蛋白質組學定量研究常見方法

1、蛋白質組學定量研究常見方法 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663蛋白質組學定量研究常見方法蛋白質組學定量研究常見方法o 1 1：常規(guī)雙向電泳：常規(guī)雙向電泳o 2 2：digedigeo 3 3：1515n n等同位素標記等同位素標記o 4 4：icaticato 5 5：itraqitraqo 6 6：silacsilac 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16631：常規(guī)雙向電泳：常規(guī)雙向電泳o一、雙向電泳概述：一、雙向電泳概述： 雙向電泳(two-dimensional electrophores

2、is)的基本原理是利用蛋白質的等電點（pi)和分子量(mr)不同而分離蛋白質：第一向電泳等電聚焦（isoelectric focusing，ief）根據(jù)蛋白質的等電點不同將蛋白質分離，第二向電泳十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, sdspage）利用蛋白質的分子量大小不同將蛋白質分離。 雙向電泳一次可以從細胞、組織或其它生物樣本中分離上千種蛋白質，凝膠上的斑點都對應著樣品中的蛋白質，且各種蛋白質的等電點，分子量和含量的信息都能通過質譜鑒定和軟件分析獲得。因此其在蛋白質組分析、疾病

3、標志物檢測、細胞差異分析、藥物開發(fā)、癌癥研究等領域都得到了廣泛的應用。o二：雙向電泳分離蛋白質混合物具有以下優(yōu)勢：二：雙向電泳分離蛋白質混合物具有以下優(yōu)勢： 1、經(jīng)典方法、應用范圍廣、適用于各類材料； 2、經(jīng)濟實惠，可大規(guī)模多個樣本篩選和分析。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16631 1：雙向電泳：雙向電泳 基于基于2d-page2d-page的經(jīng)典定量分的經(jīng)典定量分析方法。析方法。 1 1、樣品準備、樣品準備和定量：和定量：抽提對照組和各種不同實驗組的蛋白質。 2 2、蛋白質分、蛋白質分離：離：蛋白質經(jīng)過2d-page分離后染色（銀染、考染等

4、）。 3、蛋白質的、蛋白質的定性與定量分定性與定量分析：析：通過與對照組相image master 7.0分析出實驗組中差異點，質譜鑒定差異點蛋白質,同時應用軟件分析出其表達量的變化。2 2：digedige 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-1663簡介：簡介： dige 雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（cy2, cy3, cy5）能與蛋白質賴氨酸的氨基反應而使蛋白質被標記，標記后蛋白質的等電點和分子量基本不受影響，等量混合標記好的蛋白質后進行雙向電泳，蛋白質表達量的變化則通過不同熒光的強度來體現(xiàn)。技術優(yōu)勢：技術優(yōu)勢： 1：高效性，同一塊凝膠上

5、可以電泳兩個樣品，減輕了工作量； 2：與常規(guī)銀染相比靈敏度更高； 3：檢測動態(tài)范圍更大； 4：定量精確, 采用內(nèi)標而消除了膠與膠之間的實驗誤差； 5：統(tǒng)計學分析，imagemaster7.0（dige）軟件可以得到統(tǒng)計學可信的結果，降低了操作者之間的偏差。2 2：digedige digedige熒光定量方法流程圖熒光定量方法流程圖. . 1 1、樣品準備、樣品準備：提取對照組和不同實驗組的蛋白質,定量,cy3和cy5交叉標記，同時將所有實驗組與對照組的樣品等量混合后cy2標記，作為內(nèi)標。 2 2、蛋白質分離：、蛋白質分離：等量混合三種熒光素標記后的蛋白質，2d-page電泳分離，熒光顯色。

6、3 3、蛋白質定量分析：、蛋白質定量分析：image master 7.0（dige)分析同一蛋白質不同處理后的表達量變化。3 3：代謝標記法：代謝標記法1515n n標記法標記法簡介：簡介： 在培養(yǎng)基中添加15n，細胞經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，蛋白質將完全被同位素標記，等量混合標記與沒有標記同位素的樣本、液相色譜和sds-page分離，質譜鑒定和定量。 根據(jù)質譜譜圖中成對峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。優(yōu)點：優(yōu)點： 高效性：15n標記法是體內(nèi)標記技術，標記效率可高達95%； 重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異； 靈活性：在

7、培養(yǎng)基中添加同位素標記15n ，操作方便。缺點：缺點： （1）只有已知蛋白質的氨基酸序列，才可以對14n/15n標記的蛋白質或肽段的相應質量位移進行預測。 （2）由于使用的15n培養(yǎng)基純度96%，無法完全置換14n,所以15n標記的肽段在質譜中會有額外的同位素峰。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16634 4：化學標記法：化學標記法icaticata: icat試劑結構，包括3個部分，sh反應集團， biotin標簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個氘）和輕型（不含氘）b: icat標記定量技術流程，來源不同處理的蛋白質分別用重型icat

