植物組織培養(yǎng)褐化控制研究進(jìn)展畢業(yè)論文綜述

1、文獻(xiàn)綜述植物組織培養(yǎng)褐化控制研究進(jìn)展 摘 要：褐化是植物組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一種常見的不利現(xiàn)象，是近幾年植物組培方面的研究熱點(diǎn)之一。結(jié)合國(guó)內(nèi)外新研究進(jìn)展，論述了褐化現(xiàn)象并對(duì)其產(chǎn)生的主要機(jī)理和影響褐化的因素并綜合提出控制褐化的有關(guān)措施。外植體發(fā)生褐化的基本機(jī)理包括酶促褐化和非酶促褐化。酶促褐化的主要原因是參與褐化反應(yīng)的酚類物質(zhì)、酚氧化酶和氧相互作用毒害外植體；影響褐化有生物因素、培養(yǎng)基種類和成分、培養(yǎng)條件等多方面因素；可通過控制相關(guān)的生物因素、培養(yǎng)基種類和成分，以及添加一定的吸附劑或抗褐化劑達(dá)到減輕褐化的效果。關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；褐化；控制措施；進(jìn)展在珍稀植物組織培養(yǎng)研究中，會(huì)發(fā)現(xiàn)一些外植體或

2、培養(yǎng)物的褐化、枯死現(xiàn)象，這種褐化現(xiàn)象又被稱為褐變1。褐化是植物組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一種較為常見的現(xiàn)象，在植物組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)中常有發(fā)生2，它對(duì)誘導(dǎo)外植體的脫分化和再分化有重大影響，甚至對(duì)一些植物組織培養(yǎng)能否取得成功起到?jīng)Q定性作用。對(duì)這一問題，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均有報(bào)道。本文就有關(guān)褐化現(xiàn)象的機(jī)理、影響褐化的因素及控制揭化的措施等研究進(jìn)展作概述。1. 褐化現(xiàn)象的機(jī)理1.1 非酶促褐化非酶促褐化是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響造成的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐化現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。許多不利條件都可以造成細(xì)胞的程序化死亡，若采取適當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境這種褐化就不再發(fā)生3

3、-6。1.2 酶促褐化1.2.1 化與酚類物質(zhì)及其合成代謝酶活性的關(guān)系研究當(dāng)外植體組織被切割后，切口附近的細(xì)胞受到傷害時(shí)，酚、酶的分隔效應(yīng)被打破，細(xì)胞內(nèi)酚類化合物向外分泌、酚氧化酶釋放或合成。在合適的ph、溫度等條件下，在酚氧化酶的作用下，酚類物質(zhì)(底物)和氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)，形成褐色醌類物質(zhì)，這使切面迅速變成棕褐色或暗褐色。這種褐色物逐漸在培養(yǎng)基中擴(kuò)散，抑制其它酶的活性，毒害整個(gè)外植體組織，外植體隨之進(jìn)一步變褐而最終死亡，這種有酚氧化酶參與的褐化現(xiàn)象又被稱為酚污染7-11。酚污染對(duì)誘導(dǎo)外植體的脫分化和培養(yǎng)物的再分化產(chǎn)生嚴(yán)重影響，以至對(duì)某些植物的組織培養(yǎng)能否取得成功起決定性的作用，尤其是木本植物

4、組織的外植體褐化死亡是培養(yǎng)難度較大的主要因素12。1.2.2 褐化與活性氧清除機(jī)制的關(guān)系研究當(dāng)外植體組織被切割后，切口附近的細(xì)胞受到傷害使酶與底物的細(xì)胞間隔被打破時(shí)，可誘發(fā)活性氧(ros)迅速過量產(chǎn)生。過剩的ros對(duì)植物組織造成氧化脅迫，導(dǎo)致膜脂過氧化，其產(chǎn)物丙二醛(mda) 的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成進(jìn)一步的傷害。植物細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶系統(tǒng)(如sod、cat、gpx、apx、gr等)和抗氧化小分子物質(zhì)(asa和gsh)組成?？寡趸到y(tǒng)的啟動(dòng)對(duì)于清除過剩的ros，抑制膜脂過氧化，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定,進(jìn)而控制褐化的發(fā)生起到至關(guān)重要的作用13。羅建平等14研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入asa可顯著提高so

5、d和apx活性，減輕膜脂過氧化,從而減輕沙打旺原生質(zhì)體的褐化。1.3 酶促褐化與非酶促褐化的關(guān)系張影陸等15在研究中發(fā)現(xiàn)酶促氧化反應(yīng)速率約是非酶促氧化速率的的800倍，酶促褐化程度(1.5731/120 min)也遠(yuǎn)大于非酶促褐化(0.4742/316 h)酶促褐化。因此，植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象主要是由酶促褐化引起的，即由酚氧化酶（ppo和pod）或酪氨酸酶等作用于天然底物酚類物質(zhì)而引起的16-17。2. 褐化的研究歷史及現(xiàn)狀2.1. 褐化的影響因素研究2.1.1. 外植體的選擇外植體的選擇直接關(guān)系到褐化的產(chǎn)生和褐化率的高低，影響因素分別有外植體大小、木本植物的木質(zhì)化程度、年齡、取材季節(jié)和取

