腸道病原菌的分離與鑒定一

1、腸道病原菌的分離與鑒定一腸道病原菌的分離與鑒定一l培養(yǎng)基的制備及常用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備及常用培養(yǎng)基l細(xì)菌的培養(yǎng)法細(xì)菌的培養(yǎng)法 emb培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備 腸道病原菌的分離與鑒定（一）腸道病原菌的分離與鑒定（一）l血清學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)-肥達(dá)氏反應(yīng)肥達(dá)氏反應(yīng)培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備(一一)肉湯培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基l材料：鮮牛肉、蛋白胨、氯化鈉、材料：鮮牛肉、蛋白胨、氯化鈉、ph試紙、試紙、10碳酸氫鈉、試碳酸氫鈉、試管、三角燒瓶、蒸餾水等。管、三角燒瓶、蒸餾水等。l方法方法 1將新鮮牛肉將新鮮牛肉500g切碎或攪碎，加水切碎或攪碎，加水1000ml，放，放4冰箱或冷冰箱或冷處浸泡過夜，然后煮沸處浸

2、泡過夜，然后煮沸30min，放涼，使殘余的脂肪凝固，再，放涼，使殘余的脂肪凝固，再用絨布或?yàn)V紙過濾，將濾液補(bǔ)足為原量。用絨布或?yàn)V紙過濾，將濾液補(bǔ)足為原量。 21000ml肉水中肉水中加入蛋白胨加入蛋白胨10g、氯化鈉、氯化鈉5g，加熱溶解。，加熱溶解。 3用精密用精密ph試紙測(cè)酸堿度，用試紙測(cè)酸堿度，用10碳酸氫鈉校正碳酸氫鈉校正ph為為7.2左左右。過堿時(shí)，可用右。過堿時(shí)，可用10醋酸校正之。醋酸校正之。 4分裝于試管中或三角燒瓶中，分裝于試管中或三角燒瓶中，15磅磅(121)高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌2030min。 高壓蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌器(二二)普通瓊脂培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基l材料：肉

3、水、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、無菌平皿、滅菌試管、材料：肉水、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。三角燒瓶等。l方法方法 1按上記數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒按上記數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。瓶中，加熱溶化。 2用用ph試紙測(cè)酸堿度，用試紙測(cè)酸堿度，用10碳酸氫鈉校正碳酸氫鈉校正ph為為7.2左右。左右。 315磅高壓蒸氣滅菌磅高壓蒸氣滅菌2030min。 4趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)

4、基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊?cè)霚缇嚬軆?nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。脂斜面培養(yǎng)基。(三三)血液瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基 有些細(xì)菌其營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長有些細(xì)菌其營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。l材料材料 普通瓊脂培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基 血液血液(脫纖維羊血或兔血脫纖維羊血或兔血) l方法方法 1加熱溶化普通瓊脂培養(yǎng)基。加熱溶化普通瓊脂培養(yǎng)基。 2待冷至待冷至50左右時(shí)，加入無菌的脫纖維血液，混勻左右時(shí)，加入無菌的脫纖維血液，混勻(注意勿使產(chǎn)

5、生泡沫注意勿使產(chǎn)生泡沫)。 3分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培養(yǎng)基。分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培養(yǎng)基。e.m.b瓊脂培養(yǎng)基的制備瓊脂培養(yǎng)基的制備l成分成分 蛋白胨蛋白胨 10g 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀 2g 瓊脂瓊脂 20g 乳糖溶液乳糖溶液(20) 50ml 伊紅溶液伊紅溶液(2) 20ml 美藍(lán)溶液美藍(lán)溶液(0.5) 20ml 蒸餾水蒸餾水 1000mll制法制法 將蛋白胨和磷酸氫二鉀加溫溶化于蒸餾水中將蛋白胨和磷酸氫二鉀加溫溶化于蒸餾水中 校正校正ph值為值為7.6加入瓊脂加入瓊脂 煮沸溶化過濾后分裝三角瓶中，每瓶定量分裝煮沸溶化過濾后分裝三角瓶中，每瓶定量分裝 1

