甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生理特性及其葉綠體的超微結(jié)構(gòu)

1、園 藝 學(xué) 報(bào) 2014，41（6）：11331144 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140106；修回日期：20140512 基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）項(xiàng)目（2012CB）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-25）；農(nóng)業(yè)部園藝作物遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangyangyong） 甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生理特性及其

2、葉綠體的超微結(jié)構(gòu) 楊 沖，張揚(yáng)勇*，方智遠(yuǎn)，劉玉梅，楊麗梅，莊 木，孫培田 （中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 ） 摘 要：以甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1及其葉色正常近等基因系WT708為試材，對(duì)比發(fā)現(xiàn)：YL-1從子葉期開始表現(xiàn)出葉色黃化現(xiàn)象，并一直持續(xù)整個(gè)生活周期，葉片小，植株矮小，可以結(jié)球，但生長(zhǎng)勢(shì)和葉球顯著小于WT708，單球質(zhì)量只有WT708的39.0%；光合色素含量顯著降低；葉綠體數(shù)較少，葉綠體內(nèi)部基粒數(shù)少，基粒片層垛疊數(shù)少，基粒排列不整齊；YL-1的Fo、Fm、Fv /Fm、Fo、Fv/Fm、PS、QP、QN和ETR均顯著低于WT708，說(shuō)明光合色素含量的降低導(dǎo)致了PS反應(yīng)中心捕光

3、能力和光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率的降低。隨著溫度的降低，YL-1與WT708之間的光合色素含量差異逐漸加大。 關(guān)鍵詞：甘藍(lán)；黃化突變體；光合色素含量；超微結(jié)構(gòu)；葉綠素?zé)晒鈪?shù) 中圖分類號(hào)：S 635.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）06-1133-12 Photosynthetic Physiological Characteristics and Chloroplast Ultrastructure of Yellow Leaf Mutant YL-1 in Cabbage YANG Chong，ZHANG Yang-yong*，F(xiàn)ANG Zhi-yuan，LIU Yu-me

4、i，YANG Li-mei，ZHUANG Mu，and SUN Pei-tian （Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing ，China） Abstract：Yellow leaf cabbage mutant（YL-1）and its near isogenic lineWT708were used to compare their difference. MutantYL-1showed yellow leaf phenotype from cotyledon

5、stage and existed throughout the life cycle. Compared withWT708，YL-1had smaller leaves and less plant height. The head height ofYL-1was 39.0% ofWT708. The photosynthetic pigment content inYL-1leaves was significantly lower than that inWT708.YL-1had fewer chloroplasts and base grains，less grana lamel

6、lae stacked pile and irregular arrangement of base grains. The chlorophyll fluorescence parameters Fo，F(xiàn)m，F(xiàn)o，F(xiàn)v/Fm，F(xiàn)v/Fm，PS，QP，QN and ETR inYL-1were significantly lower than those inWT708. Lower photosynthetic pigment content leads to the lower light-harvesting capacity and photochemical conversion e

7、fficiency of the PSreaction center. As temperature decreased，the difference of photosynthetic pigment content betweenYL-1andWT708gradually increased. Key words： Brassica oleracea L. var. capitata；chlorophyll-reduced mutant；photosynthetic pigment 1134 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 content；chloroplast ultra-structure；c

8、hlorophyll fluorescence parameter 葉色變異在植物界發(fā)生頻率相對(duì)較高，突變來(lái)源廣泛。植物葉色黃化突變體又稱為葉綠素缺乏突變體，往往是葉綠素的合成或降解被破壞所導(dǎo)致的。葉色突變一般發(fā)生在苗期，多數(shù)突變體在生長(zhǎng)后期出現(xiàn)階段性返綠，也有部分在整個(gè)生育過程中一直保持突變?nèi)~色。葉色突變主要來(lái)源于自發(fā)突變和人工誘導(dǎo)突變，目前已經(jīng)在很多高等植物中發(fā)現(xiàn)了葉色黃化突變體，如玉米（Lonosky et al.，2004）、大豆（Stoekinger & Walling，1994）、豌豆（Highkin et al.，1969）、煙草（Okabe et al.，1977）、小麥（曹莉

