基因工程藥物現(xiàn)代儀器分析法

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多基于重組DNA技術(shù)的特效藥物，如治療腎性貧血的基因工程人紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)，治療白細(xì)胞缺乏的基因工程人粒細(xì)胞集落刺激因子(rHuG-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rHuGM-CSF)，這些藥物與傳統(tǒng)的化學(xué)合成藥物不同，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生產(chǎn)難度大，很難或無法采用分析小分子化學(xué)藥物的手段表征其純度、含量和結(jié)構(gòu)。美國FDA在審批這些藥品時，嚴(yán)格控制其生產(chǎn)過程和生產(chǎn)地點。如果能建立一套儀器分析方法，像表征小分子合成藥物那樣簡便，則可使基因工程藥物的開發(fā)時間縮短，生產(chǎn)成本降低。目前國內(nèi)外 的生物技術(shù)工作者，將大量的精力都集中在基因工程產(chǎn)品的上游研究，而對質(zhì)

2、量控制的研究相對較少。如何用儀器分析方法與動物體內(nèi)生物學(xué)活 性測定法相結(jié)合，有效地控制基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量，是目前國內(nèi)外分析界和生物技術(shù)界研究的熱點之一。1基因工程藥物的特點基因工程藥物是通過對核酸分子的插入、拼接和重組而實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，再借助病毒、細(xì)菌、質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞系 統(tǒng)，并使目的基因在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。最先應(yīng)用基因工程技術(shù)的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域就是制藥工業(yè)?；蚬こ碳夹g(shù)在制藥工業(yè)中 的應(yīng)用主要有重組蛋白質(zhì)類藥物、疫苗及單克隆抗體等的生產(chǎn)。與化學(xué)合成法、組織提取法或傳統(tǒng)的發(fā)酵法相比，生產(chǎn)成本低。目前以DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)成果主要集中在

3、蛋白質(zhì)類、多肽類基因工程藥物和基因工程疫苗。多肽和蛋白質(zhì)通常是由20種a -氨基酸通過肽鍵聯(lián)成的長鏈分子，有些還含有非肽鏈結(jié)構(gòu)的其他組成成分，如糖蛋白等。蛋白質(zhì)分子很大，組成其氨基酸的數(shù)目常在100個以上，有些甚至達(dá)上千個，其結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有不同的層次，通常有一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是由其一級結(jié)構(gòu) 所決定，所以一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，正確表征顯得尤其重要。表征蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的內(nèi)容有含量、純度、等電點、分子量、肽譜、 氨基酸序列和 N-端序列等。高級結(jié)構(gòu)的質(zhì)量控制難度較大，仍在探索研究中，目前主要是通過其一級結(jié)構(gòu)的質(zhì)控來實現(xiàn)。與一般藥品相比

4、，除 具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)外，基因工程藥物還有一大特點就是它來源于活的生物體(細(xì)菌或細(xì)胞)，它的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學(xué)過程，如發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化目的產(chǎn)物等，這些過程有其固有的易變性，因此必須對原材料、培養(yǎng)過程、純化工藝過程、最終產(chǎn)品進(jìn)行全面的質(zhì)量控制。由于基因工程藥物分子的這些特殊性，目前經(jīng)常采用的方法主要有生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)的生化分析技術(shù)，如細(xì)胞株依賴法、凝膠電泳法和紫外光譜 法等。用于基因工程產(chǎn)品質(zhì)量研究的現(xiàn)代儀器分析法主要有質(zhì)譜(MS)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)、高效液相色譜(HPLC)、CE-MS和LC-MS聯(lián)用技術(shù)等，其中MS法有電噴霧質(zhì)譜和基體輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜法。在

5、基因工程產(chǎn)品研究和生產(chǎn)中，用儀器法可以解決以下幾個重要問題：(1)產(chǎn)物在表達(dá)和純化后的純度如何 ?(2)表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是否正確 ？(3)蛋白質(zhì)是否經(jīng)過后修飾孑不同表達(dá)載體、不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性如 何?(5)生產(chǎn)條件的更改及優(yōu)化對最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響如何？(6)制劑中微量活性成分的質(zhì)量如何？(7)糖蛋白的微觀不均一性如何 ？(8)如何判斷假劣藥品等。2毛細(xì)管電泳法在基因工程藥物質(zhì)量研究中的應(yīng)用2.1毛細(xì)管電泳法及其特點電泳分離是依據(jù)電場中溶質(zhì)的不同遷移速率，毛細(xì)管電泳(CE)是在毛細(xì)管中進(jìn)行的電泳分離。CE是電泳的分離機(jī)理與色譜的儀器自動化相結(jié)合的產(chǎn)物，尤其適用于離子型物質(zhì)的分析。蛋白質(zhì)類

