microRNA簡(jiǎn)介

1、micro RNAMicroRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。到目前為止， 在動(dòng)植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有28645 個(gè)miRNA 分子(Release 21: June 2014) 。大多數(shù)miRNA 基因以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因組中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001) 。中文名MicroRNA性質(zhì)非編碼單鏈RNA 分子特點(diǎn)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度等縮寫(xiě)miRNA簡(jiǎn)介MicroRNA (miRNA) 是一類內(nèi)

2、生的、長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNA的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。最近的研究表明大約70 %的哺乳動(dòng)物miRNA 是位于TUs區(qū)( transcriptionmicro RNAunits , TUs ) ( Rodriguez et al ,2004) , 且其中大部分是位于內(nèi)含子區(qū)( Kim &Nam , 2006) 。一些內(nèi)含子miRNA 的位置在

3、不同的物種中是高度保守的。miRNA 不僅在基因位置上保守, 序列上也呈現(xiàn)出高度的同源性(Pasquinelli etal , 2000 ; Ruvkun et al , 2001 ; Lee & Ambros ,2001) 。miRNA 高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關(guān)系。miRNA 與其靶基因的進(jìn)化有著密切的聯(lián)系, 研究其進(jìn)化歷史有助于進(jìn)一步了解其作用機(jī)制和功能。MicroRNAMicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA，幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因?？梢酝ㄟ^(guò)幾個(gè)miRNAs的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分

4、之一的基因。MicroRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA，長(zhǎng)度大約為3001000個(gè)堿基；pri-miRNA經(jīng)過(guò)一次加工后，成為pre-miRNA即microRNA前體，長(zhǎng)度大約為7090個(gè)堿基；pre-miRNA再經(jīng)過(guò)Dicer酶酶切后，成為長(zhǎng)約2024nt的成熟miRNA。實(shí)際研究中，pre-miRNA應(yīng)用最早，也最廣泛，很多商業(yè)化的MicroRNA庫(kù)都是pre-miRNA形式的。近幾年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA的雙臂對(duì)成熟miRNA的形成有著十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越來(lái)越多地被研究者采用。MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約2123個(gè)堿

5、基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測(cè)，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。特征已經(jīng)被鑒定的miRNAs據(jù)推測(cè)大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，約70個(gè)堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成的，有5端磷酸基和3羥基，大小約2125nt的小分子RNA片

6、斷，定位于RNA前體的3端或者5端。3個(gè)研究小組分別從線蟲(chóng)、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個(gè)新miRNAs中，有15%跨越線蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物基因組具有高度的保守性（只有有12個(gè)堿基的區(qū)別）。Lau 和Bartel 實(shí)驗(yàn)室的同事更加認(rèn)為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個(gè)門(mén)類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。Bantam 最早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個(gè)基因位點(diǎn)。已知幾個(gè)包含增強(qiáng)子micro RNA的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個(gè)位點(diǎn)的一段12.3kb區(qū)域會(huì)導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長(zhǎng)，而由轉(zhuǎn)座

7、子介導(dǎo)的一段跨越該位點(diǎn)的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個(gè)體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來(lái)的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個(gè)3.85kb片斷中的EST卻沒(méi)有同樣的效果。Cohen將這個(gè)片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過(guò)RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個(gè)保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個(gè)區(qū)段很象是一個(gè)miRNA的前體。這個(gè)結(jié)果經(jīng)過(guò)Northern blot證實(shí)突變果蠅的幼體缺少一個(gè)21bp的bantam miRNA ，用這個(gè)90bp的mRNA前體經(jīng)

8、過(guò)一系列的“功能缺失”“功能恢復(fù)”實(shí)驗(yàn)，證實(shí) bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。研究人員用計(jì)算機(jī)程序檢索在hid mRNA的3非編碼區(qū)找到了bantam的3個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)（ hid是果蠅中一個(gè)誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實(shí) bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。miRNAs的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲(chóng)和果蠅的miRNA在各個(gè)發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá)，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r(shí)相的表達(dá)模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著

