方法驗(yàn)證(131025)

1、分析測(cè)試中心 陳曉麗2013.10.25分析方法驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證一、概述1、分析方法驗(yàn)證的定義： 分析方法驗(yàn)證是證明一個(gè)分析方法適合于特定產(chǎn)品的某種分析需要的過程。2、驗(yàn)證的目的： 為了得到準(zhǔn)確、精密、可靠的數(shù)據(jù)。分析方法驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證3、分析方法驗(yàn)證相關(guān)的常用指導(dǎo)原則 各國(guó)藥典附錄： 如USP1225方法驗(yàn)證，中國(guó)藥典 2010 年版二部附錄 XIX A藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法 驗(yàn)證指導(dǎo)原則。 FDA：分析方法驗(yàn)證指南 SFDA：化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù) 指導(dǎo)原則 ICH：Q2（R1）分析方法驗(yàn)證4、適用范圍： 新建立的分析方法； 分析方法出現(xiàn)變更時(shí)； 采用藥典及其它法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的分

2、析方法； 藥品生產(chǎn)工藝變更，可能引入新的雜質(zhì)時(shí)。5、不適用范圍： 對(duì)于僅需按照實(shí)驗(yàn)室日常測(cè)試操作步驟即可測(cè)定的分析項(xiàng)目不需要進(jìn)行驗(yàn)證，如外觀、崩解時(shí)限、密度、重量、pH值、干燥失重、灰分、裝量等等。 二、分析方法驗(yàn)證過程1、準(zhǔn)備工作： 人： 有可以運(yùn)用該分析方法，經(jīng)過培訓(xùn)的人員。 儀器： 有符合要求的、經(jīng)過校準(zhǔn)的、穩(wěn)定的儀器。 驗(yàn)證方案： 有經(jīng)過批準(zhǔn)的該待驗(yàn)證分析方法的驗(yàn)證方案，其中有明確的職責(zé)規(guī)定，對(duì)于每一個(gè)步驟都有詳細(xì)的描述，對(duì)于每一個(gè)驗(yàn)證項(xiàng)目都有明確的可接受標(biāo)準(zhǔn)等等 樣品 有質(zhì)量合格的樣品，經(jīng)過準(zhǔn)用的合適的各種對(duì)照 品。（包括工作對(duì)照品、各雜質(zhì)對(duì)照品）2、嚴(yán)格按照批準(zhǔn)的驗(yàn)證方案進(jìn)行驗(yàn)證工

3、作。如 出現(xiàn)異常或需進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整時(shí)，應(yīng)先經(jīng)過批準(zhǔn)。3、驗(yàn)證結(jié)束后： 對(duì)所得圖譜和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)； 得出驗(yàn)證結(jié)論，出具驗(yàn)證報(bào)告。 三、分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容 根據(jù)不同的分析方法的特性及用途確定不同的 驗(yàn)證項(xiàng)目和內(nèi)容。 下表所列是通常情況下不同類型分析方法應(yīng)該 進(jìn)行驗(yàn)證的項(xiàng)目： 1、專屬性 專屬性是指在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔 料等）可能存在的情況下，采用的分析方法能 夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。 一般方法都應(yīng)該證明它的專屬性。如果一個(gè)方 法的專屬性不強(qiáng)，應(yīng)該用其它方法進(jìn)行補(bǔ)充。 證明專屬性的方式有3種：（1）在雜質(zhì)可以得到的情況下，向樣品中加入 一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)與樣品能夠得到分 離

4、和檢出。（2）將樣品用強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿 水解及氧化的方法進(jìn)行破壞，比較破壞前后 檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和量。 （3）在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可 以通過與另一種已證明合理但分離或檢測(cè)原 理不同、或具較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果 比較來(lái)確定。2、系統(tǒng)精密度 系統(tǒng)精密度是指同一個(gè)樣品溶液在連續(xù)進(jìn)樣的 情況下獲得的結(jié)果之間的接近程度。 目的：證明在該分析方法的運(yùn)用上當(dāng)天儀器的 性能。（這也常是系統(tǒng)適應(yīng)性的要求之一） 一般情況下，本項(xiàng)驗(yàn)證采用的樣品溶液會(huì)是 100%的雜質(zhì)加標(biāo)樣品溶液。 采用連續(xù)進(jìn)樣6針后得到的各雜質(zhì)及樣品的峰 面積的RSD作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。3、方法精密度 方法精密度是指在同樣的