6、生物大分子在等電點以外的環(huán)境中均帶有凈電荷，不同的蛋白質(zhì)其分子大小、荷電情況不同，由CE分離得到的圖譜可反映蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)信息；傳統(tǒng)表征蛋白質(zhì)的許多方法都是基于凝膠電泳，如SDS-PAGE、IEF等，與CE具有很大的相似性，故有豐富的經(jīng)驗可供借鑒；另外， CE所需樣品量少，選擇性好，易與其它高靈敏度的檢驗器相結(jié)合。CE的應(yīng)用范圍很廣，其中應(yīng)用最多的首推肽和蛋白質(zhì)，這也是CE發(fā)展的初衷。2.2在鑒別研究中的應(yīng)用 CE在蛋白質(zhì)和肽鑒別分析中應(yīng)用最多的是CZE測定肽譜、SDS-CGE測定蛋白質(zhì)分子量及 CIEF測定蛋白質(zhì)的等電點等。肽譜是鑒別蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，利用CE的高分辨率，可以分離得

7、到更為特征的肽譜。常用的消化試劑有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、溴化氰、Arg-C和Glu-C等。常用的檢測手段有紫外吸收法、激光誘導(dǎo)熒光法及質(zhì)譜法等。Frenz等1 通過對重組人生長激素(rHuGH)的HPLC和CE肽譜比較后，認(rèn)為兩者可互作補(bǔ)充，并且CE可提供更多的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息，測定快速。Apffel等2采用HPLC和CE測定了單鏈纖溶酶原激活因子(DSPAa l)的Arg-C酶解肽譜，并且用 CE進(jìn)一步分離了 HPLC的餾分，結(jié)果表明 CE的分辨率高，可用于結(jié)構(gòu)相近的糖肽的分 析。Mazzeo等3提出用電滲流趨動的毛細(xì)管等電聚焦測定肽圖的方法。作者用CE、CE-ESI-MS和HPLC法

8、測定了 rHuEPO的肽圖，確證了 70%以上的胰酶消解片段，對糖肽結(jié)構(gòu)、二硫鍵及結(jié)合位置也進(jìn)行了詳細(xì)研究4。Rush等5報道了用親和毛細(xì)管電泳測定rHuEPO肽圖的方法。由于基因工程藥物肽圖測定的重要性，所以用于肽圖測定的方法學(xué)本身發(fā)展也很快。Amankwa等6首先提出將胰酶固化在毛細(xì)管壁用于在線消化微量蛋白的方法，即蛋白質(zhì)在經(jīng)酶修飾的毛細(xì)管中完成酶解過程，于室溫環(huán)境下，25 min內(nèi)足可使蛋白質(zhì)完全消化，僅14 fmol的消化物通過在線偶合裝置流入另一根石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分離，借助于這套裝置便可在3 h以內(nèi)完成pmol級蛋白樣品的在線肽譜分析。采用激光誘導(dǎo)熒光可選擇性地檢測含色氨酸、酪氨酸

9、和苯丙氨酸的肽片段7。Bonneil等8提出用胰酶固化在多孔玻璃(CPG)上形成微反應(yīng)器，可達(dá)到快速測定肽圖的目的。Bossi等9提岀了一種采用亞氨基二乙酸為等電點緩沖液進(jìn)行肽譜分析的方法，與常規(guī)肽圖分析法相比，具有極高的 分辨率并且遷移時間縮短一半。Beale等10發(fā)展了肽圖測定的毛細(xì)管凝膠梯度法。也有用毛細(xì)管電泳收集消化肽碎片后進(jìn)行氨基酸組成分析的報道。CE-MS是肽譜分析的重要工具，可用于確證肽譜中各峰的歸屬，作者在該領(lǐng)域作過專門研究4,11 ,12。分子量可用于鑒別蛋白質(zhì)，Tsuij等13用SDS-CGE法監(jiān)測濃縮重組牛生長激素過程中單聚體及二、三、四多聚體的量。2.3在純度和含量測定