6、材部位等。一般認(rèn)為選擇生長(zhǎng)旺盛的組織或器官作為外植體，這樣的外植體有很強(qiáng)的分生能力，抵抗褐化的能力強(qiáng)18。bonga19認(rèn)為外植體越小，切面表面積與體積的比率越大，傷害及褐化的程度就越大。王小敏等20對(duì)黑莓不同年齡外植體進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)褐化程度與外植體的木質(zhì)化程度及取材部位均有一定的關(guān)系，選擇處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的1年生半木質(zhì)化枝條的上部莖段作為外植體，可大大減輕黑莓外植體的褐化程度，降低褐化率。楊海蕓等21以不同葉齡的葉片為外植體接種后發(fā)現(xiàn)：取葉齡45 d的試管苗為外植體，組培褐化最輕，30 d次之，60 d褐化最重。蔡建榮22利用山藥不同外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，其褐化的程度也不同。當(dāng)外植體為含節(jié)問

7、的莖段時(shí)，其褐化程度最輕，當(dāng)外植體為切成小方塊的零余子時(shí)，褐化現(xiàn)象最嚴(yán)重，葉片的褐化程度居中。2.1.2. 培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇不同基本培養(yǎng)基和不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比都會(huì)影響外植體的褐化情況。陳之林等23發(fā)現(xiàn)，用含30 g/l蔗糖的ms培養(yǎng)基接種的蝴蝶蘭花葶切片褐化較嚴(yán)重，部分外植體生長(zhǎng)停滯，并逐漸壞死；而將ms培養(yǎng)基中的蔗糖濃度降至為15 g/l時(shí),外植體褐化程度減輕，誘導(dǎo)率顯著升高。而劉蘭英24在“薄殼香”核桃的組培快繁過程中，高溫、較高濃度的細(xì)胞分裂素和較高濃度的無機(jī)鹽都會(huì)促進(jìn)褐化的發(fā)生；王小敏等20對(duì)黑莓在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)在供試的6種基本培養(yǎng)基(ms、1/2ms、b5、1/2

8、b5、n6和1/2 n6)中，在ms、b5和n6三種基本培養(yǎng)基上黑莓外植體的褐化率均高于各自的1/2培養(yǎng)基。由于ms培養(yǎng)基的總鹽濃度相對(duì)低于b5和n6培養(yǎng)基，在ms培養(yǎng)基上外植體的褐化率較低(37.78)、腋芽誘導(dǎo)率最高(67.89)且生長(zhǎng)狀況良好。因此，使用ms基本培養(yǎng)基可減輕黑莓外植體的褐化。由此可知，組培中不同植物所適宜的褐化率最低的培養(yǎng)基配方并不相同，目前并沒有找到適合絕大部分植物降低褐化率的培養(yǎng)基配方，但相對(duì)低濃度的無機(jī)鹽和蔗糖濃度對(duì)降低褐化率有一定效果。2.1.3. 培養(yǎng)條件的調(diào)整不同的培養(yǎng)條件也能明顯影響一些植物的褐化率如光照、溫度、ph和有無轉(zhuǎn)瓶等。王小敏等20培養(yǎng)過程中的光照

9、度與外植體褐化也有一定的關(guān)系，在1500 lx光照度下外植體的褐化率較低(15.66)且腋芽誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)狀況均較好。楊海蕓21適當(dāng)時(shí)期的暗培養(yǎng)有利于不定芽的發(fā)生，暗培養(yǎng)1430 d，葉片不定芽誘導(dǎo)率和分化系數(shù)顯著高于其他處理，以暗培養(yǎng)21 d誘導(dǎo)率和分化系數(shù)最高，分別為74.5%和6.86。許傳俊25研究光照強(qiáng)度對(duì)外植體褐化影響時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著光照的加強(qiáng)蝴蝶蘭外植體褐化加重 而黑暗培養(yǎng)的外植體褐化較輕。因此，易褐化的材料在初代培養(yǎng)時(shí) 先進(jìn)行暗培養(yǎng)可以獲得較好的效果。趙伶俐等26對(duì)蝴蝶蘭r4品種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基ph 5.6或培養(yǎng)溫度20時(shí)外植體褐化率最低。在相同溫度（25 ）下，ppo活性、總酚含量

