雞新城疫血凝與血凝抑制實驗

1、雞新城疫的實驗室診斷及免疫效果的評價目的目的1、掌握雞新城疫的臨診要點。、掌握雞新城疫的臨診要點。2、了解和掌握雞新城疫的實驗室診斷和、了解和掌握雞新城疫的實驗室診斷和免疫監(jiān)測技術(shù)。免疫監(jiān)測技術(shù)。 內(nèi)容內(nèi)容1、雞新城疫的臨診要點。、雞新城疫的臨診要點。2、雞新城疫的實驗室診斷。、雞新城疫的實驗室診斷。 NDV的分離及鑒定；的分離及鑒定； NDV毒力的鑒定毒力的鑒定3、雞新城疫的免疫效果評價、雞新城疫的免疫效果評價雞新城疫的免疫監(jiān)測雞新城疫的免疫監(jiān)測 血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗 (HI)HA和HI的原理HA試驗：許多病毒表面有血凝素，能與各種動物的紅細(xì)胞

2、表面受體結(jié) 合，而出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡稱為病毒的血凝現(xiàn)象 。2.HI試驗：病毒的紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，可以被特異性免疫血清所抑制，稱HI試驗。一、雞新城疫的血凝試驗(HA) 【材料】【材料】 新城疫病毒雞胚接種尿囊液 1份 0.5雞血球懸液 1管 生理鹽水或PBS 1瓶 96孔微量血清盤 1塊 微量加樣器 1支 一、雞新城疫的血凝試驗(HA) 【方法與步驟方法與步驟】（一）制備雞紅細(xì)胞懸液：（一）制備雞紅細(xì)胞懸液：1.用注射器抽取抗凝劑。 2.用上述注射器，采用無菌法抽取健康的未免疫雞的靜脈血。3.混勻，加生理鹽水適量，洗滌離心，共離心三次（第一、二次2000轉(zhuǎn)/分5分鐘、第三次3000轉(zhuǎn)/分 5

3、分鐘）洗去血清及白細(xì)胞。 取純紅細(xì)胞0.6ml，加生理鹽水稀釋99.4ml，即成1%的雞紅細(xì)胞懸液。一、雞新城疫的血凝試驗(HA)（二）加樣二）加樣1. 在在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50 L生理鹽水。生理鹽水。2. 于左側(cè)第于左側(cè)第1孔加孔加50 L病毒液，混合均勻后，吸病毒液，混合均勻后，吸50 L至第至第2孔，依次倍比稀釋至第孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄孔，吸棄50 L；第第12孔為紅細(xì)胞對照。孔為紅細(xì)胞對照。3. 自右至左依次向各孔加入自右至左依次向各孔加入0.5% 雞紅細(xì)胞懸液雞紅細(xì)胞懸液50 L，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果

4、。在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后觀察結(jié)果。一、雞新城疫的血凝試驗(HA) 【病毒血凝試驗的操作方法（單位：【病毒血凝試驗的操作方法（單位： L）】）】 孔 號123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對照生理鹽水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.6%紅細(xì)胞505050505050505050505050 微型振蕩器1min，靜置30min 棄50結(jié)果觀察+-以以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位凝集的病毒最

5、大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位一、雞新城疫的血凝試驗(HA) 【 結(jié)果判定結(jié)果判定 】置于振蕩器上振蕩1分鐘，靜置后30 min開始觀察結(jié)果，待對照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100% 凝集（+），不凝集者（-）紅細(xì)胞沉于孔底呈點狀。以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一個凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。 二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI) 【材料】 除血球凝集試驗

6、所用材料外，血清取雞免疫血清。 雞群卵黃抗體的制備雞群卵黃抗體的制備1.1.取雞蛋卵黃取雞蛋卵黃20ml20ml，加入等量生理鹽水，加入等量生理鹽水，振蕩，搖勻。振蕩，搖勻。2.2.加入等量氯仿加入等量氯仿40ml40ml，振蕩，振蕩3030分鐘。分鐘。3.3.取振蕩的卵黃液取振蕩的卵黃液300030004000rpm304000rpm30分鐘。分鐘。4.4.取上清液作為抗體檢測材料取上清液作為抗體檢測材料二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI)【方法】1. 根據(jù)HA試驗結(jié)果，確定病毒的血凝價，配制出4個血凝單位的病毒液。2. 在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，用固定病毒稀釋血清的方法，先在第1孔加50L生

7、理鹽水。3.自第3孔至12孔各加50L 4個血凝單位的新城疫病毒液。4.第孔加被檢雞血清50L，吹吸混合均勻，吸50L至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50L，稀釋度分別為：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫陽性血清50L，作為血清對照。振蕩混合均勻，置室溫中作用20min 。5. 自第l孔至12孔各加0.5% 雞紅細(xì)胞懸液50L，振蕩混合均勻，室溫下靜置30-40min后觀察結(jié)果二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI) 孔 號 滴度lg2材料 12345678910111212345678910病毒對照對照8單位病毒504單位病毒50505050505050505050生理鹽水50被檢雞血清50505050505050505050 棄500.6%紅細(xì)胞505050505050505050505050 震蕩混勻，室溫30-40min結(jié)果觀察-+ 【病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位：病毒血凝抑制試驗的操作方法（單位： L） 】以以100抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即抑制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。效價。二、雞新城疫的血凝抑制試驗(HI) 【結(jié)果判