10、中的應(yīng)用在蛋白質(zhì)測序前，通常必須采用CE法監(jiān)測HPLC流出組分的純度。用疏水柱分離時，如蛋白質(zhì)的疏水性相近，則在HPLC中往往出現(xiàn)單峰。Grossman等13采用CE檢測RP-HPLC純度為99.2%的肽時，發(fā)現(xiàn)樣品中含有 6個組分，主峰的純度僅為50%。Wiktoratixz等14討論了各種純度檢測，并提出了純度檢測的最有效策略。目前CE已成功地用于基因工程產(chǎn)品的純度檢測。Yowell等15采用CZE，CIEF和HPLC法測定了制劑中rHuGM-CSF的含量和純度，并討論了制劑中基體對測定的影響。在重組人腫瘤壞死因子(rHuTNF)，白細(xì)胞介素-2(rHulL-2)和y干擾素(rHuIFN-

11、y )等基因工程藥物測定中的應(yīng)用也有報道16。Bietlot等17用CE定量分析rHuEPO注射液中的微量主藥。林炳承等18采用CE改性柱分析了重組人體生長因子和rHuTNF的純度。Park等19采用CE法定量測定了以白蛋白(HSA)為基體的rHuIFN a 1注射液中的微量rHuIFN- a 1，檢測限為1卩g.mL-1，即0.25fmol。作者用CE法測定了 rHuG-CSF、rHuGM-CSF、rHuIL-2等生物制劑中主藥的含量，并對制劑中微 量雜質(zhì)的測定作了詳細(xì)研究20。 2.4在微觀不均一性測定中的應(yīng)用許多天然蛋白質(zhì)和用真核細(xì)胞 (如CHO和BHK)表達(dá)的重組 DNA產(chǎn)品，往往不是

12、由單一結(jié)構(gòu)所組成。在糖蛋白中，糖基的微觀不均一性的改變就可能使糖蛋白本身的生理活性發(fā)生改變，所以有必要采用選擇性強(qiáng)的方法表征糖的微觀不均一性。目前用于微觀不均一性研究的CE手段主要有CZE、CIEF和MEKC 3種模式。用CIEF和CZE法分析糖鏈末端唾液酸化的產(chǎn)物較好，如有很多報道采用CIEF和CZE法分析重組人組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(rtPA)和rHuEPO中含唾液酸糖的微觀不均一性21，22。James等23用MEKC法分離了 rHuIFN- 丫的微觀不均一性。作者用 CE法分離了 rHuEPO中的7個組分24。3 電噴霧質(zhì) 譜法的應(yīng)用3.1方法原理以電噴霧離子源的質(zhì)譜技術(shù)稱為電噴霧

13、質(zhì)譜法，電噴霧的過程如下：第一步：噴霧器頂端施加一個電場給微滴提供凈 電荷；第二步：在高電場下，液滴表面產(chǎn)生高的電應(yīng)力，使表面被破壞產(chǎn)生微滴；第三步：荷電微滴中溶劑的蒸發(fā)；第四步：微滴表面的離子“蒸發(fā)”到氣相中，進(jìn)入質(zhì)譜儀。為了降低微滴的表面能，加溫可使噴霧效率提高。3.2準(zhǔn)確分子量的測定ESI/MS是生物大分子精確分子量測定的重要工具，在發(fā)現(xiàn)和闡述新蛋白結(jié)構(gòu)修飾方面起到核心作用25, 26。通過ESI/MS提供的分子量信息，可以確證蛋白質(zhì)氨基酸序列是否正確，并由此推斷 DNA序列是否正確。已有報道用ESI/MS測定rHuIL-2，rHuIL-1 a、rHuGH和rHuIFN-1 a等基因工程

14、藥品的準(zhǔn)確分子量27。作者采用ESI/MS法研究了 rHuG-CSF的分子量和純度20。Gross等28將ESI/MS和H/D同位素交換法相結(jié)合鑒定了用于糖尿病治 療的4種不同胰島素藥物：豬胰島素、牛胰島素、重組人胰島素及其類似物，它們的理論分子量分別為5778、5734、5808和5808，2種重組產(chǎn)物是同分異構(gòu)體，無法根據(jù)分子量鑒別，但經(jīng)過 60min H/D交換反應(yīng)后，由于空間結(jié)構(gòu)的差異，4種胰島素的質(zhì)量分別增加了28、25、30和38,據(jù)此可對未知樣品進(jìn)行鑒別。ESI/MS分析生物大分子的缺點是僅能得到多電荷離子峰，不能了解分子的碎片信息，通過對多電荷離子的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析，