5、操作條件下，在較短 的時(shí)間間隔內(nèi)，對(duì)同一批樣品，由同一分析人員稱取數(shù)份樣品，平行測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。 證明方法精密度的方式有兩種： （1）制備6份100濃度的試樣，用各自測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)； （2）制備3個(gè)不同濃度的試樣，用各測(cè)定3次的 結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià) 。 我們常用的是第1種方式。 對(duì)測(cè)得的各份結(jié)果用RSD來(lái)評(píng)價(jià)。雜質(zhì)一般可 接受標(biāo)準(zhǔn)為10.0%，含量一般可接受標(biāo)準(zhǔn)為 2.0%（基本上和系統(tǒng)適應(yīng)性中要求一致）4、中間精密度 中間精密度是指在同一實(shí)驗(yàn)室，由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi) 部條件改變時(shí)測(cè)定結(jié)果的接近程度。 驗(yàn)證設(shè)計(jì)方案中的變動(dòng)因素一般為日期、分析 人員、設(shè)備。 中間精密度的驗(yàn)證方式及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和方

6、法精密 度完全相同。 方法精密度和中間精密度的結(jié)果之間也要有一 個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)： （1）各自測(cè)得結(jié)果之間的絕對(duì)差值應(yīng)符合要求，比如:含量差值1.0%，雜質(zhì)差值0.05%，殘留溶劑差值（濃度的25%）等。 （2）所有結(jié)果的RSD應(yīng)符合要求（與方法精密度的要求基本一致）。5、檢測(cè)限和定量限 檢測(cè)限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。檢測(cè)限是為了考察分析方法是否具備靈敏的檢測(cè)能力。 定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定的準(zhǔn)確度和精密度。定量限體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測(cè)能力。 當(dāng)用 GC 和 HPLC 法時(shí) ，一般以信噪比為3： 1時(shí)的

7、相應(yīng)濃度作為檢測(cè)限，以信噪比為10：1 時(shí)的相應(yīng)濃度作為定量限。 其它方法：也可以用工作曲線的斜率和響應(yīng)的 標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算的方法得到檢測(cè)限和定量限。 6、線性和范圍 線性是指在設(shè)計(jì)的測(cè)定范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與樣 品中被分析物的濃度（量）直接呈線性關(guān)系的 程度。 范圍是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性， 測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 線性是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，涉及定量測(cè)定的項(xiàng) 目，如雜質(zhì)定量試驗(yàn)和含量測(cè)定均需驗(yàn)證線性。 驗(yàn)證方式：可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別 精密稱樣，制備一系列被測(cè)物質(zhì)濃度系列進(jìn)行 測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào) （如峰面積、吸光值等）作為被測(cè)物濃度的函數(shù) 作圖，

8、觀察是否呈線性，計(jì)算線性回歸方程。 線性驗(yàn)證范圍： 含量：80120% 雜質(zhì)：LOQ 150% 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)系數(shù)R。 如HPLC、GC色譜法： 含量線性，R0.999 雜質(zhì)線性，R0.9957、準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度是指用該分析方法測(cè)得的結(jié)果與真實(shí)值 或認(rèn)可的參考值之間接近的程度。 用于定量測(cè)定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證。 證明方式： 制備3個(gè)不同濃度的樣品溶液，各測(cè)定3次，即 測(cè)定9次。 （ 也可以3個(gè)濃度，每個(gè)濃度配制3份樣品） 一般用已知加入量的被分析物的回收率 ( ) 作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 。 含量的回收率要求：98102%； 雜質(zhì)的回收率要求：80120%； 各份樣品測(cè)得回收率的RSD10.0%

9、準(zhǔn)確度和精密度的作用不同。8、耐用性 耐用性是指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié) 果不受影響的承受程度。 耐用性主要考察方法本身對(duì)于可變?cè)囼?yàn)因素的 抗干擾能力，為使方法用于常規(guī)檢測(cè)提供依據(jù)。 經(jīng)耐用性試驗(yàn)證明，如果測(cè)試條件要求苛刻， 則應(yīng)在方法中寫明。 典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性等。液相色譜法：流動(dòng)相的組成比例或 pH 值，不 同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫，流 速及檢測(cè)波長(zhǎng)等。氣相色譜法：不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、柱溫， 進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。薄層色譜法：不同廠牌的薄層板，薄層展開時(shí) 溫度及相對(duì)濕度的變化等 溶液穩(wěn)定性 （1）用來(lái)證明根據(jù)相應(yīng)方法制備的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液在規(guī)定的儲(chǔ)

