MGMT-甲基化試劑盒研發(fā)課件

1、人類MGMT基因（啟動(dòng)子）甲基化檢測(cè)(MSP法)試劑盒研發(fā)項(xiàng)目分享主講人：劉駿琿 技術(shù)支持：劉旭宏抑癌基因 它可以通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及蛋白-蛋白之間的相互影響起作用，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移、粘連、增殖及細(xì)胞周期，促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。MGMT基因啟動(dòng)子 1.與癌癥相關(guān) 腦膠質(zhì)癌 腸癌 口腔癌 腸癌研發(fā)思路MGMT甲基化檢測(cè)試劑盒研發(fā)引物的篩選引物性能的評(píng)估引物優(yōu)化比例的確定初步檢測(cè)體系的建立多因素優(yōu)化設(shè)計(jì)DNA質(zhì)控體系建立，甲基化標(biāo)準(zhǔn)品合成基因殘留質(zhì)控轉(zhuǎn)化成功質(zhì)控98%轉(zhuǎn)化參考品構(gòu)建篩選合格樣本甲基化濃度梯度參考品甲基化水平的檢出檢測(cè)流程的建立分析性能評(píng)估檢測(cè)體系建立HAN

2、DS系統(tǒng)的引入檢測(cè)位點(diǎn)確定 通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研確定MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)域 甲基化CpG島預(yù)測(cè)并與文獻(xiàn)比較 ACGAACGTCGAAACGCAAAACGTTCTAAAAACGCG 共7個(gè)潛在CpG位點(diǎn) MGMT甲基化標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 1.確定目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)引物 2.重疊延伸PCR制備DNA 3.菌液培養(yǎng) 4.濃度標(biāo)定 5.測(cè)序驗(yàn)證DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化體系確定 供應(yīng)商選擇1.天根DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(DP215)2.EpiMark重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒3.EZ DNA Methylation-GOLD Kit 轉(zhuǎn)化程序選擇 1. 98C for 10 minutes 2. 53C for 30 minut

3、es 3. 53C for 6 minutes OR 4. 37C for 30 minutes 5. 4C storage（3-4步 8循環(huán)）qPCR體系建立三大體系 G體系 針對(duì)人類基因組DNA設(shè)計(jì) P（非甲基化）體系 根據(jù)轉(zhuǎn)化后序列（非CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針） L（甲基化）體系 覆蓋CpG位點(diǎn)（全甲基化）的長(zhǎng)探針引物探針設(shè)計(jì) HANDS系統(tǒng)引入 1.減少引物二聚體 2.增加結(jié)合效率 3.增加酶切活性 4.保護(hù)堿基HANDS系統(tǒng)5353針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板引物的篩選實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：F1R2 檢測(cè)Ct值靠前，擴(kuò)增效率較高，因此擬采用這對(duì)引物作為檢測(cè)引物F1R2F1R1;F1R3;F2R2

4、;F2R3;F3R2;F3R3;F4R2淬滅探針 甲基化長(zhǎng)探針BHQFAMBHQ針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板探針以及引物HAND的篩選實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：AT-F1R2+POBE2檢測(cè)Ct值靠前，擴(kuò)增效率較高，因此擬采用這對(duì)引物作為檢測(cè)引物F1R2+PROBE1AT-F1 AT-R2+PROBE1F1R2+POBE2AT-F1 AT-R2+POBE2反應(yīng)體系優(yōu)化 1.體系中Buffer，Mg2+,引物濃度等優(yōu)化。 2.添加劑優(yōu)化：蔗糖，NH4+, BSA針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測(cè)體系添加劑體系篩選 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在反應(yīng)體系中不添加任何添加劑對(duì)檢測(cè)的效果較好;F1R2+PROBE2F1R2+PRO