10、高低并不與ph值大小成正比，且褐化率與ppo無顯著相關(guān)性，ph為5.0時(shí)，褐化率與總酚含量顯著相關(guān)；在相同ph（6.0）下，溫度越高，褐化率越高， ppo活性越強(qiáng)，總酚含量越高，且20 下，褐化率與ppo、總酚含量分別達(dá)到極顯著顯著相關(guān)，在30 下，褐化率與總酚含量顯著相關(guān)。黃燕芬27外植體表面消毒時(shí)間、切割方式、轉(zhuǎn)瓶問隔時(shí)聞、培養(yǎng)基類型、激素配比、抗褐化劑和吸附劑的使用方面進(jìn)行了綜合試驗(yàn)。結(jié)果表明：表面消毒最適時(shí)間為7-8 min；接種外植體帶腋芽葉片保留2/5，3 d轉(zhuǎn)瓶1次降低褐化的效果較好。2.2. 褐化控制的措施研究2.2.1. 抗褐化劑的應(yīng)用植物組培中用于抑制褐化常用的抗氧化劑有：

11、抗壞血酸(vitamin c)、硫代硫酸鈉(na2s2o3)，此外還有檸檬酸、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇、酪氨酸、巰基乙醇、卵清蛋白、維生素b、維生素e、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、亞硫氫酸鈉、氰化鉀、多胺等4。呂宗友28研究不同防褐化措施對(duì)蘇丹草愈傷誘導(dǎo)的影響及抗褐化的效果表明vc、pvp和agno3均能不同程度地提高愈傷誘導(dǎo)率和降低褐化率，檸檬酸能提高愈傷誘導(dǎo)率但不能防止褐化。王穎29在研究煙草愈傷組織褐化現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)在愈傷組織的繼代培養(yǎng)中，pvp對(duì)愈傷組織褐化抑制效果最好的濃度是2 g/l，褐化率為35；檸檬酸對(duì)愈傷組織褐化抑制效果最好的濃度是8 mg/l，褐化率為25；在愈傷組織繼

12、代培養(yǎng)中可以用8 mg/l檸檬酸抑制外植體的褐化。由此可知，不同的抗褐化劑對(duì)不同外植體作用效果有差異，不同濃度的抗褐化劑對(duì)外植體的抗褐化效果也有差別。2.2.2. 吸附劑的應(yīng)用一般用于植物組培用的吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、活性炭(ac)等。張俊琦30認(rèn)為吸附劑pvp和結(jié)冷膠（phytagel）能夠有效地緩解褐化。馬文卿31研究大花蕙蘭組培苗增殖時(shí)發(fā)現(xiàn)添加活性炭的效果最好，添加1500 mg/l活性炭，使褐化得到很好的控制，并使得試管苗生長(zhǎng)旺盛，保持較高的增殖系數(shù)。李萍等32研究牡丹組培時(shí)發(fā)現(xiàn)活性炭能有效控制褐化，但長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)抑制組培苗的生長(zhǎng)和增殖；繼代培養(yǎng)初期在含活性炭2.0 g/l

13、的培養(yǎng)基中進(jìn)行4 d短期處理，不僅能有效控制褐化，還在一定程度上促進(jìn)了組培苗的生長(zhǎng)和增殖。但劉均利等33發(fā)現(xiàn)吸附劑在吸收酚類物質(zhì)過程中，也可能吸附培養(yǎng)基中的有益成分，使外植體生長(zhǎng)受到影響，甚至發(fā)生毒害作用。3. 褐化控制研究的展望到目前為止，組織培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象研究已經(jīng)歷幾十年，積累了大量的資料，但我們還是不能確切地闡述組織培養(yǎng)褐化的機(jī)理。通過對(duì)褐化現(xiàn)象研究狀況的回顧和了解，我們可以得到以下共識(shí)：組織培養(yǎng)褐化主要是酚類物質(zhì)被氧化的結(jié)果，其中ppo和pod能促進(jìn)褐化的發(fā)生；此外也有些為非酶促褐化。褐化的發(fā)生往往是多種因素同時(shí)作用的結(jié)果：內(nèi)因包括外植體材料的生理狀態(tài)、基因型、生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀況

14、、生長(zhǎng)部位和年齡等；外因包括培養(yǎng)基的成分、外加激素的種類含量及比例、吸附劑、抗褐化劑、有無熱激處理34、培養(yǎng)條件(溫度、ph、光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、通氣狀況等)等也會(huì)影響褐化的發(fā)生35。在導(dǎo)致褐化的諸多因素中，膜結(jié)構(gòu)的破壞或細(xì)胞中物質(zhì)區(qū)域化分布的破壞是酚類物質(zhì)的酶促氧化和組織發(fā)生褐化的關(guān)鍵。因此，未來的發(fā)展方向應(yīng)是深入了解有關(guān)機(jī)制，從理論上認(rèn)識(shí)植物組織褐化，找到影響褐化主導(dǎo)因子和克服褐化的有效方法，并進(jìn)行實(shí)踐從而防止褐化的發(fā)生。這對(duì)促進(jìn)組培技術(shù)的日臻完善，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。參考文獻(xiàn)1 周俊輝, 周家容, 曾浩森, 等. 園藝植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化研究進(jìn)展j. 園藝學(xué)報(bào), 200