8、試劑和輕型icat試劑標記，標記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到icat標記的多肽，質譜分析，依據(jù)ms質譜峰圖強度進行定量，ms/ms鑒定肽段。4 4：化學標記法：化學標記法icaticaticaticat法的缺點：法的缺點： （1）它不能用于標記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質。 （2）icat分子量相對較大（約500da），與蛋白質連接后可能會造成分子的空間位阻 （3）icat分子量相對較大（約500da），由于在ms分析中標簽仍保留在每個肽上，使得在碰撞誘導解吸（cid)條件下，很容易被片段化，那么標簽特異化的片段離子就會使串聯(lián)質譜分析標記肽段的過程復雜化， （4） icat分

9、子量相對較大（約500da），這對小肽而言是一個較大的修飾物，會增加數(shù)據(jù)庫搜索的復雜性 （5）標記時通常需要延長時間來保證icat與蛋白質充分結合，這可能會造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發(fā)生氨基酸局部衍化。 （6）與原子結合的硫醚鍵化學穩(wěn)定性較低，可能會自發(fā)發(fā)生-消除反應使部分標簽斷裂。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16635: 化學標記法itraq簡介：簡介： itraq試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側鏈氨基連接的胺標記同重元素。在質譜圖中，任何一種itraq試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現(xiàn)為相同的質荷比。 在串聯(lián)質譜中，信號離子表現(xiàn)

10、為不同質荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質和分析出同一蛋白質不同處理的定量信息。itraqitraq 結構結構 itraq包括三部分：報告部分、肽反應部分、平衡部分。 1、報告部分：有八種，因此itraq可同時標記8組樣品。 2、肽反應部分：能與肽n端及賴氨酸側鏈發(fā)生共價連接而標記上肽段，幾乎可以標記所有蛋白質。 3、平衡部分：保證itraq標記的同一肽段的質荷比相同。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16635: 化學標記法itraq與傳統(tǒng)基于雙向電泳定量分析相比，與傳統(tǒng)基于雙向電泳定量分析相比，itr

11、aqitraq具有以下技術優(yōu)勢：具有以下技術優(yōu)勢：o1：靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；o2：分離能力強,分析范圍廣,itraq可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括高分子量蛋白質、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。o3: 高通量：同時對8個樣本進行分析，提高了實驗通量，可同時對多個時間點或不同處理的蛋白質進行分析； o4：結果可靠：定性與定量分析結果更加可靠；o5：自動化程度高：液相與質譜連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16635: 化學標記法itraq itraq法。 1：樣本經(jīng)過不同處理

12、后，提取蛋白質; 2：蛋白質經(jīng)過還原，封閉后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分別用不同的itraq標記; 4：等量混合各種itraq試劑標記的肽段; 5：ms/ms質譜檢測及分析。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16636: silac6: silacosilac即細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，silac)，其基本原理是在細胞培養(yǎng)時，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，用于silac主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是ly

13、s和arg, 細胞在傳代培養(yǎng)過程中同位素氨基酸將被細胞用于合成蛋白質，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細胞的所有蛋白質將被同位素標記，等量混合標記的蛋白質后經(jīng)過sds-page分離和質譜分析，通過比較一級質譜圖中三個同位素型肽段的面積大小進行相對定量，同時二級譜圖對肽段進行序列測定從而鑒定蛋白質。o由于silac標記技術是體內(nèi)標記技術，幾乎不影響細胞的功能，同時靈敏度高，因此其在蛋白質組學相關領域中得到了廣泛的應用，如比較蛋白質組學，蛋白質與蛋白質相互作用，蛋白質與dna相互作用，蛋白質與rna相互作用等領域。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16636

14、: silac6: silac 技術優(yōu)勢技術優(yōu)勢目前比較蛋白質組學最先進方法目前比較蛋白質組學最先進方法 （1）高效性：）高效性：silac是體內(nèi)標記技術，標記效率可高達100%； （2）定量精確：）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實驗內(nèi)差異； （3）高通量、靈敏度高：）高通量、靈敏度高：可同時鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質，且檢可測測到納克級水平； （4）相容性：）相容性：可以對多種在dmem或rpmi 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記； （5）靈活性：）靈活性：在缺乏l-賴氨酸和l-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標記的這兩種氨基酸，操作方便。 輝駿生物：輝駿生物：http:/ 免費服務熱線：免費服務熱線：400-699-16636 6：silacsilac silac法。 1、標記