9、差異。功能科學(xué)家開(kāi)始認(rèn)識(shí)到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲(chóng)，果蠅，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個(gè)miRNAs中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時(shí)序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，可以通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3非編碼區(qū)(3UTRs

10、)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，通過(guò)調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程(reviewed in Pasquinelli 2002)。bantam miRNA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細(xì)胞分化和組織發(fā)育過(guò)程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如mir-14、mir-23 等。在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過(guò)程。一是在carpel factory (car)突變株中3個(gè)miRNAs的表達(dá)水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個(gè)類似Di

11、cer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。對(duì)一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細(xì)胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個(gè)研究表明，2個(gè)miRNAs水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病之間的顯著相關(guān)，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin

12、2002)。由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對(duì)miRNA的研究還處于初級(jí)階段，據(jù)推測(cè)miRNAs在高級(jí)真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。然而，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個(gè)謎。MicroRNA的過(guò)表達(dá)MicroRNA存在多種形式，最原始的是pri-miRNA ，長(zhǎng)度大約為300-1000個(gè)堿基pri-miRNA經(jīng)過(guò)一次加工后，成為pre-miRNA 即microRNA前體，長(zhǎng)度大約為70-90個(gè)堿基；pre-miRNA再經(jīng)過(guò)Dicer酶酶切后

13、，成為長(zhǎng)約20-24nt的成熟miRNA 。實(shí)際研究中，pre-miRNA應(yīng)用最早，也最廣泛，目前很多商業(yè)化的MicroRNA庫(kù)都是pre-miRNA形式的。近幾年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA的雙臂對(duì)成熟miRNA的形成有著十分重要的作用，所以天然的pri-miRNA形式越來(lái)越多地被研究者采用。MicroRNA的下調(diào)化學(xué)合成的miRNA inhibitors ，用于下調(diào)目的細(xì)胞中的miRNA ，以實(shí)現(xiàn)loss-of function研究。如果您需要進(jìn)行長(zhǎng)期、穩(wěn)定的miRNA下調(diào)，則可以選用載體形式的miRNA inhibitor。其轉(zhuǎn)染效率高，下調(diào)效果好，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的miRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定的

14、下調(diào)。載體形式的miRNA inhibitor，采用的方法如miRNA sponge法，這也是目前SCI文獻(xiàn)中用的較多的一種方法。作用方式microRNA-RISC對(duì)靶基因mRNA的作用一直主要取決于它與靶基因轉(zhuǎn)錄體序列互補(bǔ)的程度，有三種方式。第一種是切斷靶基因的mRNA分子miRNA與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合，作用方式和功能與siRNA非常相似，最后切割靶mRNA。在植物中，大部分miRNA都以這種方式，靶基因mRNA斷裂后，無(wú)poly(A)的分子的3 端加上多個(gè)U并很快降解，含poly(A)的分子能穩(wěn)定存在一段時(shí)間（如擬南芥miR-171）。在植物中目前有一個(gè)miRNA和3個(gè)潛在的目標(biāo)靶基因完全

15、互補(bǔ)（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉(zhuǎn)錄因子），盡管還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標(biāo)靶，這仍是第一次發(fā)現(xiàn)miRNA 和其潛在的目標(biāo)靶完全互補(bǔ)，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。第二種是抑制靶基因的翻譯作用時(shí)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類（如線蟲(chóng)lin-4）。而在植物中極少數(shù)的miRNA通過(guò)此方式來(lái)抑制靶基因。第三種是結(jié)合抑制具有以上兩種作用模式：當(dāng)與靶基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接靶向切割mRNA；當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。1識(shí)別方法多個(gè)研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開(kāi)展對(duì)

