gilbert , 1977原理: 利用特異性的化學(xué)裂解法,制備出長度只差一個核苷酸的片段群,然后將此片段群經(jīng)側(cè)序膠電泳和放射自顯影得到側(cè)序圖譜。 32P-GCTACGTA:在A處:32P-GCT和32P-GCTACGT在G處: 32p ,32p-GCTAC在C處:32P-G和 32P-GCTA在T處:32P-GC和32P-GCTACG2021/3/1435第五節(jié)第五節(jié) 核酸的生物學(xué)功能和實(shí)踐意義核酸的生物學(xué)功能和實(shí)踐意義 一一 核酸與遺傳信息的傳遞和表達(dá)

14、核酸與遺傳信息的傳遞和表達(dá) （一）（一）DNADNA是基本遺傳物質(zhì)是基本遺傳物質(zhì)1944 , O. Avery 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1952 , A.D Hershey 和M. Chase 噬菌體感染實(shí)驗(yàn)2021/3/1436遺傳密碼遺傳密碼: DNADNA（或（或mRNAmRNA）中的核苷酸序列與蛋）中的核苷酸序列與蛋 白質(zhì)中氨基酸序列之間的對應(yīng)關(guān)系稱白質(zhì)中氨基酸序列之間的對應(yīng)關(guān)系稱 為遺傳密碼。為遺傳密碼。密碼子密碼子(codon):mRNAmRNA上每上每3 3個相鄰的核苷酸編個相鄰的核苷酸編 碼蛋白質(zhì)多肽鏈中的一個氨基酸碼蛋白質(zhì)多肽鏈中的一個氨基酸, , 這三個核苷酸就稱為一個密碼子或這

15、三個核苷酸就稱為一個密碼子或 三聯(lián)體密碼三聯(lián)體密碼。2021/3/1437遺傳密碼字典遺傳密碼字典UACGUCAGUCAG第二位第二位 第一位第一位（5） 第三位第三位（3）UCAGUCAGUCAG2021/3/14381、密碼是無標(biāo)點(diǎn)符號的且相鄰密碼子互不重疊。密碼是無標(biāo)點(diǎn)符號的且相鄰密碼子互不重疊。2、密碼的簡并性密碼的簡并性:由一種以上密碼子編碼同一個由一種以上密碼子編碼同一個 氨基酸的現(xiàn)氨基酸的現(xiàn) 象稱為簡并性（象稱為簡并性（ dogeneracy）,對應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱對應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子為同義密碼子(Synonymous codon)。密碼的簡并性可以減少。

16、密碼的簡并性可以減少有害突變有害突變 。3、密碼的擺動性（變偶性）密碼的擺動性（變偶性）:密碼的專一性主要是由第一第二密碼的專一性主要是由第一第二個堿基所決定個堿基所決定,tRNA上的反密碼子與上的反密碼子與mRNA密碼子配對時密碼子配對時,密碼密碼子的第一、二位堿基是嚴(yán)格的子的第一、二位堿基是嚴(yán)格的,第三位堿基可以有一定的變動。第三位堿基可以有一定的變動。Crick稱這一為稱這一為變偶性變偶性（wobble）.4、密碼的通用性和變異性密碼的通用性和變異性5、 64組密碼子中組密碼子中,AUG既是的既是的Met密碼密碼,又是又是起始密起始密 碼碼;有三組有三組密碼不編碼任何氨基酸密碼不編碼任何

17、氨基酸,而是多肽鏈合成的終止密碼子而是多肽鏈合成的終止密碼子:UAG、UAA、UGA。 2021/3/1439（二） RNA 功能1、參與蛋白質(zhì)的合成2、RNA的轉(zhuǎn)錄后加工與修飾3、參與基因表達(dá)的調(diào)控4、生物催化作用2021/3/1440 二二 核酸與病變核酸與病變 （一）（一） 核酸與遺傳疾病核酸與遺傳疾病2021/3/1441（二）（二） 核酸與病毒核酸與病毒噬菌體噬菌體T2結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)頭部頭部頸圈頸圈尾部尾部基板基板尾絲尾絲尖釘尖釘2021/3/1442動物病毒切面模式圖動物病毒切面模式圖被膜（脂蛋白、被膜（脂蛋白、碳水化合物）碳水化合物）衣殼（蛋白質(zhì)）衣殼（蛋白質(zhì)）突起（糖蛋白）突起（糖蛋白）病毒粒病毒粒（DNA或或RNA）核酸核酸2021/3/1443乙肝病毒乙肝病毒艾滋病毒艾滋病毒2021/3/14443人類基因組計劃簡介人類基因組計劃簡介 （Human Genome Project,HGP） 該計劃是美國科學(xué)家在該計劃是美國科學(xué)家在1985年率先提出年率先提出,1990年正式啟動年正式啟動。美、英、德、法、日先后參加了此項(xiàng)工作。美、英、德、法、日先后參加了此項(xiàng)工作,1999年我國成為年我國成為 HGP的第六個成員國。的第六個成員國。 HGP旨在闡明人類基因組旨在闡明人類基因組DNA所具有的所