實驗技術理論－生物大分子的制備

1、生物大分子的制備生物大分子的制備2.1 概述 在自然科學，尤其是生命科學高度發(fā)展的今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。 與化學產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點： 生物材料的組成極其復雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。 許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活

2、，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。 生物大分子的制備通?？砂匆韵虏襟E進行： 確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。 建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。 通過文獻調(diào)研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學性質(zhì)。 生物材料的破碎和預處理。 分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。 生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管

3、電泳都是一個峰。 產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。 分析測定的方法主要有兩類：即生物學和物理、化學的測定方法。生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。 要了解的生物大分子的物理、化學性質(zhì)主要有： 在水和各種有機溶劑中的溶解性。 在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。 固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。 各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電

4、的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。 其他化學性質(zhì)：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。 對其他生物分子的特殊親和力。 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面： 利用混合物中幾個組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉淀、層析和結晶等； 將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。

5、 目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。 2.2 生物大分子制備的前處理生物大分子制備的前處理2.2.1 生物材料的選擇生物材料的選擇 制備生物大分子，首先要選擇適當?shù)纳锊牧?。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在細胞?nèi)，則要先破碎細胞。 植物要先去殼、除脂。 微生物材料要及時將菌體與發(fā)酵液分開。 生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。 2.2.2 細胞的破碎細胞

6、的破碎 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。(1)機械法：1) 研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C將組織打碎，然后再用10000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。 (2)物理法：1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復凍融多次，

7、由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。 (3)化學與生物化學方法：1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认?，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等

8、）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解。 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。 2.2.3 生物大分子的提取生物大分子的提取 “提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預處理或破碎的細胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分

9、地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。 影響提取的因素主要有： 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??； 由固相擴散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時間等。通常： 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。 水溶液提?。?蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是： 1) 鹽濃

10、度（即離子強度）：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結果。為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。 2) pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與p

11、H值有關。過酸、過堿均應盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在05的低溫操作。 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。因為一般蛋白質(zhì)都含有相當數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧

12、化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。 有機溶劑提取 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。 例如，胰島素。 2.3 生物大分子的分離純化生物大分子

13、的分離純化 由于生物體的組成成分是如此復雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。 為了避免盲目性，節(jié)省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經(jīng)驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術有： 沉淀法（包括：鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉淀法為主。2.3.1 沉淀法沉淀法 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。沉淀法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備

14、過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。 其基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學性質(zhì)及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強度和極性都會使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。 有機溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。 選擇

15、性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。 等電點沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。 有機聚合物沉淀： 是發(fā)展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉淀劑。2.3.1.1 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法） 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質(zhì)領域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是： 成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡

16、單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因為該分子的COOH、NH2和OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1nm100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。鹽析示意圖如下頁“圖

17、4”所示。 中性鹽的選擇 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點： 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進行。由下表可以看到， 硫銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類： 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨 鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，

18、純 度提高了四倍。 3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結構的 作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的 （NH4）2SO4保存可達數(shù)年之久。 4) 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。 鹽析的操作方法 最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀完全后再離心與過濾。 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。 鹽析曲線的制作 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒有文獻數(shù)據(jù)可以借鑒，

19、則應先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)： 蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽和度 鹽析的影響因素1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是，相當于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。3) 溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純

20、水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力喪失。 2.3.1.2 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 基本原理 有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。 有

21、機溶劑沉淀法的優(yōu)點是： 分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。 有機溶劑的選擇和濃度的計算 用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。 有機溶劑沉淀的影響因素 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別

22、敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應，因此必須預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。 一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大。 通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。 3) pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積

23、為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。2.3.1.3 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。 熱變性 利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。 表面活性劑和有機溶劑變

24、性使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進行。 選擇性酸堿變性 利用對pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。2.3.1.4 等電點沉淀法等電點沉淀法 利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進行初步的沉淀分離。 由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和

25、分離效果。 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。2.3.1.5 有機聚合物沉淀法有機聚合物沉淀法 有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應用最多的是 “聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的 PEG。 本方法的優(yōu)點是：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，使