15、可以確定氨基酸的序列，目前已有報道用CID法分析不同來源的細(xì)胞色素C 29。采用CID法分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列是發(fā)展方向。3.3微觀不均一性測定Rush等30采用ESI/MS研究了 rHuEPO糖基結(jié)構(gòu)的微觀不均一性，鑒定了 52種N-連接糖的形式；一sarbopoulos等31采用LC-ESI-MS法分析了由CHO細(xì)胞表達(dá)的rHuIL-4 ； Affel等3用選擇性酶切手段和 HPLC、ESI/MS法相結(jié)合鑒定了 纖溶酶原激活劑中 N-連接糖的形式。作者采用 CE-ESI-MS和LC-ESI/MS法測定了 rHuEPO中O-126的糖基化形式4。Kelly等32基于醋 酸鹽緩沖液和涂層毛細(xì)管

16、技術(shù)提岀了表征糖蛋白中糖基化形式的CE-ESI條件。CID技術(shù)可有效地用于檢測糖蛋白的微觀不均一性，測定前可將樣品經(jīng)過化學(xué)預(yù)處理。總之，ESI/MS是一種表征重組蛋白的有效工具。4基體輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF/MS)的應(yīng)用方法原理MALDI-TOF/MS即為基體輔助激光解吸離子化技術(shù)在飛行時間質(zhì)譜分析儀中的應(yīng)用。MALDI-TOF/MS獲得的不是掃描譜，它具備內(nèi)在“任務(wù)循環(huán)” (duty-cycle)的優(yōu)點，特別適用于質(zhì)量動態(tài)范圍大的分析。靈敏度高，可以快速獲取整個質(zhì)譜圖，并能對信號進(jìn)行累加平均。在MALDI中，樣品與輔助基體產(chǎn)生共結(jié)晶是關(guān)鍵，可以通過控制溶劑從惰性表

17、面靶上蒸發(fā)的速度來實現(xiàn)。但基體的選擇仍是憑經(jīng)驗，對于基體輔助 的機(jī)理仍然不是十分清楚。常用的基體有芥子酸 (SA)和2，5-二羥基苯甲酸(DHB)。4.2 在分子量、純度和肽譜測定中的應(yīng)用MALDI-TOF/MS可用于研究初期少量或貴重樣品的分子量測定，質(zhì)量準(zhǔn)確度達(dá)0.01%，對高質(zhì)量的蛋白測定其靈敏度達(dá)amol級33,在一次測定中可給出混合物中所有物質(zhì)的準(zhǔn)確分子量，所以該項技術(shù)可用于研究樣品的純度和肽譜。rHuEPO是一種高度糖基化的糖蛋白，無法用ESI/MS測定其分子量，作者采用 MALDI-TOF/MS 法準(zhǔn)確測定了其分子量，糾正了SDS-PAGE法的測定誤差；并用 MALDI-TOF/

18、MS 法研究了 rHuIL-2、rHuTNFa、rHuGM-CSF和rHuIFN a等基因工程產(chǎn)品的表達(dá)純度、分子量和樣品均一性。同時作者還用該法測定了rHuEPO的肽圖，確定了蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列和二硫鍵位置34。Belleci等35用巖藻糖/DHB和巖藻糖/DHB/5-甲氧基水楊酸作基質(zhì)測定了rHuGH和rHutPA的胰酶肽譜。Tsarbopowlos等36測定了 rHuIFN- 丫和rHuIL-4的胰酶肽圖，所測肽片段數(shù)分別占理論片段數(shù)的95%和88%。4.3在糖蛋白微觀不均一 性測定中的應(yīng)用糖蛋白的微觀不均一性主要是由糖引起的，這些糖有時對蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性會產(chǎn)生不同的影響。由于糖的