9、 等，2006）、大麥（Preiss & Thomber，1995）、擬南芥（Carol et al.，1999）、水稻（Jung et al.，2003）、番茄（姚建剛 等，2010）和黃瓜（苗晗 等，2010）等，這些突變體主要用于葉綠素合成、遺傳、葉綠體超微結(jié)構(gòu)和發(fā)育、色素蛋白復(fù)合體、光合生理等方面研究，黃化性狀還可以作為雜種優(yōu)勢(shì)利用中的標(biāo)記性狀（Zhao et al.，2000）。 本課題組2010年秋在從意大利引進(jìn)的甘藍(lán)雜交種Hosom的自交分離后代中發(fā)現(xiàn)了葉色黃化突變體YL-1，其田間表現(xiàn)為葉色黃化，植株矮小，長(zhǎng)勢(shì)慢，但其生理特性尚不清楚。本試驗(yàn)中以YL-1及其葉色正常近等基因系W

10、T708為材料，對(duì)其光合色素含量、光合參數(shù)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、溫度對(duì)突變體光合色素含量的影響方面進(jìn)行了研究，并調(diào)查了成熟期的主要農(nóng)藝性狀，以期為闡明甘藍(lán)葉色黃化突變的機(jī)理和定位克隆葉色黃化相關(guān)基因提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 以本課題組發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata）葉色黃化突變體（命名為YL-1）及其近等基因系WT708為試材（圖1），將兩份材料于2012年秋季、2013年春季種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南圃場(chǎng)，進(jìn)行光合生理特性、成熟期主要農(nóng)藝性狀等的測(cè)定或調(diào)查，每小區(qū)13株，3次重復(fù)。 1.2 方法 1.2.

11、1 成熟期主要農(nóng)藝性狀調(diào)查 2012年秋季，在YL-1及WT708成熟期對(duì)植株的外葉色、最大外葉長(zhǎng)、最大外葉寬、株高、開展度、球質(zhì)量、球?qū)掃M(jìn)行了測(cè)量，每個(gè)小區(qū)測(cè)量5株，3次重復(fù)。 外葉色測(cè)定采用色差儀（CR-400，Minolta，JPN），測(cè)定相同葉位的成熟葉片，每片葉在主脈兩側(cè)各測(cè)3個(gè)點(diǎn)，取平均值；每次測(cè)量L*（明亮度指數(shù)，其幅度0 100，數(shù)值越大表示越明亮）、a*（紅、綠色度指數(shù)，紅為正值，綠為負(fù)值）、b*（黃、藍(lán)色度指數(shù)，黃為正值，藍(lán)為負(fù)值）3個(gè)值。用直尺測(cè)量最大外葉的葉長(zhǎng)和葉寬，株高（植株地上部分的高度），開展度（植株外葉開展最寬處縱、橫兩個(gè)方向），球?qū)挘ㄈ~球橫向最寬處），球高（葉

12、球縱向最高處），取平均值。 1.2.2 光合色素含量的測(cè)定 光合色素含量測(cè)定采用Arnon（1949）的方法，略有修改，2012年秋季測(cè)定。植株播種后28、42、56和70 d，分別取樣測(cè)定光合色素含量。各小區(qū)隨機(jī)抽取3株，取突變體YL-1及WT708相同葉位的成熟新鮮葉片，取樣時(shí)間在上午8：009：00時(shí)。隨機(jī)稱取葉片0.1 g，剪碎，裝入15 mL帶塞的玻璃試管中，加入10 mL的丙酮乙醇混合液（丙酮乙醇 = 11），黑暗浸提24 h，至組織發(fā)白。將提取液（或稀釋后）在UV-1800分光光度計(jì)（島津）上測(cè)定663、645和440 nm波長(zhǎng)的6期 楊 沖等：甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生

13、理特性及其葉綠體的超微結(jié)構(gòu) 1135 OD值，計(jì)算葉綠素a（Chl.a）、葉綠素b（Chl.b）、總?cè)~綠素含量（Chl.）和類胡蘿卜素含量（Car.）（mg L-1）。 1.2.3 光合作用參數(shù)測(cè)定 2013年春季測(cè)定。在苗期、蓮座期和結(jié)球期，即播種后28、50、75 d，分別從YL-1及WT708各自小區(qū)中選取長(zhǎng)勢(shì)一致的個(gè)體植株，以植株從上到下第3片葉片為測(cè)定材料。利用便攜式氣體交換系統(tǒng)（LI-6400XT，LiCor Inc，Nebraska，USA）測(cè)定葉片的光合作用參數(shù)，采用LED紅藍(lán)光源，設(shè)置光強(qiáng)800 mol m-2 s-1，葉室溫度20 ，CO2濃度恒定為400 mol m-2