26、用很少量的P“EG即可以沉淀相當多 的生物大分子。沉淀后有機聚合物容易去除。2.3.2 透析透析 自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術。 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常為1萬左右。 用1 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 檢查NaCl、KCl等。 超濾超濾 超過濾即超濾，自2

27、0年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。 超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。 微孔過濾所用的操作壓通常小于4104Pa，膜的平均孔徑為500埃14微米（1微米104埃），用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。 超濾所

28、用操作壓為4104Pa7105Pa，膜的平均孔徑為10100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35105Pa140105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。 超濾技術的優(yōu)點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。 在生物大分子的制備技術中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。對于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1050的濃度。 超濾

29、技術的關鍵是膜。 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 114都是穩(wěn)定的，且能在90下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，能連續(xù)用12年。 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2h)）；截留率（以百分率表示）；化學物理穩(wěn)定性（包括機械強度）等。 超濾裝置由若干超濾組件構成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。 由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質(zhì)極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃

30、差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強湍流和加強攪拌。2.3.4 冰凍干燥冰凍干燥 冰凍干燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一，因為大多數(shù)生物大分子分離純化后的最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好的辦法就是冰凍干燥，因為生物大分子容易失活，通常不能使用加熱蒸發(fā)濃縮的方法。 冰凍干燥是先將生物大分子的水溶液冰凍，然后在低溫和高真空下使冰升華，留下固體干粉。冰凍干燥的原理可用溶劑的三相點相圖來說明，見圖 6 ： 當溫度在三相點O以下，將壓力降至OC線以下，溶劑（通常是水）就可以由固相直接升華為汽相。mmHg， mmHg。 1克0的冰變成0的蒸汽需吸熱580千卡，容器外壁上會掛霜。突

31、出的優(yōu)點：樣品不起泡，不暴沸。得到的干粉樣品不粘壁，易取出。冰干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。 樣品溶液： 樣品要溶于水，不含有機溶劑，否則冰點降低，樣品易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。 樣品要予先脫鹽，否則冰凍后易融化。 樣品緩沖液在冰凍時pH可能會有較大變化需加入pH穩(wěn)定劑，如糖類和鈣離子等。 樣品溶液的濃度不要過稀，例如蛋白質(zhì)的濃度不低于15 mg/mL 為宜。 裝樣品溶液的容器： 用各種尺寸的培養(yǎng)皿盛樣品溶液，液層不要太厚，可以使用安瓿并和青霉素小并。用燒杯時液層厚度不要超過2 cm。 凍干稀溶液時會得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔的薄

32、膜或吸水紙包住杯口，刺的孔不要過小過少，否則會影響凍干速度。 溶液冰凍： 可用干冰乙醇低溫浴速凍，邊凍邊旋轉(zhuǎn)形成很薄的冰凍層，可以大大加快凍干的速度。 凍干： 樣品全部凍干前，不要輕易搖動，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。 若外霜消失，則說明樣品已凍干，或是僅剩樣品中心的小冰塊，再稍加延長凍干時間即可。 凍干后要及時取出樣品，以免樣品在室溫下仃留時間過長而失活。 仃真空泵時要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。 樣品凍干后要及時密封冷藏，以防受潮。 真空泵要經(jīng)常檢查油面和油色，油面過低和油色發(fā)黑，則需換油。2.3.5 樣品的保存樣品的保存 生物大分子制成品的正確保存極為重要

33、，一旦保存不當，辛辛苦苦制成的樣品失活、變性、變質(zhì)，使前面的全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。 影響生物大分子樣品保存的主要因素有： 空氣：空氣空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化。 溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10，氧化反應約加快數(shù)倍，酶促反應增加13倍。 水份：樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。 光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，影響最大，樣品受光催化的反應有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。 樣品的pH：保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定的pH范圍，正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度十分重要。 時間：生化和分子生物學樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理?，F(xiàn)以保存蛋白質(zhì)和酶為例： 低溫下保存：通常要保存于520，70保存最理想。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時煮沸；胰蛋白酶