15、0, 27(z1): 481-486.2 黃丹瑩, 江貴波. 植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對(duì)策j.廣西輕工業(yè), 2006, (5): 31-32. 1003-2673. 3 ventanas s, estvez m, delgado cl, et al. phospholipid oxidation, non-enzymatic browning development and volatile compounds generation in model systems containing liposomes from porcine longissimus dorsi and select

16、ed amino acidsj. european food resrach and technology, 2007, 225: 665675.4 徐振彪, 傅作申, 原亞萍, 等. 植物組織培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象j. 國(guó)外農(nóng)學(xué)一雜糧作物, 1997(1): 55-56.5 王棟, 買合木提克衣木, 玉永雄, 等. 植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施j. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, (1): 7-10. 6 徐芹. 碭山酥梨果汁褐變機(jī)理及控制技術(shù)研究d. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008. 7 于守超, 趙蘭勇, 王芬, 等. 植物組織培養(yǎng)過程中外植體褐變機(jī)理研究進(jìn)展j. 山東林業(yè)科技, 2004

17、,(5): 61-63.8 debergh pc, zimmerman rh. micropropagation technology and applicationm. amsterdan: kluwer academic publishers, 1991.9 laahji m, uemotos, fujieda k. studies on tissue culture in cattceya species preventive methods for the browning of explant tissuej. journal of the japanese society for

18、horticultural science, 1979, 48; 199-204.10 mayer am, harel e. polyphenol oxidases in plantsj. phytochemistry, 1979, 18, 193-215.11 vaughn kc, duke so. function of polyphenol oxidase in higher plantsj. plant physiology, 1984, 60: 106-112.12 李浚明. 植物組織培養(yǎng)教程m. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.13 趙瀅, 楊樹華, 葛紅, 等. 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中褐變

19、發(fā)生及控制的研究進(jìn)展j. 北方園藝, 2009, (11): 110-114.141516 待添加的隱藏文字內(nèi)容2羅建平, 顧月華, 王圣兵, 等. 抗壞血酸對(duì)沙打旺原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)中膜損傷及相關(guān)酶活性的影響j. 植物生理學(xué)報(bào), 1999, 25(4): 343.17 張影陸, 郝慧英, 徐巖等. 蘋果酒的酶促與非酶促氧化褐變研究j. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(12): 26-29.18 晏本菊, 李煥秀. 梨外植體褐變與多酚氧化酶及酚類物質(zhì)的關(guān)系j. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 16(3): 310-313.19 carmelo gb, lucas ls, juan co,

20、et al. studies on the browning of fino sherry and its relation to polyphenolic compoundsj. zeitschrift fr lebensmittel-untersuchung und forschung, 1989, 4: 322-325.20 林宗鏗, 黃德貴. 蝴蝶蘭花梗的組織培養(yǎng)及快速繁殖j. 福建熱作科技, 2001, 26(1): 6-9.21 闕國(guó)寧, 郭達(dá)初, 李金田譯. 樹木組織培養(yǎng)m. 北京: 中國(guó)林業(yè)出版社, 1988. 22 王小敏, 吳文龍, 李海燕, 等. 黑莓外植體褐化影響因素分

21、析及適宜培養(yǎng)條件篩選j. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2009, 18(3): 63-68.23 楊海蕓, 吳震, 王廣東, 等. 不同培養(yǎng)條件對(duì)蝴蝶蘭離體葉片不定芽發(fā)生的影響j.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 30(1): 44-49.24 蔡建榮. 山藥組織培養(yǎng)褐化反應(yīng)的研究j. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 24(8): 118-120. 25 陳之林, 葉秀粦, 梁承鄴, 等. 蝴蝶蘭花葶的離體培養(yǎng)j. 園藝學(xué)報(bào), 2003, 30(2): 242-244.26 劉蘭英. 薄殼香核桃組培中的褐化及防止措施研究j. 園藝學(xué)報(bào), 2002, 29(2): 171-17227 許傳俊, 李玲. 幾種培養(yǎng)基及光照對(duì)蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響j.亞熱帶植物科學(xué), 2006, 35(1): 9-12.28 趙伶俐, 葛紅, 范崇輝, 等. 蝴蝶蘭組培中ph和溫度對(duì)外植體褐化的