14、s-1。計(jì)算得到凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間 CO2濃度（Ci）等參數(shù)。測(cè)定時(shí)間在上午9：0011：00時(shí)，晴朗無(wú)云。每個(gè)小區(qū)取3株測(cè)定，3次重復(fù)，每株植株待讀數(shù)穩(wěn)定后分別讀取3次，取平均值。 1.2.4 光響應(yīng)曲線和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 2013年5月，在結(jié)球期選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株相同葉位的成熟葉片測(cè)定光響應(yīng)曲線和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。利用LI-6400XT，使用LED紅藍(lán)光源，設(shè)置11個(gè)光合有效輻射梯度（PAR），葉室溫度20 ，CO2濃度恒定（400 mol m-2 s-1）。測(cè)定時(shí)間在上午9：0011：00時(shí)，晴朗無(wú)云。每個(gè)小區(qū)取3株測(cè)定，3次重復(fù)。 測(cè)定葉綠素

15、熒光參數(shù)前1 d，將待測(cè)植株葉片黑暗處理約16 h，并于第2天上午7：00時(shí)開始測(cè)定，設(shè)置葉室溫度20 ，CO2濃度恒定400 mol m-2 s-1。利用 LI-6400XT測(cè)定Fo和Fm，計(jì)算Fv，然后在自然光下適應(yīng)30 min，待顯示穩(wěn)定后，測(cè)定Fs、Fm和Fo，計(jì)算Fv、Fv、暗適應(yīng)下PS最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光適應(yīng)下PS最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光適應(yīng)下PS實(shí)際光化學(xué)效率（PS）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（QP）、非化學(xué)猝滅系數(shù)（QN）和非環(huán)式電子傳遞速率（ETR），所有計(jì)算均根據(jù)Demmig-Adams和Adams（1996）提出的方法。每個(gè)小區(qū)測(cè)定2株，3次重復(fù)。 1.2.5

16、葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察 2012年秋季測(cè)定。分別取突變體YL-1及WT708在子葉期（播種后15 d）、苗期（播種后28 d）、蓮座期（播種后50 d）和成熟期（播種后75 d）的相同葉位葉片，參照Lichtenthaler等（1982）的方法，并略有改動(dòng)，將葉片中部避開葉脈處，取葉片，切成寬1 mm，長(zhǎng)2 mm的塊狀。每株取7個(gè)小塊，放入裝有4%戊二醛溶液的2 mL離心管中，抽真空，在4 條件下固定3 d。用1%磷酸緩沖液漂洗4次，放入1%、pH 7.2的鋨酸中，4 條件下固定12 h，再用1%磷酸緩沖液漂洗3次，用乙醇逐級(jí)脫水后，進(jìn)行環(huán)氧樹脂浸透包埋，用超薄切片機(jī)切片（EM UC 6，Lei

17、ca，DEU），經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對(duì)切片雙重染色后，在透射電子顯微鏡（H-7500，Hitachi Limited，JPN）觀察，用掃描相機(jī)（832，Gatan，USA）拍照，觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。每個(gè)小區(qū)測(cè)定1株，3次重復(fù)。 1.2.6 不同溫度處理對(duì)YL-1光合色素含量的影響 2013年7月，將突變體YL-1和WT708分別播種在MS培養(yǎng)基（Murashige & Skoog，1962）中，將培養(yǎng)瓶放在組培室（25 ）培養(yǎng)至子葉完全展開，放入不同溫度的人工培養(yǎng)箱中。高溫35 /20 ；對(duì)照25 /15 ；低溫15 /8 ，光照強(qiáng)度均為400 mol m-2 s-1，白天16 h，夜晚8

18、 h。每處理培養(yǎng)15株。培養(yǎng)7 d后開始取葉片，每隔7 d取1次，一共取3次，測(cè)定并計(jì)算出Chl.a、Chl.b、Chl.和Car.等光合色素平均含量。分別計(jì)算YL-1各光合色素含量較WT708降低的百分比。 1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，用DPS軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。光響應(yīng)曲線利用Photosythesis軟件（LI-COR，USA）計(jì)算光補(bǔ)償點(diǎn)（LCP）和光飽和點(diǎn)（LSP）。 1136 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 2 結(jié)果與分析 2.1 YL-1與WT708成熟期主要農(nóng)藝性狀的差異 在成熟期對(duì)YL-1與WT708的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)