16、miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測(cè)都是由Dicer酶降解RNA得到的，2123個(gè)堿基大小、有5端磷酸基和3羥基的RNA片斷，有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來(lái)篩選具有相同特征的小分子篩選一定大小的RNA分子，連接到3和5的適配子（adapters），逆轉(zhuǎn)錄并通過(guò)PCR擴(kuò)增、亞克隆并測(cè)序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過(guò)向基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查詢進(jìn)行。這個(gè)方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。有的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)一種RNA folding program mfold 來(lái)判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的m

17、iRNA前體，然后用Northern Blots的方法來(lái)確定這些miRNAs是否真的表達(dá)了。盡管有數(shù)百個(gè)miRNAs通過(guò)生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來(lái)，已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNAs只不過(guò)是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來(lái)的miRNAs是從單個(gè)克隆中鑒別出來(lái)的，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過(guò)程中被“漏掉”了，測(cè)序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。siRNAmiRNA和siRNA之間的關(guān)系令人迷惑。從表面上說(shuō)，一個(gè)是非編碼的單鏈小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)；另一個(gè)是針對(duì)編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個(gè)siRNAs，是通過(guò)降解目標(biāo)靶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)

18、。由于每個(gè)mRNA模版可能產(chǎn)生很多個(gè)siRNAs，要給每個(gè)siRNA定一個(gè)基因的名字就很困難。miRNA是進(jìn)化進(jìn)程中高度保守的，因此給直向同源物一個(gè)同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個(gè)物種中一段無(wú)關(guān)的序列一個(gè)同樣的名字就容易造成混亂。然而，據(jù)推測(cè)miRNAs通常是由較大的（70­90 nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）前體經(jīng)Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負(fù)責(zé)將長(zhǎng)雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長(zhǎng)度也差不多，同樣有調(diào)控基因表達(dá)功能。因而這兩類小分子RNA之間的關(guān)系格外令人關(guān)注。兩個(gè)廣為人知的miRNA在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，通過(guò)一種未知方式誘發(fā)蛋白

19、質(zhì)翻譯抑制從而抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)mRNA靶的降解，就是說(shuō)作為翻譯抑制子本身不影響對(duì)應(yīng)mRNA的豐度，其原因據(jù)推測(cè)是由于miRNA和結(jié)合位點(diǎn)之間不完全互補(bǔ)。這就區(qū)別于siRNA的介導(dǎo)的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導(dǎo)目的RNA的降解。實(shí)驗(yàn)表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補(bǔ)的miRNA會(huì)誘導(dǎo)mRNA靶的降解。還有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一些miRNA，包括在植物中發(fā)現(xiàn)的Scarecrow miRNA，能結(jié)合完全互補(bǔ)的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。

20、這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。一個(gè)很有趣的實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個(gè)觀點(diǎn)：Doench和同事挑選一個(gè)已知在體內(nèi)可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報(bào)告基因的3端插入對(duì)應(yīng)的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)其中一個(gè)拷貝是插入一個(gè)完全匹配的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)拷貝插入4個(gè)只有3和5端匹配，而中間不同的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)，這樣選定的siRNA就不能完全結(jié)合到這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中間形成一個(gè)突起的不匹配的環(huán)。將這兩個(gè)拷貝轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞并用siRNA誘導(dǎo)基因沉默。結(jié)果很有趣兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都錄得熒光素酶活性下降了超過(guò)10倍，RT-PCR和Northern分析證實(shí)，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)的熒光素酶轉(zhuǎn)錄本

21、下降了超過(guò)10倍，這正是正常的siRNA介導(dǎo)的RNAi反應(yīng)，目標(biāo)靶mRNA降解導(dǎo)致表達(dá)水平的下降，而第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中熒光素酶轉(zhuǎn)錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達(dá)水平下看起來(lái)象源于miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制降，而不是siRNA介導(dǎo)的影響mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致。實(shí)驗(yàn)表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實(shí)驗(yàn)人員還進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)：改變第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中的不匹配環(huán)的堿基序列看起來(lái)不影響抑制效果，但是siRNA和報(bào)告基因上的結(jié)合位點(diǎn)的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好這一點(diǎn)和siRNA抑制的情況一樣唯一不同的是：完全匹配的結(jié)合位點(diǎn)（siRNA作用方式）可以單獨(dú)起作用而相互