6、5磅磅30min高壓滅菌高壓滅菌 以無菌操作法按量加入經(jīng)以無菌操作法按量加入經(jīng)10磅磅20min高壓滅菌的乳糖、伊紅美蘭高壓滅菌的乳糖、伊紅美蘭液，混勻后傾注平皿備用。液，混勻后傾注平皿備用。e.m.b培養(yǎng)基培養(yǎng)基l原理原理 大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基ph值下降，值下降，伊紅與美藍(lán)相結(jié)合成一種復(fù)合物，酸性環(huán)境中，菌伊紅與美藍(lán)相結(jié)合成一種復(fù)合物，酸性環(huán)境中，菌體帶正電，易與伊紅結(jié)合，故菌落呈紫黑色或紫紅體帶正電，易與伊紅結(jié)合，故菌落呈紫黑色或紫紅色，并有金屬光澤。堿性環(huán)境中伊紅與美藍(lán)不結(jié)合，色，并有金屬光澤。堿性環(huán)境中伊紅與美藍(lán)不結(jié)合，病原菌不分解乳糖，不產(chǎn)

7、酸故菌落為無色半透明。病原菌不分解乳糖，不產(chǎn)酸故菌落為無色半透明。其次，伊紅、美藍(lán)有抑制革蘭氏陽性菌生長的作用。其次，伊紅、美藍(lán)有抑制革蘭氏陽性菌生長的作用。l用途用途 用于分離腸道致病菌，是一種鑒別培養(yǎng)基。并有用于分離腸道致病菌，是一種鑒別培養(yǎng)基。并有弱的選擇作用。弱的選擇作用。肥達(dá)氏反應(yīng)l肥達(dá)氏反應(yīng)通常用已知的傷寒桿菌肥達(dá)氏反應(yīng)通常用已知的傷寒桿菌“o”、“h”菌液和甲、菌液和甲、乙型副傷寒桿菌乙型副傷寒桿菌“h”菌液與病人血清作定量凝集試驗(yàn)菌液與病人血清作定量凝集試驗(yàn)(試試管法管法)，以檢測(cè)病人血清中有無相應(yīng)抗體存在，根據(jù)抗體，以檢測(cè)病人血清中有無相應(yīng)抗體存在，根據(jù)抗體含量多少及增長情況

8、用于傷寒、副傷寒病的輔助診斷。含量多少及增長情況用于傷寒、副傷寒病的輔助診斷。l材料材料 待檢可疑傷寒病人血清待檢可疑傷寒病人血清(1:10稀釋稀釋) 診斷菌液：傷寒桿菌診斷菌液：傷寒桿菌“o” (o) 傷寒桿菌傷寒桿菌“h” (oh) 甲型副傷寒桿菌甲型副傷寒桿菌“h” (pa) 乙型副傷寒桿菌乙型副傷寒桿菌“h” (pb) 生理鹽水生理鹽水 吸管，小試管等。吸管，小試管等。 方法方法l本實(shí)驗(yàn)四人一組，每人取本實(shí)驗(yàn)四人一組，每人取6只小試管，排成一列，計(jì)四列只小試管，排成一列，計(jì)四列為一完整試驗(yàn)。分別標(biāo)明每列管號(hào)和診斷菌液如為一完整試驗(yàn)。分別標(biāo)明每列管號(hào)和診斷菌液如“o”、“oh”、“pa”、“pb”。按下表先向每管加生理鹽水。按下表先向每管加生理鹽水0.5ml，再加，再加10倍稀釋病人血清倍稀釋病人血清0.5ml于第于第l管，做順序的管，做順序的等倍稀釋，最后加入等量的診斷菌液，充分混勻，置等倍稀釋，最后加入等量的診斷菌液，充分混勻，置37 24h，再放室溫，再放室溫2