19、現(xiàn)葉色突變體YL-1在最大外葉長(zhǎng)、最大外葉寬、株高、開展度、球質(zhì)量、球高和球?qū)捝巷@著低于WT708（表1），分別低22.90%、24.42%、30.39%、26.87%、61.01%、22.88%和31.53%。成熟期突變體YL-1的葉色仍然黃化，可以結(jié)球，但單球質(zhì)量只有WT708的39.0%（圖1）。 表1 YL-1與WT708成熟期主要農(nóng)藝性狀的比較 Table 1 Comparison of agronomic traits between theYL-1andWT708at heading stage 材料 Material 株高/cm Plant height 開展度/cm Plan

20、t expansion 球質(zhì)量/kg Head weight 球高/cm Head height 球?qū)?cm Head width YL-1 21.30 1.10 b 41.10 1.41 b 0.62 0.03 b 12.34 1.44 b 11.16 0.32 b WT708 30.60 0.89 a 56.20 2.59 a 1.59 0.20 a 16.00 0.79 a 16.30 1.32 a 外葉色 Leaf color 材料 Material 最大外葉長(zhǎng)/cm Length of max. leaf 最大外葉寬/cm Width of max. leaf L* a* b* YL

21、-1 20.20 1.04 b 22.90 1.34 b 51.66 1.89 a 12.27 1.34 a 23.64 1.84 a WT708 26.20 0.84 a 30.30 3.42 a 46.50 1.91 b 11.50 1.20 b 18.73 2.23 b 注：L*：0 100，表示從暗到亮；a*：a*表示綠色，+ a*表示紅色；b*：b*表示藍(lán)色，+ b*表示黃色。表中數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤，不同字母表示突變體YL-1和WT708之間存在顯著差異（P 0.05）。下表同。 Note：L：0100，represents from dark to light；a*：a* rep

22、resents green，+ a* represents red；b*：b* represents blue，+ b* represents yellow. Values are means S.E. Means followed by the different letters indicate the significant differences between the mutant and the reference the altitudes at P 0.05. The same below. 圖1 YL-1與WT708不同生長(zhǎng)時(shí)期的性狀對(duì)比 Fig. 1 Agronomic t

23、raits comparison betweenYL-1andWT708in different growth stages 2.2 YL-1與WT708光合色素含量的比較 測(cè)定結(jié)果表明，在整個(gè)生育期葉色黃化突變體YL-1的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量和類胡蘿卜素始終顯著低于WT708（圖2）。播種后28、42、56和70 d，突變體YL-1的葉綠6期 楊 沖等：甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生理特性及其葉綠體的超微結(jié)構(gòu) 1137 素a含量比WT708低46.12%、36.63%、28.83%和36.77%；葉綠素b分別低39.42%、31.63%、31.68%和34.28%；葉綠素總含

24、量分別低41.68%、34.13%、30.25%和35.53%；類胡蘿卜素含量低25.36%、35.00%、32.72%和34.97%，表明該突變體是總?cè)~綠素缺乏突變體，光合色素含量均比WT708低約30%。 在整個(gè)發(fā)育過程中，YL-1葉綠素a與葉綠素b的比值（Chl.a/Chl.b）與WT708無(wú)明顯差異。總?cè)~綠素與類胡蘿卜素比值（Chl./Car.）在播種后28 d時(shí)顯著低于WT708，之后二者無(wú)差異，維持在4.0左右。 圖2 突變體YL-1與WT708不同時(shí)期光合色素含量及相對(duì)比值 Fig. 2 The content and relative ratio of various phot

25、osynthetic pigments in leaves of mutantYL-1andWT708at different stages 2.3 YL-1與WT708的光合作用參數(shù)的差異 由表2可以看出，YL-1在苗期（播種后28 d）、蓮座期（播種后50 d）和結(jié)球期（播種后75 d），凈光合速率（Pn）均顯著低于WT708，分別低39.47%、23.45%和25.10%，在苗期差異最大；氣孔導(dǎo)度（Gs）與WT708之間沒有明顯差異；胞間CO2濃度（Ci）在苗期和蓮座期顯著高于WT708；蒸騰速率（Tr）在苗期顯著低于WT708，之后無(wú)明顯差異。由測(cè)定結(jié)果可以看出，YL-1與WT708的