19、組分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)相似，加之糖又沒有顯色基團(tuán)，難以不經(jīng)衍生化就進(jìn)行光譜、色譜分析，所以糖的分析難度較大。MALDI-TOF/MS可有效地克服這一困難。糖蛋白中的糖主要有兩類唾液酸化的酸性寡糖和不含唾液酸的中性糖。Papac等37提出以DHB為基體，用反射 MALDI-TOF/MS 法在正離子方式下測定中性糖組分；以 THAP(2，4，6-trihydrotyacetophenane)為基體，用線性 MALDI-TOF/MS 法，在負(fù)離子方式下測定含唾液酸的酸性組分。Fowell等38采用衍生化的方法將寡糖末端的唾液酸轉(zhuǎn)換成甲基酯，避免了測定過程中唾液酸的丟失，同時也抑制了唾液酸與鹽產(chǎn)生的多重MS峰

20、，可在一次正離子方式測定中同時獲取中性和酸性糖的信號。Harmon等39提出了一種快速測定由CHO細(xì)胞表達(dá)的rHuIFN- 丫中N-連接寡糖位點的方法，測出了 Asn25位點上含有11種分子量不同的糖，Asn97位點上含有13種分子量不同的糖。Cakel等40以CE與MALDI-T OF/MS脫機(jī)聯(lián)用的方式測定重組DNA糖蛋白，即先用 CE分離糖蛋白的各種糖基化形式，然后收集餾分進(jìn)行MALDI-TOF/MS 分析，該法可用于糖蛋白藥物生產(chǎn)過程和批間差異質(zhì)量控制。Apffel等41將單鏈纖溶酶原激活因子(DSPAa 1)經(jīng)各種蛋白內(nèi)切酶處理后，用MALDI-TOF/MS測定了其中的糖基化形式。實

21、踐表明MALDI-TOF/MS 法是一種簡便、快速、價廉、靈敏度高、耗樣量少，質(zhì)量動態(tài)范圍大、對樣品基體要求低的方法，在樣品靶上直接分析肽譜和利用“源后衰減”(post-source decay)直接分析蛋白結(jié)構(gòu)將會大大提高樣品分析的效率和準(zhǔn)確度。5聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展質(zhì)譜法在一次分析中可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，將分離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合是分離科學(xué)方法學(xué)中的一項突破性進(jìn)展。由于GC-MS不能分析熱不穩(wěn)定和不揮發(fā)性物質(zhì)，所以發(fā)展了LC-MS和CE-MS法。CE-MS比LC-MS更適合于基因工程類蛋白質(zhì)的分析，可用于鑒定肽圖中的峰、測定糖蛋白的微觀不均一性，常用的模式有 CZE-ESI-MS、CIEF-ES

22、I-MS和CGE-MS，現(xiàn)在又發(fā)展了毛細(xì)管電色譜(CEC)與MS的聯(lián)用，CE與NMR的聯(lián)用是新近出現(xiàn)的技術(shù)，尚未用于基因工程蛋白質(zhì)的分析，相信是未來基因工程藥物質(zhì)控的發(fā)展方向。6結(jié)語保證藥物的安全有效是生產(chǎn)企業(yè)的首要責(zé)任，基因工程藥物是一類特殊藥物，我國目前有數(shù)十家大型企業(yè)生產(chǎn)重組DNA藥品。由于國內(nèi)質(zhì)控的手段和設(shè)備非常有限，不能用現(xiàn)代儀器方法研究和控制產(chǎn)品的質(zhì)量變化。由于方法學(xué)和檢測靈敏度的限制，無法測出制劑中微量主藥的純度和后修飾情況，如何控制這些過程依賴性產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量呢？筆者認(rèn)為：首先，生產(chǎn)企業(yè)必須嚴(yán)格按照已批準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制質(zhì)量，生產(chǎn)過程嚴(yán)格遵守GMP標(biāo)準(zhǔn)，制訂好產(chǎn)品的SOP;其次，

23、積極開展現(xiàn)代儀器法(如CE、MS法)控制產(chǎn)品質(zhì)量的研究工作，在沒有儀器設(shè)備的條件下，可跟國內(nèi)研究院所合作共同研究；第三，我國新藥審批部門應(yīng)強(qiáng)行要求研究單位和生產(chǎn)企業(yè)提供CE和MS的分析數(shù)據(jù)。作者單位：周國華南京軍區(qū)藥品檢驗所南京210002馬劍文總后衛(wèi)生部藥品儀器檢驗所北京100071羅國安 清華大學(xué)生命科學(xué)與工程研究院北京100084參考文獻(xiàn)1 Frenz J, Wu SL, Hancock WS, et al. Characterization of human growth hormone by capillary electrophoresis.J Chromatogr, 1989,4

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