22、不影響，而增加不完全配對(duì)的結(jié)合位點(diǎn)（注意在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中用了4個(gè)CXCR4結(jié)合位點(diǎn)）的個(gè)數(shù)對(duì)翻譯抑制有顯著的加乘作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還沒(méi)有找到內(nèi)源的siRNA，外源的siRNA介導(dǎo)的RNAi作用正是一種抵御機(jī)制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，從理論上推測(cè)可能參與多種調(diào)控作用。這兩種小東西的作用機(jī)制和相互關(guān)系的本質(zhì)就顯得更加撲朔迷離。如何在實(shí)驗(yàn)中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。待解決問(wèn)題miRNAs在多個(gè)物種中廣泛被發(fā)現(xiàn)，而且在進(jìn)化上高度保守。這些“小玩意兒”留給我們一大堆謎團(tuán)：miRNA的確切功能是什么？它的目標(biāo)靶是什么？作用機(jī)制是

23、什么？也許需要對(duì)植物或者線蟲(chóng)的基因組進(jìn)行miRNAs突變株的篩選，在果蠅中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。對(duì)miRNA突變株伴隨的表型缺失進(jìn)行研究，有助于解釋miRNAs的功能。正如Phillip Zamore說(shuō)的：“如果miRNAs在進(jìn)化的進(jìn)程中如此高度保守而沒(méi)有任何實(shí)際功能，那真是大自然拿科研人員開(kāi)涮而且是一個(gè)殘酷的玩笑”。研究工具隨著小分子RNA日益受到研究人員的重視，很多研究小分子RNA的新方法不斷推出。分離由于小分子RNA可能參與分化、發(fā)育、組織生長(zhǎng)、脂肪代謝等生理過(guò)程，在不同的組織和發(fā)育階段的表達(dá)水平有所不同，進(jìn)一步了解小分子RNA的生物功能需要確定

24、其在各種生物樣品中的表達(dá)水平，因而需要一種精確的定量純化方法，從而得到可信的數(shù)據(jù)?，F(xiàn)行的RNA純化方法包括有機(jī)溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來(lái)純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA（200nt以上），小分子RNA往往被淘汰掉，因而不適用于小分子RNA的分離純化。有機(jī)溶劑抽提能夠較好的保留小分子RNA，但是后繼的沉淀步驟比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter，GFF)，既能夠有效富集10mer以上的RNA分子，又能夠兼?zhèn)潆x心柱快速離心純化的優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)不錯(cuò)的

25、選擇。對(duì)于特別稀有的分子，由于需要分離大量RNA而導(dǎo)致高背景而降低靈敏度，還可以進(jìn)一步富集10mer到200bp的小分子RNA來(lái)提高靈敏度。探針制備方法其實(shí)很簡(jiǎn)單：只需要準(zhǔn)備目的基因的一小段寡核苷酸序列，3端另外增加8個(gè)和T7啟動(dòng)子互補(bǔ)的堿基，將這段寡核苷酸和T7啟動(dòng)子引物退火，用Klenow大片斷補(bǔ)齊得到雙鏈的轉(zhuǎn)錄模版，然后用T7RNA聚合酶、rNTP和標(biāo)記物混合，體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)記的小分子RNA探針。這種方法可以快速制備各種標(biāo)記（同位素、非放射性標(biāo)記均可）的小于100nt的小分子RNA探針，適用于包括RPAs，Northerns 和原位雜交等各種方法檢測(cè)小分子核仁RNA( small nuclear RNA,snRNA)，small interfering RNA (siRNA),，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性標(biāo)記的探針還可以用于原位雜交研究miRNA或者mRNA在組織中的分布。檢測(cè)由于小分子RNA是一類很小的分子，部分小分子RNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來(lái)定量研究非常困難，多數(shù)研究人員采用Northern Blots一種技術(shù)復(fù)雜