26、各光合參數(shù)差異在苗期最大，隨著不斷生長(zhǎng)，突變體恢復(fù)了部分光合能力，但與WT708的光合能力仍有顯著差異。 1138 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 圖3 YL-1與WT708結(jié)球期葉片的光響應(yīng)曲線 Fig. 3 Light-response curves（PnPAR）ofYL-1and WT708at heading stage 表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期突變體YL-1與WT708葉片的光合指標(biāo)參數(shù) Table 2 Photosynthesis indexes of mutantYL-1andWT708in the different growth stages 時(shí)期 Period 材料 Material 凈

27、光合速率 / （mol m-2 s-1） （Pn） 氣孔導(dǎo)度/ （mol m-2 s-1 ） Gs 胞間CO2 濃度/ （mol mol-1 ） Ci 蒸騰速率/ （mmol m-2 s-1 ） Tr YL-1 9.91 3.03 b 0.41 0.005 a 350.46 4.34 a 3.11 0.05 b 苗期 Seedling stage WT708 16.37 0.77 a 0.44 0.003 a 319.18 8.15 b 3.82 0.53 a YL-1 16.54 1.64 b 0.21 0.001 a 242.85 14.39 a 7.92 5.62 a 蓮座期 Roset

28、te stage WT708 21.60 3.74 a 0.29 0.088 a 225.66 47.43 b 9.05 1.46 a 結(jié)球期 YL-1 15.56 3.09 b 0.30 0.005 a 297.59 18.97 a 4.99 0.90 a Heading stage WT708 20.77 1.58 a 0.31 0.001 a 271.21 9.39 b 4.81 0.15 a 2.4 YL-1與WT708的光響應(yīng)曲線和葉綠素?zé)晒鈪?shù) 由圖3可見，在恒定的CO2濃度和一定光照范圍，YL-1和WT708的凈光合速率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)光強(qiáng)高于1 000 mol m-2 s-1時(shí)，

29、2份材料的凈光合速率升高速度均放緩，YL-1始終顯著低于WT708。經(jīng)過Photosythesis軟件計(jì)算和DPS方差分析，YL-1的光飽和點(diǎn)和光補(bǔ)償點(diǎn)（1 372.8和64.5 mol m-2 s-1）顯著高于WT708（1 270.1和46.9 mol m-2 s-1）。由此表明YL-1對(duì)光強(qiáng)的依賴性高于WT708，同等光強(qiáng)條件下WT708對(duì)光能的利用效率更高。 結(jié)球期測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)的結(jié)果（表3）表明，YL-1顯著低于WT708。Fo數(shù)值與葉綠素濃度有關(guān)；Fm低表明PS電子傳遞受到一定的影響；Fo是PS在光下完全開放時(shí)的熒光產(chǎn)量（Rohek & Bartk，1999；趙會(huì)杰 等，200

30、0）。YL-1的Fo、Fm和Fo的顯著降低與其葉片葉綠素含量顯著降低的情況一致。 表3 突變體YL-1與WT708葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù) Table 3 The chlorophyll fluorescence kinetics parameters between mutantYL-1andWT708 材料Material Fo Fm Fo Fv/Fm Fv/Fm YL-1 126.79 10.31 b 662.14 71.67 b 137.68 8.94 b 0.78 0.04 b 0.58 0.03 b WT708 143.48 15.21 a 762.13 72.93 a 153.38

31、4.47 a 0.84 0.01 a 0.65 0.02 a 材料Material PS QP QN ETR YL-1 0.40 0.02 b 0.69 0.01 b 2.39 0.18 b 200.56 12.42 b WT708 0.47 0.03 a 0.72 0.02 a 2.91 0.18 a 239.62 13.53 a Fv/Fm是PS反應(yīng)中心暗反應(yīng)下最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，一般比較恒定，在0.80 0.85之間（Bjrkman & Demmig，1987）。表2中YL-1的Fv/Fm、Fv/Fm和PS降低表明PS反應(yīng)中心激發(fā)能和光能捕獲效率降低，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了光響應(yīng)曲線的結(jié)果。葉

32、綠素?zé)晒忖缡侨~綠體耗散能量的一種途徑，包括光化學(xué)猝滅（QP）和非光化學(xué)猝滅（QN）（Rohek & Bartk，1999；趙會(huì)杰 等，2000）。YL-1的QP和QN的顯著降低表明其光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率和熱耗散均顯著低于WT708。ETR是非環(huán)式電子傳遞速率，YL-1的ETR顯著低于WT708，說(shuō)明YL-1的表觀電子傳遞效率降低，不利于光能利用，這與其光合速率降低的結(jié)果一致。 6期 楊 沖等：甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生理特性及其葉綠體的超微結(jié)構(gòu) 1139 2.5 YL-1與WT708葉綠體超微結(jié)構(gòu)比較 從圖4中可以看出，WT708苗期葉綠體緊貼細(xì)胞壁分布，葉綠體數(shù)多，發(fā)育得較為成熟，呈卵圓