10、存條件下在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。 （2）驗(yàn)證方式： 在規(guī)定條件下儲(chǔ)存適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔后檢測(cè)。 含量測(cè)定：用新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定樣品溶液的含量，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的RSD應(yīng)符合要求。 雜質(zhì)測(cè)定：不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的峰面積與0時(shí)相比較，偏差不得大于5%。（根據(jù)雜質(zhì)大小設(shè)定） 以上是一般定量的分析方法在驗(yàn)證過程中都需 要的驗(yàn)證項(xiàng)目。 如果是HPLC、GC方法，則都還應(yīng)該有系統(tǒng)適 應(yīng)性要求。 當(dāng)在兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室之間已經(jīng)驗(yàn)證了方法的重 現(xiàn)性時(shí)，可以不驗(yàn)證中間精密度。一、概述1、分析方法確認(rèn)的目的： 證明該分析方法在本實(shí)驗(yàn)室條件下的適用性。2、分析方法確認(rèn)的范圍： （1）藥典方法； （2)其他法定方法。分析方法確認(rèn)

11、分析方法確認(rèn)3、不適用范圍 實(shí)驗(yàn)室日常測(cè)試操作步驟不需要進(jìn)行方法確認(rèn)，如干燥失重、熾灼殘?jiān)?、pH值等等。4、需確認(rèn)的因素： 人； 設(shè)備； 試劑； 其它因素。5、確認(rèn)方式: 分析方法確認(rèn)沒有固定的方案，需要根據(jù)不同的方法來(lái)確定需要確認(rèn)的內(nèi)容。 如雜質(zhì)的定量測(cè)定方法： 國(guó)外：專屬性、方法精密度、中間精密度、定量 限、檢測(cè)限、溶液穩(wěn)定性。 國(guó)內(nèi)：方式1，由兩名實(shí)驗(yàn)人員分別對(duì)同一批 產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，比較兩人的檢測(cè)結(jié)果。 方式2，確認(rèn)專屬性、精密度、定量限。 強(qiáng)降解試驗(yàn)是指將原料藥置于比較強(qiáng)烈的試驗(yàn)條件 下，考察其穩(wěn)定性的一系列試驗(yàn)。 一般包括酸降解、堿降解、氧化、高溫、高濕、光照 六個(gè)條件。 在國(guó)外，這

12、六個(gè)條件都稱為強(qiáng)降解試驗(yàn)。 在國(guó)內(nèi)，前三個(gè)條件稱為強(qiáng)降解試驗(yàn)，后三個(gè)則稱為影 響因素試驗(yàn)。強(qiáng)降解試驗(yàn) 強(qiáng)降解試驗(yàn)的目的： （1）通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩(wěn) 定性，了解該藥品內(nèi)在的穩(wěn)定特性及其降解途 徑與降解產(chǎn)物。為初步確定貯存條件提供依 據(jù)。 （2）對(duì)有關(guān)物質(zhì)分析方法用于檢查降解產(chǎn)物 的專屬性進(jìn)行驗(yàn)證。 國(guó)內(nèi)外相關(guān)的指導(dǎo)原則，均未對(duì)破壞性試驗(yàn)的 具體項(xiàng)目與試驗(yàn)條件作明確的規(guī)定。 具體的降解條件： 酸降解： 一般選擇0.1N的鹽酸 。酸液的濃度、降解的時(shí) 間均可根據(jù)具體品種，在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上 靈活確定。 堿降解： 一般選擇0.1N的氫氧化鈉溶液 。堿液的濃度、 降解的時(shí)間均可根據(jù)具體

13、品種，在前期預(yù)試驗(yàn) 的基礎(chǔ)上靈活確定。 氧化降解： 一般采用市售的雙氧水 。雙氧水的濃度、降解 的時(shí)間均可根據(jù)具體品種，在前期預(yù)試驗(yàn)的基 礎(chǔ)上靈活確定。 高溫降解： 根據(jù)ICH規(guī)定，結(jié)合中國(guó)藥典附錄要求，我們 一般確定高溫條件為：60，放置10天。 高濕降解： 一般采用25 ，RH905%的條件。放置10 天。 一般用飽和硝酸鉀溶液制備濕度條件 （ RH92.5% ）。 高濕降解研究時(shí)，需要考察樣品的吸濕增重， 以確定樣品是否具有引濕性，這對(duì)于樣品包裝 的選擇非常重要。當(dāng)吸濕增重5%時(shí)，樣品具 有一定的吸濕性，需要繼續(xù)研究。 光照降解： 國(guó)內(nèi)注冊(cè)要求：4500LX500LX條件下放置 10天。 國(guó)外注冊(cè)要求：放置過程的總照度不得少于 120萬(wàn)LX。 為了同時(shí)符合國(guó)內(nèi)外注冊(cè)的要求，實(shí)際操作中將光線照度定為4500LX500LX，放置時(shí)間延長(zhǎng)到15天。 取樣時(shí)間點(diǎn)： 酸降解、堿降解、氧化降解根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的 時(shí)間取樣檢測(cè)。 高溫、高濕、光照降解分別于第5、10天取樣 檢測(cè)。（光照降解增加第15天的