5、BE2+20um蔗糖F1R2+PROBE2+4.6mM NH4+1R2+PROBE2+K+; F1R2+PROBE2+0.1%BSA分析性能評(píng)估 1.特異性考察 2.梯度標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證 3.反應(yīng)體系穩(wěn)定性 4.靈敏度考察針對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存正常人類基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測(cè)應(yīng)用甲基化檢測(cè)探針檢測(cè)其特異性結(jié)果表明，目前合成的甲基化檢測(cè)談針對(duì)甲基化樣品的探針對(duì)于臨床正常非甲基化樣品不能檢出，特異性強(qiáng)，而采用非甲基化探針可以檢測(cè)信號(hào)。應(yīng)用甲基化檢測(cè)探針檢測(cè)其MGMT基因甲基化梯度參考品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：目前體系針對(duì)不同程度甲基化模擬模板，靈敏度為可以為檢測(cè)到6copies/ul400copies/ul200copi

6、es/ul100copies/ul50copies/ul25copies/ul12copies/ul6copies/ul針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測(cè)體系少量臨床樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：目前體系可以對(duì)臨床絕大部分DNA轉(zhuǎn)化液進(jìn)行MGMT啟動(dòng)子的檢測(cè)，只需要一次PCR即能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，不需要巢式PCR針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測(cè)體系靈敏度深入考察 8倍 16倍 32倍 64倍 128倍 256倍 512倍 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：針對(duì)基因組DNA轉(zhuǎn)化模板檢測(cè)體系，可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)化液稀釋512倍相當(dāng)于基因組拷貝數(shù)12質(zhì)量控制體系的建立參考品構(gòu)建 98轉(zhuǎn)化液構(gòu)建 由100人類基因組轉(zhuǎn)化液與人類基因組按比例對(duì)參得到 1：

7、1甲基化參考品 由100人類基因組轉(zhuǎn)化液與甲基化質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按比例對(duì)參得到 應(yīng)用非甲基化檢測(cè)探針檢測(cè)其MGMT基因甲基化梯度參考品結(jié)果表明 梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋2*103copies/ul在Ct值上與400ng轉(zhuǎn)化人類基因組相一致，將這2種樣品等量對(duì)摻相當(dāng)于甲基化和非甲基化為1：1的標(biāo)準(zhǔn)品2*107copies/ul-2*103copies/ul應(yīng)用轉(zhuǎn)化液通檢探針檢測(cè)其MGMT基因甲基化質(zhì)粒梯度參考品并且對(duì)臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液進(jìn)行初步定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：目前梯度稀釋范圍從2*1010copies/ul到2*103copies/ul，臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液lCt值位于2*103copies/ul之后，

8、需要進(jìn)一步定量2*1010copies/ul2*109copies/ul2*108copies/ul2*107copies/ul2*106copies/ul2*105copies/ul2*103copies/ul臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液應(yīng)用轉(zhuǎn)化液通檢探針檢測(cè)其MGMT基因甲基化質(zhì)粒梯度參考品并且對(duì)臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液進(jìn)行進(jìn)一步定量結(jié)果表明 梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋40 copies/ul在Ct值上與2.5ng轉(zhuǎn)化人類基因組相一致，將這2種樣品等量對(duì)摻相當(dāng)于甲基化和非甲基化為1：1的標(biāo)準(zhǔn)品（50%甲基化參考品）2*103copies/ul400copies/ul臨床正常樣本轉(zhuǎn)化液80 copies/ul16 copies/ul4 copies/ul甲基化靈敏度 采用MGMT基因啟動(dòng)子50%的甲基化參考品，按照比例依次稀釋，依次構(gòu)建 50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%應(yīng)用甲基化檢測(cè)探針檢測(cè)其MGMT基因甲基化梯度參考品對(duì)摻正常人類基因組轉(zhuǎn)化液（按照400copies/ul-6copies/ul每一個(gè)濃度都加上正常人類基因組轉(zhuǎn)化液）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：目前體系針對(duì)不同程度甲基化模擬模板靈敏度為2.4%以上濃度梯度均加入2.5ng正常人類基因組轉(zhuǎn)化液構(gòu)成（50%,33%,20%,11%,4.7%,2.4%）參考品400copies/ul200copies/ul100co