33、形或梭形，可以清晰地看到葉綠體中的基粒和基質(zhì)片層（圖4，A28 d），YL-1苗期部分細(xì)胞為不正常細(xì)胞，細(xì)胞為圓形，葉綠體游離分布在細(xì)胞內(nèi)，呈圓形，雖然能看到片層結(jié)構(gòu)，但片層數(shù)明顯少（圖4，B28 d）。在蓮座期，WT708葉綠體發(fā)育良好，類囊體膜片層系統(tǒng)由基粒片層和基質(zhì)片層兩部分組成，基質(zhì)類囊體和基粒內(nèi)囊體高度分化，基粒垛疊層數(shù)較多，規(guī)律分布，有淀粉粒（圖4，A50 d）；與WT708相比，YL-1葉綠體中雖然能看到基粒與基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)，但基粒數(shù)量少，基粒片層數(shù)少，基粒排列不整齊，無(wú)淀粉粒（圖4，B50 d）；在結(jié)球期WT708葉綠體與前期比較，淀粉粒變大，基粒與基質(zhì)片層無(wú)明顯變化（圖4，A7

34、5 d），而YL-1葉綠體中基粒排列整齊，基粒數(shù)量增加，基粒片層數(shù)增加，有淀粉粒，但與WT708仍有差距（圖4，B75 d）。 圖4 WT708與YL-1葉綠體超微結(jié)構(gòu) A：WT708；B：YL-1；GL：基粒片層；SL：基質(zhì)片層：S：淀粉粒。 Fig. 4 Ultrastructure of chloroplast inWT708andYL-1 A；WT708；B：YL-1；GL：Grana lamellae；SL：Stroma lamellae；S：Starch grains. 1140 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 2.6 不同溫度處理對(duì)YL-1光合色素含量的影響 比較3個(gè)溫度下YL-1光合色

35、素含量與WT708的差異（圖5），在相同培養(yǎng)時(shí)期YL-13種色素的降低百分率值均是在低溫時(shí)最大，高溫時(shí)最小。由此說(shuō)明溫度越低，YL-1與WT708的光合色素含量差異越大，對(duì)低溫更敏感。根據(jù)觀察，YL-1與WT708在子葉剛長(zhǎng)出來(lái)時(shí)葉色差異不明顯，YL-1不表現(xiàn)黃化現(xiàn)象，隨著子葉不斷生長(zhǎng)，差異逐漸顯現(xiàn)，真葉長(zhǎng)出時(shí)差異增大。相同溫度下，不同時(shí)期的YL-1降低百分率值均在播種后14 d時(shí)最大，說(shuō)明YL-1在子葉展開后表現(xiàn)出光合色素缺乏，隨著不斷生長(zhǎng)，缺乏逐步加劇，在播種后14 d時(shí)最大，然后隨著真葉不斷生長(zhǎng)，葉綠素的缺乏略有恢復(fù)。 同一時(shí)期同一溫度下，類胡蘿卜素降低百分率值小于葉綠素（圖5），由此說(shuō)

36、明YL-1中的葉綠素缺乏程度比類胡蘿卜素大。 圖5 不同溫度下突變體YL-1與WT708的光合色素含量的差異變化 Fig. 5 Decrement rate of the photosynthetic pigments content between mutantYL-1andWT708under different temperatures 3 討論 3.1 葉色黃化突變體YL-1葉綠素含量變化及其與葉綠素超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系 前人研究表明，葉色變異與葉綠素含量和葉綠體結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系（Falble et al.，1996；趙云 等，2003；苗晗 等，2010；張立科 等，2010）。本試驗(yàn)中，葉

37、色黃化突變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中葉綠6期 楊 沖等：甘藍(lán)葉色黃化突變體YL-1的光合生理特性及其葉綠體的超微結(jié)構(gòu) 1141 素a和b含量均大幅度降低，為總?cè)~綠素缺失型，在生長(zhǎng)后期，突變體YL-1葉綠素含量得到部分恢復(fù)，但仍明顯小于WT708，這與觀察到的生長(zhǎng)勢(shì)變化、葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)一致。在苗期和蓮座期，YL-1的葉綠體基粒數(shù)量少，基粒片層數(shù)少，基粒排列不整齊；但在成熟期YL-1細(xì)胞葉綠體中基粒排列整齊，基粒數(shù)量增加，基粒片層數(shù)增加，不過與WT708仍有明顯差距。此外，大量研究表明，幾乎所有的葉綠素突變體的葉綠體結(jié)構(gòu)都有不同程度的改變（Simpson & Von Wettstein，198

38、9；Austin & Webber，2005）。透射電子顯微鏡觀察顯示本試驗(yàn)中YL-1細(xì)胞中發(fā)育正常的葉綠體數(shù)較野生型略少，還有部分葉綠體形狀呈不正常圓形。 高等植物葉綠素合成途徑為：谷氨酸（Glu） 氨基酮戊酸（ALA） 膽色素原（PBG） 尿卟啉原（Urogen ） 糞卟啉原（Coprogen ） 原卟啉（Proto） 原葉綠素酸酯（Pchlide） 葉綠素酸酯（Chlide） Chl.a Chl.b（Von Wettstein et al.，1995）。Wu等（2007）對(duì)水稻葉色突變體ygl1的研究中發(fā)現(xiàn)，苗期葉片Chl.a/Chl.b為8.0，后期降低至正常比值范圍，揭示了黃化的原因

39、是由于突變體的葉綠素合成酶基因ygl1（表達(dá)產(chǎn)物催化Chl.a轉(zhuǎn)化為Chl.b）的cDNA編碼區(qū)上發(fā)生單堿基突變。而崔海瑞等（2001）研究的水稻黃化突變體W1黃化的原因是葉綠素合成受阻，受阻部位發(fā)生在由PBG到Urogen 的過程中。但本試驗(yàn)中葉色黃化突變體YL-1的Chl.a/Chl.b在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中始終保持在正常比值范圍內(nèi)，參考已報(bào)道的葉綠素合成途徑，推測(cè)YL-1從葉綠素a到葉綠素b的轉(zhuǎn)化過程正常，造成黃化的原因應(yīng)在葉綠素a合成之前的某個(gè)途徑中，作者曾設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增葉綠素合成酶基因，進(jìn)行測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)YL-1與WT708間無(wú)差異。Jilani等（1996）發(fā)現(xiàn)乙酰丙酸可以通過影響葉綠素

40、合成間接抑制類胡蘿卜素合成。本試驗(yàn)中葉色黃化突變體在不同生長(zhǎng)階段葉綠素含量的變化幅度比類胡蘿卜素大；相同溫度下葉綠素的缺乏程度比類胡蘿卜素大。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果以及Jilani等（1996）的結(jié)論，推測(cè)甘藍(lán)突變體YL-1的葉色黃化是由于葉綠素合成受阻造成的，類胡蘿卜素含量的降低只是由于葉綠素降低導(dǎo)致的。 3.2 葉色黃化突變體YL-1光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化趨勢(shì) 葉綠體的數(shù)量和發(fā)育情況會(huì)影響葉綠素的含量和植物的光合作用，光合色素主要集中在葉綠體基粒中，在整個(gè)生長(zhǎng)周期，突變體YL-1凈光合速率均顯著低于正常對(duì)照。突變體YL-1的LSP和LCP明顯高于對(duì)照，表明YL-1光強(qiáng)的依賴性高于正常對(duì)照。

41、葉綠素?zé)晒庾兓诠夂献饔眠^程中與對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散和分配等反應(yīng)緊密聯(lián)系，突變體光合作用中的變化可以通過葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定以某些熒光參數(shù)變化反映出來(lái)。本研究中，突變體YL-1成熟葉片中的Fo、Fm和Fo顯著低于正常對(duì)照，這與葉綠素含量顯著降低的情況一致，與曹莉等（2006）對(duì)小麥黃化突變體的研究和肖華貴等（2013）對(duì)甘藍(lán)型油菜黃化突變體的研究結(jié)果相同。Fv/Fm變化代表了PS反應(yīng)中心光化學(xué)效率的變化，是光能利用效率的一個(gè)重要指標(biāo)（Rohek & Bartk，1999；趙會(huì)杰 等，2000）。已有的研究表明，有的突變體Fv/Fm高于野生型，如小麥黃綠和綠黃突變（曹莉 等，2006）、水稻黃化突

42、變（王聰田 等，2007）、白菜黃化突變（郭士偉 等，2003）、大麥黃化突變（譚新星和許大全，1996），還有的突變體Fv/Fm低于野生型，如小麥金黃突變（曹莉 等，2006）、甘藍(lán)型油菜黃化突變（肖華貴 等，2013）。在本研究中YL-1的Fv/Fm及Fv/Fm顯著降低，表明隨著葉綠素含量降低到一定范圍時(shí)，突變體的光化學(xué)效率顯著降低，這與YL-1更依賴于光強(qiáng)的結(jié)果相吻合。本研究中YL-1的PS和ETR顯著降低，表明葉綠素含量減少比葉綠素含量較多時(shí)PS反應(yīng)中心光能捕獲效率較低，表觀電子傳遞效率降低，不利于光能利用，導(dǎo)致光合速率降低；其QP和QN顯著降低，推測(cè)突變體由于捕光效率低，吸收的光能較

43、少地用于熱耗散，這與甘藍(lán)型油菜（肖華貴 等，2013）、小麥（曹莉 等，2006）等作物相關(guān)黃化突變體的變化趨勢(shì)相同。 1142 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 3.3 溫度對(duì)葉色黃化突變體YL-1光合色素含量的影響 苗晗等（2010）對(duì)黃瓜葉色突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，在低溫下突變體呈明顯金黃色，高溫下可很快恢復(fù)綠色。崔海瑞等（2001）對(duì)水稻突變體W1的研究表明，突變體對(duì)低溫敏感，在低溫下葉片表現(xiàn)白化。本試驗(yàn)中不同溫度處理下的突變體隨著溫度的降低，與正常對(duì)照之間的光合色素含量差異逐漸加大，隨著溫度升高，雖然葉片恢復(fù)部分綠色，但也與正常對(duì)照差異明顯，說(shuō)明YL-1的葉色黃化也受到溫度的影響，低溫加劇了葉綠素

44、的缺乏。本試驗(yàn)中突變體YL-1的各光合色素在播種后70 d時(shí)又下降，這與光合色素在之前逐漸增加的趨勢(shì)不符，是因?yàn)楸驹囼?yàn)中播種后70 d是10月中旬（最高溫18 ，最低溫5 ），而YL-1對(duì)低溫又很敏感，推測(cè)由于此時(shí)低溫使得各光合色素含量反而下降，這與不同溫度處理試驗(yàn)得出的結(jié)論一致。雖然隨著溫度的升高，YL-1葉色黃化程度、葉綠素含量減少有所減輕，但始終無(wú)法恢復(fù)到正常葉色。 3.4 葉色黃化突變體YL-1的應(yīng)用價(jià)值 葉色突變體種類繁多，在很多高等植物中都有發(fā)現(xiàn)（Carol et al.，1999；Jung et al.，2003；Lonosky et al.，2004）。有一些葉色黃色的突變體因

45、為其光合能力比較差和表型不穩(wěn)定，不能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，如水稻（Terao et al.，1985；Hsu & Lee，1995）。還有一些葉色黃化突變體的表型穩(wěn)定，可以作為標(biāo)記性狀在雜種優(yōu)勢(shì)利用中應(yīng)用。Zhao等（2000）將甘藍(lán)型油菜黃化突變體苗期標(biāo)記性狀引入雄性不育系，突變體顯現(xiàn)出同樣優(yōu)越的配合力，表明該黃化突變性狀可以作為一個(gè)標(biāo)記應(yīng)用于雜交育種中。雖然本試驗(yàn)中的YL-1葉色黃化明顯，且影響到生長(zhǎng)勢(shì)和葉球大小，但YL-1和正常對(duì)照WT708與相同父本配置雜交組合（YL-12209，WT7082209），經(jīng)觀察顯示它們分別得到的F1之間的生長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯差異。在有明顯雜交優(yōu)勢(shì)的前提下，可以利用其葉

46、色黃化的特點(diǎn)作為良種繁育后代純度鑒定的苗期標(biāo)記性狀，提高田間純度鑒定的準(zhǔn)確性和效率，且由于不存在轉(zhuǎn)基因安全性問題，YL-1可以直接用于常規(guī)育種。 References Arnon D I. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Phenoloxidases in Beta vulgaris. Plant Physiol，24 (1)：115. Austin II J，Webber A N. 2005. Photosynthesis in Arabidopsis thaliana mutants with reduced chloropla

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